专利名称：采用强度调制激光的荧光检测装置和荧光检测方法
技术领域：
本发明涉及一种采用强度调制激光的荧光检测装置和荧光检测方法，其中，朝向 测量对象物照射进行强度调制的激光的同时，接收测量对象物通过照射发出荧光的荧光信 号，并对该信号进行信号处理。例如，涉及适用于医疗、生物领域的流式细胞仪等分析装置 的荧光检测装置和荧光检测方法，该分析装置利用荧光色素所发出的荧光对以蛋白为代表 的细胞、DNA和RNA等测量对象物进行识别，由此在短时间内进行测量对象物的分析等。
背景技术：
应用于医疗、生物领域的流式细胞仪中内置有一种荧光检测装置，该荧光检测装 置接收测量对象物的荧光色素通过激光照射而发出的荧光，由此识别出测量对象物的种 类。特别是在医疗领域，盛行对蛋白之间的生物结合等相互作用的研究。特别是，盛行采用 萤光共振能量转移(FRET)的计测方法对蛋白之间的相互作用进行的研究。以往，通过改变 荧光强度进行FRET的测量，但近年来，公开有各种利用荧光弛豫时间(荧光寿命)的变化 进行测量对象物分析的流式细胞仪。一般来说，流式细胞仪中，采用荧光色素(荧光试剂)使含有以蛋白为代表的细 胞、DNA、RNA、酶的活体物质等的测量对象物的混浊液标签化，然后施加压力以使鞘液以每 秒IOm以下的速度在管道内流动，且使含有被荧光色素标签化的测量对象物的混浊液流动 于该鞘液中，由此形成测量对象物的流动。通过该流动中的测量对象物被激光照射，流式细 胞仪接收附着在测量对象物上的荧光色素所发出的荧光，并将该荧光作为标签进行识别， 由此特定测量对象物。该流式细胞仪例如能够测量出细胞内的DNA、RNA、酶、蛋白等测量对象物在细胞内 的相对量，且在短时间能够对这些测量对象物的作用进行分析。另外，使用通过荧光对特定 类型的细胞或染色体进行特定、并仅对特定的细胞或染色体以活着的状态下在短时间内进 行分选收集的细胞分类器等。在上述仪器的使用中，要求在短时间内根据荧光信息对更多的测量对象物进行正 确地特定。下述专利文献1中记载有根据荧光寿命(荧光弛豫时间)对采用不同荧光色素进 行标签的每个粒子或细胞进行识别的识别装置和识别方法。该文献中，通过来自调制器的调制信号进行强度调制的激光从光源射出，并朝向 流动腔内的照射口照射，并照射在一个个的粒子或细胞上。粒子或细胞所发出的荧光在光 检测器变成荧光信号后被输送到两个混频器。另一方面，调制器的调制信号通过可变移相器被输送到两个混频器。此时，在一个 混频器，通过使信号的相位发生90度位移的90度移相器，供给相位发生90度位移的调制 信号，而在另一个混频器，相位没有发生位移的调制信号按照原样进行供给。由此，输送到各混频器的荧光信号和调制信号混合在一起，并通过低通滤波器可 以得到作为荧光信号相位信息的实数部成分和虚数部成分。根据该实数部成分和虚数部成分之间的比可计算出荧光寿命。由此，装置形成为根据荧光寿命能够识别出每个粒子或细胞的构成。除此之外，在专利文献2和专利文献3中也记载有利用荧光的相位滞后求出荧光 寿命用以识别粒子或细胞的流式细胞仪。专利文献1 :US专利5504337号公报专利文献2 =US专利5270548号公报专利文献3 =US专利5317162号公报然而，在上述专利文献1 专利文献3所记载的流式细胞仪中，为了求出荧光信号 的相位，荧光信号和调制信号在混频器内被混合。在此使用的荧光信号是照射利用调制信 号进行强度调制的激光后所发出的荧光信号。另外，混频器中，作为参照信号分开使用调制 信号。因此，当调制信号中含有噪音成分时，载有与在混频器进行混合的荧光信号和参照信 号同步的噪音成分，因此作为荧光相位滞后信息的实数部成分和虚数部成分中噪音成分作 为信号也被含有。由此存在下述问题通过实数部成分和虚数部成分之比计算出的荧光寿 命受到上述噪音成分的影响而使精度下降。
发明内容
因此，本发明为了解决上述问题，其目的在于提供一种荧光检测装置和荧光检测 方法，其中，在朝向测量对象照射以规定频率进行强度调制的激光并接收该测量对象物发 出的荧光并对此时所得到的荧光信号进行信号处理并对其进行荧光检测时，与以往相比， 能够高精度地计算出荧光弛豫时间(荧光寿命)。本发明的一个实施方式的荧光检测装置，通过朝向测量对象照射激光以接收该测 量对象物所发出的荧光，并从接收所述荧光而得到的荧光信号求出荧光弛豫时间，所述荧 光检测装置包括激光光源部，发射出已进行强度调制的激光用以照射测量对象物；受光 部，输出测量对象物被强度调制的激光照射后所发出的荧光的荧光信号；信号生成部，为了 对从所述激光光源部射出的激光进行强度调制生成具有规定频率的调制信号，而且，还生 成与所述调制信号不同的、具有与所述调制信号的频率相同或大致相同的频率且与所述调 制信号同步的参照信号；信号处理部，将利用所述调制信号进行强度调制的激光照射在测 量对象物上，由此对所述受光部输出的荧光信号与所述参照信号进行第一混合处理，且进 行相对于通过所述第一混合处理而得到的混合信号除去具有所述调制信号频率和所述参 照信号频率的合计频率的信号成分的第一低通滤波处理，由此输出荧光信号基准的低频信 号；荧光检测部，利用所述荧光信号基准的低频信号，计算出相对于所述调制信号的所述荧 光信号的相位，并根据所算出的所述相位求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间。此时，所述信号生成部可以包括第一振荡器，生成时钟信号；第二振荡器，与所 述第一振荡器生成的所述时钟信号同步而生成所述调制信号；第三振荡器，使所述参照信 号与所述时钟信号同步而生成。