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专利名称：肺炎链球菌6b型、18c型、19f型、23f型多糖结合物中游离多糖含量的测定方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种肺炎链球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法。
背景技术：
肺炎链球菌是诱发细菌性肺炎、脑膜炎、胸膜炎、心内膜炎、中耳炎的重要病原菌，是发展中国家儿童细菌性肺炎最常见的病因。全球每年死于肺炎球菌感染者有100-200万。中国肺炎发病率一直很高，近50年来，肺炎球菌感染者中菌血症死亡率一直徘徊在25-29％之间。此外肺炎也是导致60岁以上老人死亡的主要原因之一。由于肺炎链球菌耐药菌株高达96％以上，目前已成为世界性的公共问题。
1983年美国成功研制出23价多糖疫苗，但该疫苗在2岁以下婴幼儿中诱导的保护性低，无免疫记忆反应。以化学方法将蛋白载体共价结合到肺炎链球菌多糖上，制备成肺炎链球菌多糖结合疫苗，将多糖由T细胞非依赖性抗原转变为T细胞依赖性抗原。接种多糖-蛋白结合疫苗后，可使2岁以下婴幼儿产生有效的免疫应答，从而获得免疫保护。初步的临床试验结果表明，肺炎链球菌多糖结合疫苗在婴幼儿中的安全性和免疫原性良好，诱导产生的抗多糖抗体高于多糖疫苗，并可诱导免疫记忆反应，所以肺炎链球菌多糖结合疫苗的研制具有重要的社会意义和价值。
多糖结合疫苗中的游离多糖含量超过规定的限度会对疫苗临床使用的效果产生不利的影响，因此多糖蛋白结合物中游离多糖含量测定是多糖结合疫苗质量控制中的关键指标之一，也是反映结合疫苗质量的优劣的主要指标之一。
因为不同细菌多糖以及不同多糖结合物性质差异较大，所以多糖结合疫苗中的游离多糖测定是一个技术难点，目前尚无多糖结合物中游离多糖含量测定的通用方法。国外文献报道采用高效液相色谱法进行细菌多糖结合物中游离多糖测定，一种采用高效凝胶过滤，一种采用高效阴离子交换色谱。高效凝胶过滤法基于分子大小差异来区分结合多糖与游离多糖，易受到分子大小相近杂质的影响，测定结果误差较大；高效阴离子交换色谱基于分子带电荷性质的差异而区分结合多糖与游离多糖，也易受到与多糖带电荷性质相似的杂质的影响，此外肺炎链球菌多糖在紫外区域没有强的光吸收，无法在配置紫外检测器的高效液相系统上测定肺炎链球菌多糖结合物的游离多糖含量。目前尚无采用乙醇沉淀法和磷含量测定法测定肺炎链球菌6B型、18C型、19F型、23F型多糖结合物中游离多糖含量的报道。