另外，所述受光部，除了接收所述荧光的受光元件以外，还具有接收通过所述激光 而产生的测量对象物的侧向散射光的受光元件，并输出通过接收所述侧向散射光而得到的 受光信号；所述信号处理部，除了对所述荧光信号进行所述第一混合处理和所述第一低通 滤波处理以外，还对所述受光信号和所述参照信号进行第二混合处理，而且进行相对于通过所述第二混合处理而得到的混合信号除去具有所述合计频率的信号成分的第二低通滤 波处理，以输出受光信号基准的低频信号；所述荧光检测部，利用所述受光信号基准的低频 信号求出相对于所述调制信号的所述受光信号的相位，并从所述荧光信号的相位中减去所 述受光信号的相位，由此对所述荧光信号的相位进行校正，且利用该校正的所述相位求出 测量对象物的荧光的荧光弛豫时间。另外，所述受光部，除了接收所述荧光的受光元件以外，还具有接收通过所述激光 而产生的测量对象物的侧向散射光的受光元件，并输出通过接收所述侧向散射光而得到的 受光信号；所述信号处理部，除了对所述荧光信号进行所述第一混合处理和所述第一低通 滤波处理以外，还对所述受光信号和所述参照信号进行第二混合处理，并进行相对于通过 所述第二混合处理而得到的混合信号除去具有所述合计频率的信号成分的第二低通滤波 处理，以输出受光信号基准的低频信号；所述荧光检测部，当所述调制信号和所述参照信号 之间存在差分频率时，对所述荧光信号基准的低频信号和所述受光信号基准的低频信号实 施第三混合处理，并根据所述第三混合处理后的混合信号计算出所述荧光信号被校正的相 位，利用所述被校正的相位求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间。另外，优选在所述受光部中，于接收所述侧向散射光的受光面的前面设置用来调 整光量的减光镜或节流板。本发明的一个实施方式的荧光检测方法，通过朝向测量对象照射激光以接收该测 量对象物所发出的荧光，并从通过接收所述荧光而得到的荧光信号求出荧光弛豫时间，所 述荧光检测方法包括下述工序朝向测量对象物照射以规定频率的调制信号进行强度调制的激光；通过检测装置接收测量对象物被所述激光照射后所发出的荧光，并获得通过接收 该荧光而得到的荧光信号；生成与所述调制信号不同的、具有与所述调制信号的频率相同或大致相同的频率 且与所述调制信号同步的参照信号；相对于通过朝向测量对象物照射进行强度调制的激光而在所述检测装置中得到 的荧光信号，利用所述参照信号进行第一混合处理，进而进行在所述第一混合处理后的混 合信号中除去具有所述调制信号频率和所述参照信号频率的合计频率的信号成分第一低 通滤波处理，由此生成频率低于所述调制信号的、荧光信号基准的低频信号；利用所述荧光信号基准的低频信号，计算出相对于所述调制信号的所述荧光信号 的相位，并从计算出的所述相位求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间。接收所述荧光时，除了接收所述荧光之外，还接收通过所述激光而产生的测量对 象物的侧向散射光，且输出通过接收所述侧向散射光而得到的受光信号；对所述受光信号 进行利用所述参照信号的第二混合处理以及相对于通过所述第二混合处理得到的混合信 号除去具有所述合计频率的信号成分以输出受光信号基准的低频信号的第二低通滤波处 理，利用所述受光信号基准的低频信号求出相对于所述调制信号的所述受光信号的相位， 然后从所述荧光信号基准的低频信号的相位减去所述受光信号的相位，由此对所述荧光信 号的相位进行校正并利用该校正后的所述相位求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间。另外，接收所述荧光时，除了接收所述荧光之外，还接收通过所述激光而产生的测 量对象物的侧向散射光，且输出通过接收所述侧向散射光而得到的受光信号，对所述受光信号进行利用所述参照信号的第二混合处理和相对于通过所述第二混合处理而得到的混 合信号除去具有所述合计频率的信号成分并输出荧光信号基准的低频信号的第二低通滤 波处理，并对所述荧光信号基准的低频信号和所述受光信号基准的低频信号进行第三混合 处理，然后根据所述第三混合处理后的混合信号计算出所述荧光信号的相位，且利用计算 出的所述相位求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间。本发明的荧光检测装置和荧光检测方法的一个实施方式中，分别生成对用来照射 测量对象物的激光进行强度调制的调制信号和用于混合处理的参照信号。因此，用于混合 处理的荧光信号和参照信号中含有与其同步的噪音成分的情况极少。因此，利用通过混合 处理而得到的信号所计算出的荧光弛豫时间与以往的方式相比精度高。另外，在荧光检测装置和荧光检测方法的一个实施方式中，使用通过接收侧向散 射光而得到的受光信号相位，对荧光信号的相位进行校正。因此，能够排除因荧光信号和荧 光信号的传送时间不同而引起的相位偏移情况，且能够计算出高精度的荧光弛豫时间。另外，在荧光检测装置中，即使将调制信号的频率和参照信号的频率设定成相同， 在根据使用条件而频率不完全一致的情况下，在荧光信号基准的低频信号中，在非DC成分 的、以调制信号的频率和参照信号的频率之间的差分频率为主要频率的AC成分中包括荧 光相位滞后信息。考虑到这种情况，在荧光检测装置和荧光检测方法的一个方式中，通过对 荧光信号基准的低频信号和受光信号基准的低频信号实施混合处理(利用硬件结构的处 理或利用软件处理)，由此能够求出荧光信号的相位。此时，在所述混合处理中，相对于受光信号基准的低频信号，能够计算出荧光信号 基准的低频信号的相位，因此在荧光检测装置和荧光检测方法的一个方式中，能够排除因 参照信号和荧光信号之间的传送时间的差异而引起的相位偏移情况。
图1为采用本发明中强度调制激光的荧光检测装置的流式细胞仪的概略构成图；图2为对图1所示的流式细胞仪构成进行进一步详细说明的说明图；图3为对图1所示的流式细胞仪的信号处理部的构成进行说明的说明图；图4为对图1所示的流式细胞仪的分析装置中的处理内容进行说明的说明图；图5为对与图4所示的分析装置的处理内容不同的、其他处理内容的例子进行说 明的说明图。附图标记说明10流式细胞仪12 样品20信号处理装置22激光发射部23激光光源部24,26 受光部24b,26a 透镜系统26b1,26b2,26b3 分色镜26ci、26c2、26c3、26c4 带通滤波器
26d减光镜27a、27b、27c、27d 光电转换器28控制和处理部30 管道32回收容器34激光驱动器40信号生成部42信号处理部46、47、48 振荡器52a 52d处理电路54、66、68 放大器56可变放大器58功率分配器60、62 RF 混频器64 90度混合器76、78低通滤波器80分析装置82 AD 转换板84分析装置主体86 FFT处理�？�88振幅计算�？�90相位计算�？�92相位滞后计算模块94被补偿的荧光强度计算�？�96荧光弛豫时间计算�？�98混合处理�？�
具体实施例方式以下，根据优选使用本发明强度调制激光的荧光检测装置的流式细胞仪，进行详 细说明。以下说明中，将通过接收荧光而得到的信号称为荧光信号，将通过激光的侧向散 射光而得到的信号称为受光信号。图1为适用强度调制激光L的荧光检测装置的流式细胞仪10的概略构成图。图2 为对流式细胞仪10的构成进行进一步详细说明的说明图。以下，对流式细胞仪10的构成 进行说明。流式细胞仪10包括信号处理装置20和分析装置80。如果对概略的功能进行说 明，则在信号处理装置20中，使作为测量对象的蛋白等的测量对象物的样品12在流动池中 逐一流动，且朝向测量对象物照射激光。此时，流式细胞仪10对在样品12上用来起到标签 作用而附着的荧光色素所发出的荧光的荧光信号进行检测并对其进行信号处理。分析装置80根据在信号处理装置20中得到的处理结果，对样品12中的测量对象物进行分析。信号处理装置20包括激光射出部22、受光部对、26、控制和处理部28和管道30。 控制和处理部观包括控制部，对来自激光射出部22的激光以规定频率进行强度调制；以 及信号处理部，对来自样品12的荧光信号进行识别。在管道30中，使样品12包括在形成 高速流的鞘液中，并使样品12逐一地流动，以形成流动池。如图1所示，管道30的出口处设置有回收容器32。在流式细胞仪10的构成中也 可以配置用来通过激光L照射在短时间内分离出样品12中的特定细胞等活体物质的细胞 分类器，以将其分离于各自的回收容器。样品12为包括以蛋白为代表的细胞、DNA、RNA、酶的活体物质等的测量对象物，该 样品12通过荧光试剂(荧光色素)预先被标签化，且如图1所示，在混浊液的状态下使用。 对于所准备的样品12，例如其含有不同种类的多个活体物质，且在活体物质中，每一个不同 种类的活体物质上附着有作为荧光色素的、发出不同的已知波长荧光的已知色素。由此，能 够对多个种类的活体物质之间的生物结合等特性进行研究。样品12并不限定于活体物质，例如，也可以是能够与特定活体物质相结合的、设 置人工结构的微球(Micro-beads)。激光射出部22包括激光光源部23和激光驱动器34。激光光源部23是发射规定波长的激光的部分。未图示的透镜系统按照使激光L聚 焦在管道30中的规定位置的方式进行设置，在该聚焦位置上形成有样品12的测量点。激 光L的测量点中射束直径为数十微米。其中，在激光光源部23射出一个波长的激光L，但也 可以是多个激光形成一个激光束后射出的构成。此时，利用半透明反射镜等使激光成为一 个光束。在激光光源部23中，强度恒定的CW(连续波)激光L以规定频率进行强度调制后 射出。作为发射出激光L的光源，例如可以使用半导体激光器。激光L是例如以5 IOOmW的输出功率输出的激光。另一方面，对于使激光L进 行强度调制的频率(调制频率)，其周期与荧光弛豫时间相比稍长，例如10 50MHz。激光驱动器34按照与控制和处理部观相连接且能够控制激光L的发射强度的方 式构成。在此，如后述，各激光L的强度通过调制信号以规定频率进行调制。激光光源部23在预先规定好的波段进行振荡，以使激光L通过激发荧光色素使其 发射出特定波长区域的荧光。被激光L激发的荧光色素附着在活体物质等的样品12上，当 样品12作为测量对象物通过管道30时，在测量点受到激光L的照射后以特定的波长发射 荧光。受光部M按照夹着管道30与激光光源部22相对而置的方式进行配置。受光部 24包括光电转换器Ma，通过测量点的样品12使激光L发生前向散射，由此输出样品12 通过测量点时的检测信号；聚光透镜Mb以及遮蔽板Mc。遮蔽板2 用来遮蔽激光L，以 使光电转换器2 不直接接收激光L，而是接收前向散射光。输出自该受光部M的信号作为触发信号来使用，该触发信号成为后述分析装置 80中AD转换板82的开始进行AD转换和分析装置主体84开始进行分析的定时器。另一方面，受光部沈位于通过测量点并垂直于发射自激光光源部23的激光发射方向的平面与通过测量点并垂直于管道30中的样品12的移动方向的平面的交线上。受光 部沈包括光电转换器，以用来接收样品12在测量点被照射后所发出的荧光和激光的侧向 散射光。图2表示受光部沈的一例的概略构成。