发明内容
本发明的方法克服了现有方法无法准确测定肺炎链球菌多糖结合物游离多糖含量的不足，该方法可以准确、简单地测定肺炎链球菌6B型、18C型、19F型、23F型多糖结合物中游离多糖的含量。
本发明的技术方案及步骤(1)取所检肺炎链球菌多糖结合物3ml为样1；取所检肺炎链球菌多糖结合物对应衍生物溶液3ml为样4；(2)另取3ml所检肺炎链球菌多糖结合物置于50ml离心管；取3ml所检肺炎链球菌多糖结合物对应衍生物溶液置于另一50ml离心管；向每离心管中加入5mol/L氯化钠0.75毫升，振荡混匀，再加入无水乙醇15ml，振荡混匀，置于-20℃静置70-90小时；于5℃、4500～6500rpm离心60～90分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样2，对应衍生物上清液为样5；(3)于上述每离心管中加入0.5ml 0～60％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时，再加入1.5ml相同乙醇溶液，振荡混合，室温静置2小时，于15℃、4500～6500rpm离心40～60分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样3，对应衍生物上清液为样6；(4)以生理盐水作对照，用磷测定法测定样1、样2、样3、样4、样5、样6的磷含量，分别为p1、p2、p3、p4、p5、p6；(5)根据公式计算回收率P回收率应为80-120％；(6)根据公式计算游离多糖含量H
H=p2+p3p1÷P×100%,]]>式中P为回收率。
本发明的有益效果是利用肺炎链球菌多糖6B型、18C型、19F型、23F型分子结构中含有磷的特点，以及肺炎链球菌多糖结合物在乙醇、强电解质存在条件下结合多糖与游离多糖的不同沉降特性，将游离多糖与结合多糖分离，通过测定磷含量而准确测定出肺炎链球菌6B型、18C型、19F型、23F型多糖结合物中游离多糖的百分含量。本发明提供了一种能准确、简便地测定出肺炎链球菌6B型、18C型、19F型、23F型多糖结合物中游离多糖的含量的测定方法，从而评价制品质量。
具体实施例方式实施例1取肺炎链球菌6B型多糖结合物3ml为样1；取所检肺炎链球菌6B多糖结合物对应衍生物溶液3ml为样4。
另取3ml肺炎链球菌6B多糖结合物置于50ml离心管，取3ml肺炎链球菌6B多糖结合物对应衍生物溶液置于另一50ml离心管。向每离心管中加入5mol/L氯化钠0.75ml，振荡混匀，加入无水乙醇15ml，振荡混匀，置于-20℃静置70小时；于5℃、4500rpm离心60分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样2，衍生物上清液为样5。
于上述每离心管中加入0.5ml 50％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时，再加入1.5ml 50％乙醇溶液，振荡混合，室温静置2小时，于15℃、4500rpm离心40分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样3，衍生物上清液为样6；以生理盐水作对照，用磷测定法测定样1、样2、样3、样4、样5、样6的磷含量，分别为p1、p2、p3、p4、p5、p6；根据公式计算回收率PP=p5+p6p4×100%,]]>回收率应为80-120％；根据公式计算游离多糖含量HH=p2+p3p1÷P×100%,]]>式中P为回收率。
运用本方法测定3批肺炎链球菌6B型多糖结合物样品，结果详见表1
表1 3批肺炎链球菌6B型多糖结合物测定结果

实施例2取肺炎链球菌18C型多糖结合物3ml为样1；取所检肺炎链球菌18C型多糖结合物对应衍生物溶液3ml为样4。
另取3ml肺炎链球菌18C型多糖结合物置于50ml离心管，取3ml所检肺炎链球菌18C型多糖结合物对应衍生物溶液置于另一50ml离心管。向每离心管加入5mol/L氯化钠0.75ml，振荡混匀，加入无水乙醇15ml，振荡混匀，置于-20℃静置90小时；于5℃、6500rpm离心90分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样2，衍生物上清液为样5。
于上述每离心管中加入0.5ml 60％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时，再加入1.5ml 60％乙醇溶液，振荡混合，室温静置2小时，于15℃、6500rpm离心60分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样3，衍生物上清液为样6。
以生理盐水作对照，用磷测定法测定样1、样2、样3、样4、样5、样6的磷含量，分别为p1、p2、p3、p4、p5、p6；根据公式计算回收率PP=p5+p6p4×100%,]]>回收率应为80-120％；根据公式计算游离多糖含量HH=p2+p3p1÷P×100%,]]>式中P为回收率。
运用本方法测定3批肺炎链球菌18C型多糖结合物样品，结果详见表2
表2 3批肺炎链球菌18C型多糖结合物测定结果

实施例3取肺炎链球菌19F型多糖结合物3ml为样1；取所检肺炎链球菌19F型多糖结合物对应衍生物溶液3ml为样4。
另取3ml肺炎链球菌19F型多糖结合物置于50ml离心管，取3ml所检肺炎链球菌19F型多糖结合物对应衍生物溶液置于另一50ml离心管。向每离心管加入5mol/L氯化钠0.75ml，振荡混匀，加入无水乙醇15ml，振荡混匀，置于-20℃静置75小时；于5℃、5000rpm离心70分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样2，衍生物上清液为样5。
于上述每离心管中加入0.5m1 50％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时，再加入1.5ml 50％乙醇溶液，振荡混合，室温静置2小时，于15℃、5000rpm离心50分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样3，衍生物上清液为样6。
以生理盐水作对照，用磷测定法测定样1、样2、样3、样4、样5、样6的磷含量，分别为p1、p2、p3、p4、p5、p6。
根据公式计算回收率PP=p5+p6p4×100%,]]>回收率应为80-120％；根据公式计算游离多糖含量HH=p2+p3p1÷P×100%,]]>式中P为回收率。
运用本方法测定3批肺炎链球菌19F型多糖结合物样品，结果详见表3
表3 3批肺炎链球菌19F型多糖结合物测定结果