受光部沈包括对来自样品12的荧光信号进行聚焦的透镜系统^a、分色镜^bp ^32、^33、带通滤波器^31、^32、^33、^:4、光量调整滤波器26(1和光电倍增管等的光电转 换器27a 27d。透镜系统26a按照将入射到受光部沈的荧光聚焦在光电转换器27a 27d的受 光面的方式构成。分色镜^b1Jeb2Jeb3是对规定范围波段的荧光进行反射而对其它荧光进行透射 的分色镜。根据样品12发射的各荧光波长设定反射波段或透射波段，以使分色镜^b1Jeiv ^b3和带通滤波器^C1、26C2、26C3J6C4能够透射规定波段的荧光。分色镜^lD2是对激光的 侧向散射光的波长区域光进行反射，而对含有荧光波长的波长区域光进行透射的分色镜。带通滤波器^c1、26c2,26c3>26c4被分别设置在光电转换器27a、27b、27c、27d的前 面，仅使具有规定波段的荧光透射的滤波器。分色镜26 是设置在光电转换器27a、27d的 受光面的前面，光电转换器27a接收来自分色镜的透射光，光电转换器27d接收来自 分色镜的反射光。透射的荧光波段被设定成与荧光色素所发出的荧光波段相对应的方式。光量调整滤波器26d是用来调整侧向散射光光量的减光镜。也可以使用代替减光 镜的节流板。使用光量调整滤光器26d，以使侧向散射光的受光信号水平与荧光信号水平 大致一致，由此使激光L的受光信号相位可作为代替因光的传播或信号传送而产生的相位 滞后来使用。该激光L的受光信号相位是指，激光L的受光信号相对于调制信号的相位滞 后。激光L的受光信号相位是因激光L的传播时间或受光信号的传送时间等而产生的相位 滞后，而相对于荧光信号的调制信号是在因传播时间或传送时间等而产生的传送滞后加上 产生荧光所需时间后的相位。此时，受光信号的相位根据侧向散射光的受光信号水平而发 生变化，因此为了使受光信号相位与因荧光信号的传播时间或传送时间而产生的传送滞后 大致相一致，通过光量调整滤光器26d调整受光信号的水平，由此使受光的侧向散射光水 平与荧光信号水平大致相一致。光电转换器27a 27d包括如具有光电倍增管的传感器，该传感器是在作为受光 面的光电面上将接收到的光转换成电信号的传感器。光电转换器27a 27c中，光的波长 区域受到分色镜和带通滤波器的限制，接收具有规定波长的荧光。光电转换器27d接收光 的波长区域受到分色镜的限制，因此光电转换器27d能够接收激光L的侧向散射光。 由此，受光部沈在接收具有三个不同波长的荧光的同时，接收激光L的侧向散射光。在此，对于所接收的荧光和侧向散射光，由于其作为具有以恒定频率进行强度调 制的信号信息的光信号来接收，因此光电转换器27a 27d所输出的信号成为具有与进行 强度调制的激光L相对应的频率的荧光信号和受光信号。该荧光信号和受光信号被供给到 控制和处理部28。控制和处理部28的构成包括信号生成部40、信号处理部42。
信号生成部40是除了生成以规定频率对激光强度进行调制(强度调制)的调制 信号以外，生成参照信号的部分。具体来说，信号生成部40包括振荡器(第一振荡器)46、振荡器(第二振荡器)47 和振荡器(第三振荡器)48。这些振荡器也可以是根据不同电路构成的振荡器。振荡器46是生成具有规定频率的时钟信号的时钟生成器。振荡器47生成用于调制激光L强度的调制信号。所生成的调制信号通过未图示 的滤波器形成单一频率成分，并通过放大器供给到激光驱动器34。在激光驱动器34中，与 另准备的直流电流重叠后被供给到激光光源部23.如后述，振荡器48生成用于求出荧光弛豫时间的参照信号。在振荡器48所生成 的参照信号的频率与在振荡器47所生成的调制信号的频率相同或大致相同，且参照信号 与调制信号成为相互同步的信号。相互同步是指，在信号开始生成的时刻，能够生成相同相 位的信号，相互相位成为0的时刻会周期性地存在。振荡器47和振荡器48中，信号的生成 以与振荡器46所生成的时钟信号同步的方式进行。因此，调制信号和参照信号能够以相互 同步的方式生成。另外，频率大致相同是指，相对于调制信号频率，参照信号频率处于被设定的允许 误差范围内。在此，允许误差范围是指，例如，参照信号频率相对于调制信号频率发生偏移 的差分频率Δ f是调制信号频率的1%以内。振荡器46、47、48被收纳在遮蔽电磁波的独立的箱体。即，振荡器46、47、48被设 置在独立的电磁环境。由于将振荡器47、48设置在独立的电磁环境，因此在流式细胞仪10 中，能够减少在分别生成的信号中因电磁波而产生的噪音成分在相同时刻共同被含有的可 能性，如后述，能够高精度地求出荧光弛豫时间。对于调制信号和参照信号的频率，即使设定成相同的频率，但根据振荡器个体之 间的误差或温度等的使用条件，特性也有微妙的不同，因此很难使频率达到一致。因此，如 后述，考虑到频率不一致的情况，在分析装置主体84中可以对上述情况进行处理。信号生成部40中，使用代替振荡器47和振荡器48的、包括相位比较器、环路滤波 器、压控振荡器和分频器的锁相环电路(PLL电路，Phase Locked Loop)，也可以同步生成调 制信号和参照信号。由此，利用不同的振荡器分别生成调制信号和参照信号的理由在于，通过一个振 荡器生成调制信号和参照信号的情况相比，在后述的RF混频器混合调制信号和参照信号 而得到的混合信号中来自振荡器的噪音成分的影响会变小。调制信号和参照信号由于采用 各自的振荡器而生成，因此与调制信号和参照信号同步的噪音成分极少存在于作为混合处 理对象的调制信号和参照信号中。而且，振荡器46、47、48由于被收纳在用来遮蔽电磁波的 独立的箱体，因此信号中难以含有噪音成分。信号处理部42为利用光电转换器27a 27d所输出的荧光信号和侧向散射光的 受光信号提取与样品12被激光照射后发出的荧光相位相关的信息的部分。具体来说，包 括信号处理通道1、2、3，分别对来自光电转换器27a 27c的荧光信号进行处理；信号处 理通道4，对来自光电转换器27d的受光信号进行处理。信号处理通道1 4的信号处理内 容相同。另外，与上述相位相关的信息是指，例如，用复数表示正弦波信号相位时的实数部成分(Re成分)和虚数部成分am成分)。信号处理部42的信号处理通道1包括处理电路52a。信号处理通道2 4包括处 理电路52b 52d。图3为表示处理电路52a、52b、52c、52d内容的构成图。处理电路52a、52b、52c、52d包括放大器M，放大荧光信号(受光信号)；可变放 大器56 ；功率分配器58，对放大的荧光信号(受光信号)进行分配；RF混频器(第一混频 器)60,62 ；90度混合器64 ；放大器66、68 ；以及低通滤波器70、72。其中，也可以使用代替 可变放大器56的可变衰减器。也可以使用代替90度混合器64的移相器。当使用移相器 时，将信号分成两个相同的相位信号，采用使其中一个信号通过90度移相器的构成，或采 用利用开关在90度和0度移相之间进行切换的构成。光电转换器27a 27d所输送的荧光信号(受光信号)在放大器M被放大，而且 在可变放大器56被放大到所需水平(使用可变衰减器时，信号被衰减)。进而，荧光信号 (受光信号)在功率分配器58被分成两个信号后输送到RF混频器60、62。另一方面，振荡器48生成的参照信号被供给到90度混合器64，并生成相位被90 度位移的参照信号和保持该相位的(进行0度位移)参照信号。通过90度混合器64进行 相位90度位移的参照信号被供给到RF混频器62。另一个保持上述相位的参照信号被供给 到RF混频器60。RF混频器60、62分别对被供给的参照信号和荧光信号(受光信号)进行混合处 理。作为RF混频器60、62可以使用有源混频器或者双平衡混频器等无源混频器。在本实施方式中，对参照信号的相位进行90度位移后供给到RF混频器62，但也可 以取代参照信号而对荧光信号(受光信号)的相位进行90度位移。放大器66、68对RF混频器60、62中通过参照信号和荧光信号(受光信号)而制 成的混合信号进行放大。在低通滤波器70、72中，例如设置有低于调制信号频率的截止频率，以从通过混 合处理而得到的混合信号中除去在参照信号的频率上加上荧光信号(受光信号)频率的合 计频率成分的高频成分，以使低频成分通过。由此，从低通滤波器70输出作为荧光信号(受 光信号)的相位信息的实数部成分(Re成分)，从低通滤波器72输出作为荧光信号(受光 信号)的相位信息的虚数部成分am成分)。由此，包括荧光信号(受光信号)相位信息的 Re成分和加成分的信号被输送到分析装置80的AD转换板82。如上所述，调制信号的频率和参照信号的频率形成一致或大致一致的状态。因此 荧光信号(受光信号)的频率和参照信号的频率相一致或大致一致。由此，低通滤波器70、 72所输出的实数部成分(Re成分)和虚数部成分am成分)的信号是具有恒定值或大致恒 定的值的信号。在该信号中含有与相位有关的信息。低通滤波器70、72所输出的实数部成分(Re成分)和虚数部成分( 成分)被输 送到分析装置80。分析装置80包括AD转换板(参照图1)82和分析装置主体(计算机)84，其中， AD转换板将分别输送自信号处理通道1 4的实数部成分(Re成分)和虚数部成分(Lii成 分)转换成数字信号。AD转换板82以输送自受光部M的信号作为触发信号，开始对实数部成分(Re成分)和虚数部成分am成分)进行AD转换。进而，数字化的实数部成分(Re成分)和虚数 部成分am成分)被供给到分析装置主体部84后开始对其进行分析。根据所输送过来的实数部成分(Re成分)和虚数部成分am成分)，分析装置84 求出荧光的相位滞后角度(相对于调制信号的荧光信号的相位角度)θ，进而由该相位滞 后角度θ求出荧光弛豫时间。然后，根据所求出的荧光弛豫时间，可以特定出输出自受光 部26的荧光信号是来自哪个荧光色素的信号的情况。在分析装置主体84中，得知荧光弛豫时间的计算结果是基于哪个信号处理通道 的实数部成分(Re成分)和虚数部成分(Im成分)的结果后，由此能够得知上述荧光弛豫 时间是来自哪个波长的荧光。另外，荧光色素发出的荧光的荧光弛豫时间在每一个荧光色 素上是固定的，因此分析装置主体84得知荧光弛豫时间值和该值是来自哪个信号处理通 道的荧光弛豫时间之后，能够特定出上述信号是哪个荧光色素发出的荧光。而且，由于预 先知道该荧光色素是附着于哪个样品12的荧光色素，因此分析装置主体84通过所特定的 荧光能够知道通过测量点的样品12是哪个种类的样品。由此，当样品12内的不同种类的 活体物质相互进行生物结合时，结合在活体物质的两个荧光色素的荧光基本上同时被检测 出，因此根据荧光弛豫时间特定出荧光的种类，由此能够得知进行生物结合的活体物质种 类。这样的分析是在样品12形成流动状态、且其每一个样品通过测量点的时进行，因此分 析装置80能够对所得到的多个结果进行统计处理，能够对样品12进行综合性分析。在分析装置主体84中形成有在本发明中的计算荧光弛豫时间的荧光检测部，且 由计算机构成。图4为对分析装置主体84内所进行的处理内容的一例进行说明的说明图。在分析装置主体84中，通过AD转换板82使各信号处理通道的实数部成分(Re成 分)和虚数部成分am成分)的数据被数字化后，进行如图4所示的处理。该处理为软件处理。