实施例4取肺炎链球菌23F型多糖结合物3ml为样1；取所检肺炎链球菌23F型多糖结合物对应衍生物溶液3ml为样4。
另取3ml肺炎链球菌23F型多糖结合物置于50ml离心管，取3ml所检肺炎链球菌23F型多糖结合物对应衍生物溶液置于另一50ml离心管。向每离心管加入5mol/L氯化钠0.75ml，振荡混匀，加入无水乙醇15ml，振荡混匀，置于-20℃静置80小时；于5℃、5500rpm离心80分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样2，衍生物上清液为样5。
于上述每离心管中加入0.5ml注射用水(即含乙醇0％)，振荡混合，室温静置1小时，再加入1.5ml注射用水，振荡混合，室温静置2小时，于15℃、5500rpm离心50分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样3，衍生物上清液为样6。
以生理盐水作对照，用磷测定法测定样1、样2、样3、样4、样5、样6的磷含量，分别为p1、p2、p3、p4、p5、p6。
根据公式计算回收率PP=p5+p6p4×100%,]]>回收率应为80-120％；根据公式计算游离多糖含量HH=p2+p3p1÷P×100%,]]>式中P为回收率。
运用本方法测定3批肺炎链球菌23F型多糖结合物样品，结果详见表4
表4 3批肺炎链球菌23F型多糖结合物测定结果

权利要求
1.肺炎链球菌6B型、18C型、19F型、23F型多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，其步骤是(1)取所检肺炎链球菌多糖结合物3ml为样1；取所检肺炎链球菌多糖结合物对应衍生物溶液3ml为样4；(2)另取3ml所检肺炎链球菌多糖结合物置于50ml离心管；取3ml所检肺炎链球菌多糖结合物对应衍生物溶液置于另一50ml离心管；向每离心管中加入5mol/L氯化钠0.75毫升，振荡混匀，再加入无水乙醇15ml，振荡混匀，置于-20℃静置70-90小时；于5℃、4500～6500rpm离心60～90分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样2，对应衍生物上清液为样5；(3)于上述每离心管中加入0.5ml 0～60％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时，再加入1.5ml相同乙醇溶液，振荡混合，室温静置2小时，于15℃、4500～6500rpm离心40～60分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样3，对应衍生物上清液为样6；(4)以生理盐水作对照，用磷测定法测定样1、样2、样3、样4、样5、样6的磷含量，分别为p1、p2、p3、p4、p5、p6；(5)根据公式计算回收率PP=p5+p6p4×100%]]>，回收率应为80-120％；(6)根据公式计算游离多糖含量HH=p2+p3p1÷P×100%]]>，式中P为回收率。
全文摘要
本发明肺炎链球菌6B型、18C型、19F型、23F型多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，属于生物技术领域，其步骤为取肺炎链球菌多糖结合物为样1，另取等量肺炎链球菌多糖结合物，加入无水乙醇和氯化钠，置－20℃70～90h，离心收集上清液为样2；用适当溶剂充分洗涤沉淀，离心收集上清液，为样3；通过测定样1、样2、样3的磷含量，按公式计算肺炎链球菌多糖结合物中的游离多糖含量。本发明能准确、简便地测定出肺炎链球菌6B型、18C型、19F型、23F型多糖结合物中游离多糖的含量，从而评价制品质量。
文档编号G01N1/34GK1971275SQ200610048879
公开日2007年5月30日 申请日期2006年12月6日 优先权日2006年12月6日
发明者黄镇, 吴凯 申请人:云南沃森生物技术有限公司