图4所示的处理中，通过辅程序(subprogram)或子程序(subroutine)而被�？� 化。具体来说，设置有振幅计算�？�88、相位计算�？�90、相位滞后计算�？�92、被补偿的 荧光强度计算�？�94和荧光弛豫时间计算�？�96。在4所示的例中，表示有输送自处理电路5 和处理电路52d的荧光实数部成分 (Re成分)和虚数部成分am成分)、以及激光L的侧向散射光的实数部成分(Re成分)和 虚数部成分(Im)的处理内容，但未表示输送自处理电路52b、52c的实数部成分(Re成分) 和虚数部成分(Im成分)的处理内容。输送自处理电路52b、52c的实数部成分(Re成分) 和虚数部成分am成分)的处理内容与来自处理电路5 的实数部成分(Re成分)和虚数 部成分(Im)的处理内容相同，因此没有表示该处理内容，也省略该说明。输送自处理电路52d的涉及到侧向散射光相位的实数部成分(Re成分)和虚数部 成分am成分)、以及荧光的实数部成分(Re成分)和虚数部成分am成分)均为具有恒定 值或大致恒定的值的信号。这些信号被输送至振幅计算�？�88和相位计算�？�90。在振幅计算�？�88中，计算出实数部成分和虚数部成分的二次平方和的平方根， 并将该计算结果作为强度来输出。即，侧向散射光的强度和荧光强度被输出。另外，实数部成分的信号和虚数部成分的信号被输送到相位计算�？�90用以计 算tar^dm/Re)。由此计算出侧向散射光的受光信号的相位和荧光信号的相位。
进而，在相位滞后计算�？�92中，从通过相位计算�？�90求出的荧光信号的相位 中减去通过相位计算模块90所求出的受光信号的相位，由此求出被校正的荧光信号的相 位(荧光相位滞后)。进行上述校正的理由在于，利用受光信号的相位对相位滞后进行校 正，该相位滞后是因与荧光信号传送线路之间的传送时间上的差异、或因激光或荧光的传 播时间而产生的。接下来，在荧光弛豫时间计算�？�96中，利用校正的相位滞后角度θ计算出 tan θ / ω，该计算结果成为荧光弛豫时间τ。在此，ω为2 π f，f表示调制信号的频率。之所以能够将tan θ/ω值作为荧光弛豫时间τ，这是因为荧光弛豫的过程是根 据一次滞后响应发出荧光的缘故。进而，在被补偿的荧光强度计算�？�94中，计算出(1+(τ ω )2) (1/2)，该所计算出的 值与由振幅计算�？�88所计算的荧光振幅相乘，由此计算出通过τ进行补偿的荧光强度。如上所述，在分析装置主体84计算出侧向散射光强度、荧光强度、荧光弛豫时间 τ和通过τ进行补偿的荧光强度，这些计算结果均用于统计处理和分析。当然，分析装置 主体84没有必要计算出所有侧向散射光强度、荧光强度、荧光弛豫时间τ和通过τ进行 校正的荧光强度，并将其全部用于统计处理和分析。分析装置主体84只要至少计算出荧光 弛豫时间τ并将其用于统计处理和分析即可。其中，对于侧向散射光强度，因样品12的结 构不同而使散射强度有较大的不同，因此上述侧向散射光强度能够作为表示样品12的结 构复杂性的指标来使用。流式细胞仪10是通过上述方式构成。流式细胞仪10中，振荡器46生成时钟信号，振荡器47与该振荡器46所生成的时 钟信号同步而生成调制信号，振荡器48与时钟信号同步而生成参照信号。因此，包括于振荡器47的调制信号和振荡器48的参照信号的噪音成分处于独立 状态，因此在RF混频器60、62中，即使荧光信号和参照信号被混合，也不会像以往那样，存 在因包括噪音成分的荧光信号和包括噪音成分的参照信号被相乘而使混合信号含有较大 噪音成分的情况。在这样的流式细胞仪10的信号处理装置20中，首先，与振荡器46所发出的时钟 信号同步而使规定频率的调制信号发生在振荡器47。该信号在激光驱动器34进行规定处 理后被供给到激光光源部23。在激光光源部23，朝向测量点发射出光强度根据调制信号的 频率进行调制的激光L。在测量点上，通过未图示的透镜系统形成数十微米直径的射束。该状态下，样品12在管道30中流动，且形成以横切测量点的方式通过测量点的流 动。该流动例如在100 μ m的流路径上具有1 IOm/秒的流速。朝向测量点照射激光L后，如果在受光部M生成能够检测出样品12的通过的检 测信号，则该检测信号作为触发信号而输出到分析装置80。在振荡器48生成与上述触发信号匹配的、且与振荡器46所生成的时钟信号同步 的参照信号。参照信号的频率与调制信号的频率相同或大致相同。信号处理部42中，利用在光电转换器27a 27d得到且输送来的荧光信号、受光 信号和参照信号，按照图3所示的电路进行混合处理和低通滤波处理。由此生成作为与荧 光和侧向散射光的各信号相位相关的信息的实数部成分(Re成分)和虚数部成分am成 分)。在此，激光调制信号的频率例如为10 50MHz。
所计算出的实数部成分(Re成分)和虚数部成分(Li!成分)被输送到分析装置 80。分析装置80中，对输送来的实数部成分(Re成分)和虚数部成分(Lii成分)的信 号进行AD转换以使其数字化。然后，在分析装置主体84进行图4所示的处理，计算出侧向 散射光强度、荧光强度、荧光弛豫时间τ和通过τ进行补偿的荧光强度。这些计算结果被 用于样品12的统计处理或分析。其中，荧光弛豫时间τ根据以通过侧向散射光而得到的 受光信号的相位为基准而进行校正的荧光信号的相位滞后角度θ，按照tan θ/ω计算出 荧光弛豫时间τ。(变形例)图5为对与图4所示的分析装置主体84进行的处理内容不同的例子进行说明的 说明图。图5所示的处理中，除了具有图4所示功能的振幅计算模块88、相位计算�？�90、 被补偿的荧光强度计算模块94、荧光弛豫时间计算模块96以外，还使用于FFT处理�？�86 和混合处理�？�98。在本变形例中，振荡器47和振荡器48以大致相同的频率生成信号，但 此时的频率根据使用条件等而发生变化，因此也有频率不完全一致的情况。即，有时具有差 分频率Δ ·。在上述情况下适合使用本变形例中的处理。由此，本变形例可以按照下述方式构成调制信号的频率与参照信号的频率在 MHz的单位上大致相同，但不完全一致，当频率发生差异时，由分析装置主体84来判定是否 存在无法忽略的差分频率△ f，并根据该判定结果从图4所示的处理变更为图5所示的处 理。无法忽略的差分频率Δ f是指，被输送到分析装置80的实数部成分(Re成分)和虚数 部成分am成分)的信号，在样品12通过测量点的测量时间范围内不具有大致恒定的值， 该值在上述测量时间范围内发生变化的情况。例如，当样品12通过测量点的时间设为T秒 时，无法忽略的差分频率Af为1/T以上。在图5所示的处理内容中，首先，在FFT处理�？�86处理由信号处理通道4计算 出的受光信号的实数部成分(Re成分)和虚数部成分am成分)，由此求出差分频率Af的 实数部成分值(Re_Af)和虚数部成分值(Im_Af)。利用上述两个值在振幅计算�？�88计 算出侧向散射光的受光信号振幅，该振幅作为侧向散射光强度而被输出。另一方面，在信号处理通道1得到的荧光信号的实数部成分(Re成分)和虚数部 成分am成分)被输送到混合处理�？�98。然后，侧向散射光的实数部成分(Re成分)被 输送到混合处理�？�98。在混合处理�？�98中，荧光信号的实数部成分(Re成分)和虚 数部成分am成分)与侧向散射光的受光信号的实数部成分(Re成分)相混合，进而在未 图示的处理�？槔媒刂蛊德式械屯瞬ù恚渲薪刂蛊德实钠德实陀诘髦菩藕牌德� 和参照信号频率的合计频率且高于差分频率Δ ·，由此求出差分频率Af的实数部成分值 (Re_ Δ f)和虚数部成分值(Im_ Δ f)。例如，将输送到混合处理�？�98的荧光的实数部成分(Re成分)设为 cos {2 JI (frf2)VAt1+τ)}。在此，=调制信号的频率，f2 =参照信号的频率， At1为荧光信号或受光信号相对于参照信号的滞后时间，τ为荧光弛豫时间。此时，侧向散射光的实数部成分(Re成分)为C0S{2ji (frf2) · t+2 π T1 · Δ、}。由此，荧光信号的Re成分通过混合处理�？�98生成混合信号，进而实施上述低通 滤波处理，由此信号COS {2 JIf1* τ}作为Re_ Af而被计算出。同样地，荧光的Lii成分通过混合处理模块98生成混合信号，进而实施上述低通滤波处理，由此信号sin {2 Jif1 . τ }作 为Im_Af而被计算出。由此，这些信号值被输送到振幅计算�？�88和相位计算�？�90，由此计算出荧光 强度和相位滞后角度θ。根据所计算出的相位滞后角度θ进而在荧光弛豫时间计算�？�96计算出tan θ / ω，该计算结果成为荧光弛豫时间τ。在此，ω为2 π f\。之所以将tan θ / ω设为荧光弛 豫时间τ，是因为在荧光的弛豫过程中根据一次弛豫响应发出荧光的缘故。进而，在被补偿的荧光强度计算�？�94中，计算出(1+(τ ω )2) (1/2)，该值与由振幅 计算�？�88计算出的荧光振幅相乘，由此计算出通过τ进行补偿的荧光强度。进而，根据侧向散射光的Re成分和Lii成分所求出的差分频率△ f的实数部成分 的值(Re_Af)和虚数部成分的值(Im_Af)被输送到振幅计算模块88，由此计算出作为侧 向散射光强度的侧向散射光的振幅。由此，在分析装置主体84中，计算出侧向散射光强度、通过τ进行补偿的荧光强 度、荧光强度、荧光弛豫时间τ，这些计算结果适用于样品12的统计处理或分析。综上，对本发明的、采用强度调制激光的荧光检测装置和荧光近侧方法进行了详 细的说明，但本发明并不限定于上述实施方式，在不脱离本发明主题的范围内所进行的各 种改良或改变均包括在本发明中。
权利要求
1.一种荧光检测装置，朝向测量对象照射激光以接收该测量对象物所发出的荧光，并 由接收所述荧光而得到的荧光信号求出荧光弛豫时间，所述荧光检测装置包括激光光源部，发射出强度被调制的激光用以照射测量对象物； 受光部，输出测量对象物被强度调制的激光照射后所发出的荧光的荧光信号； 信号生成部，为了对从所述激光光源部射出的激光进行强度调制而生成具有规定频率 的调制信号，而且，还生成与所述调制信号不同的、具有与所述调制信号的频率相同或大致 相同的频率且与所述调制信号同步的参照信号；信号处理部，将利用所述调制信号进行强度调制的激光照射在测量对象物上，由此对 所述受光部输出的荧光信号与所述参照信号进行第一混合处理，且相对于通过所述第一混 合处理得到的混合信号，进行第一低通滤波处理以除去具有所述调制信号频率和所述参照 信号频率的合计频率的信号，由此输出荧光信号基准的低频信号；荧光检测部，利用所述荧光信号基准的低频信号，计算出相对于所述调制信号的所述 荧光信号的相位，并由算出的所述相位求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间。
2.如权利要求1所述的荧光检测装置，其特征在于，所述信号生成部包括 第一振荡器，生成时钟信号；第二振荡器，与所述第一振荡器生成的所述时钟信号同步而生成所述调制信号； 第三振荡器，使所述参照信号按照与所述时钟信号同步的方式生成。
3.如权利要求1或2所述的荧光检测装置，其特征在于，所述受光部除了接收所述荧光的受光元件以外，还具有接收通过所述激光而产生的测 量对象物的侧向散射光的受光元件，并输出通过接收所述侧向散射光而得到的受光信号；所述信号处理部除了对所述荧光信号进行所述第一混合处理和所述第一低通滤波处 理以外，还对所述受光信号和所述参照信号进行第二混合处理，并相对于通过所述第二混 合处理而得到的混合信号，进行除去具有所述合计频率的信号成分的第二低通滤波处理， 以输出受光信号基准的低频信号；所述荧光检测部利用所述受光信号基准的低频信号求出相对于所述调制信号的所述 受光信号的相位，并从所述荧光信号的相位中减去所述受光信号的相位，由此对所述荧光 信号的相位进行校正，且利用该校正的所述相位求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间。
4.如权利要求1或2所述的荧光检测装置，其特征在于，所述受光部除了接收所述荧光的受光元件以外，还具有接收通过所述激光而产生的测 量对象物的侧向散射光的受光元件，并输出通过接收所述侧向散射光而得到的受光信号；所述信号处理部除了对所述荧光信号进行所述第一混合处理和所述第一低通滤波处 理以外，还对所述受光信号和所述参照信号进行第二混合处理，并相对于通过所述第二混 合处理而得到的混合信号，进行除去具有所述合计频率的信号成分的第二低通滤波处理， 以输出受光信号基准的低频信号；当所述调制信号和所述参照信号之间存在差分频率时，所述荧光检测部对所述荧光信 号基准的低频信号和所述受光信号基准的低频信号实施第三混合处理，并根据所述第三混 合处理后的混合信号计算出所述荧光信号被校正的相位，利用所述校正的相位求出测量对 象物的荧光的荧光弛豫时间。
5.如权利要求3或权利要求4所述的荧光检测装置，其特征在于，在所述受光部中，于接收所述侧向散射光的受光面的前面设置有用来调整光量的减光镜或节流板。
6.一种荧光检测方法，通过朝向测量对象照射激光来接收该测量对象物所发出的荧 光，由接收所述荧光而得到的荧光信号求出荧光弛豫时间，所述荧光检测方法包括下述工 序朝向测量对象物照射以规定频率的调制信号进行强度调制的激光；在检测装置接收测量对象物被所述激光照射后所发出的荧光，并获得因接收该荧光而 得到的荧光信号；生成与所述调制信号不同的、具有与所述调制信号的频率相同或大致相同的频率且与 所述调制信号同步的参照信号；对于通过将强度被调制的激光照射在测量对象物来在所述检测装置得到的荧光信号， 利用所述参照信号进行第一混合处理，而且进行在所述第一混合处理后的混合信号中除去 具有所述调制信号频率和所述参照信号频率的合计频率的信号成分的第一低通滤波处理， 由此生成频率低于所述调制信号的、荧光信号基准的低频信号；利用所述荧光信号基准的低频信号计算出相对于所述调制信号的所述荧光信号的相 位，并从计算出的所述相位求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间。
7.如权利要求6所述的荧光检测方法，其特征在于，接收所述荧光时，除了接收所述荧 光之外，还接收通过所述激光而产生的测量对象物的侧向散射光，且输出通过接收所述侧 向散射光而得到的受光信号；对所述受光信号进行利用所述参照信号的第二混合处理以及第二低通滤波处理，在所 述第二低通滤波处理中，相对于通过所述第二混合处理得到的混合信号除去具有所述合计 频率的信号成分且输出受光信号基准的低频信号，利用所述受光信号基准的低频信号求出相对于所述调制信号的所述受光信号的相位， 然后从所述荧光信号基准的低频信号的相位减去所述受光信号的相位，由此对所述荧光信 号的相位进行校正并利用该校正后的所述相位求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间。
8.如权利要求6所述的荧光检测方法，其特征在于，接收所述荧光时，除了接收所述荧 光之外，还接收通过所述激光而产生的测量对象物的侧向散射光，且输出通过接收所述侧 向散射光而得到的受光信号，对所述受光信号进行利用所述参照信号的第二混合处理以及第二低通滤波处理，在第 二低通滤波处理中，相对于通过所述第二混合处理而得到的混合信号除去具有所述合计频 率的信号成分且输出荧光信号基准的低频信号，对所述荧光信号基准的低频信号和所述受光信号基准的低频信号进行第三混合处理， 并根据所述第三混合处理后的混合信号计算出所述荧光信号的相位，并利用计算出的所述 相位求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间。
全文摘要
一种荧光检测装置和荧光检测方法，在所述荧光检测装置中，朝向测量对象物照射进行强度调制的激光，由此获得测量对象物所发出的荧光的荧光信号。此时，生成与调制信号不同的、与调制信号的频率相同或大致相同且与调制信号的相位同步的参照信号。在荧光检测装置中，利用参照信号与所获得的荧光信号进行混合处理后计算出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间。本发明的荧光检测装置中，根据通过混合处理而得到的混合信号计算出的荧光弛豫时间，与以往的方式相比精度高。
文档编号G01N21/64GK102150035SQ20098013582
公开日2011年8月10日 申请日期2009年9月16日 优先权日2008年9月19日
发明者中田成幸, 土井恭二, 星岛一辉, 林弘能 申请人:三井造船株式会社
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20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
