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专利名称：固定化载体和固相的制作方法
技术领域：
本发明涉及在固相上的抗原抗体反应、在固相上的核酸的杂交、在固相上的受体和配体的反应、在固相上的酶和基质的反应、细胞的固定化等中使用的固定化载体，以及利用该载体的固相。
背景技术：
用于测定在固相上的抗原抗体反应、在固相上的核酸的杂交、在固相上受体和配体的反应、在固相上酶和基质的反应的系统中的固定化用载体多以聚苯乙烯和聚碳酸酯等塑料、纤维素等生物高分子材料、玻璃、陶瓷树脂、金属、导电性塑料等为材质。但为了控制固定化的物质在这些载体上的结合量，首先考虑材质的选择，当在通过选择材质不能解决的情况下，寻求通过等离子体、γ-射线、紫外线或者臭氧对表面改性而使固定化用载体达到最佳化。但是，以往的最佳化方法在改性条件的再现性等方面存在问题，并且，对于微板和胶乳粒子等固相，难于对其表面进行均匀改性。尤其是，只改变受限制的几个条件，为有效结合具有不同性质的多种多样的物质进行最佳表面改性极其困难。为此，对在固相上固定所需物质的条件的研究需要花费大量的劳动力，根据场合的不同，也存在不能完全固定化的情况，因此迫切希望能够自由控制物质的固定化的固定化用载体。
另外，关于上述背景技术，题为“微生物菌体固定化用粒状载体和粒状载体的制造装置”的专利文献(国际公开第WO97/19978号册)公开了微生物菌体固定化用粒状载体，该载体如下形成在含有碱金属离子或者多价金属离子的含水介质中滴加含有(a)在1个分子中具有至少2个烯键式不饱和键的亲水性光固化性树脂、(b)光聚合引发剂和(c)通过与碱金属离子或者多价金属离子接触而具有凝胶化能力的水溶性高分子多糖类的液体组合物，使该组合物凝胶化为粒状，照射活性光线使之固化，比重为1.00～1.20且与表面的正-链烷烃形成的接触角为2°～30°，具有适合于附着微生物的表面。但是，照射该活性光线是为了通过光固化性树脂的光聚合来提高粒状载体的强度(第14页第6至第8行)，在该文献中，对于所得载体的进一步的表面改性没有任何公开。
另外，专利文献(特开2000-65832号公报)涉及避免试样的前处理，能够得到正确的检测结果的过滤器状生物学特异性反应测定用载体以及使用该生物学特异性反应测定用载体的测定方法，并涉及过滤器状生物学特异性反应测定用载体，其特征在于由具有1～100μm的细孔径的过滤器状的有机聚合物构成。该过滤器状有机聚合物可以按照现有技术，进一步在纤维表面进行选自水解、电晕放电、等离子体处理、UV-臭氧处理、涂布碳化二亚胺(结合剂)等活性物质中的至少1种处理方式而得到(第4页第5栏〔0011〕段和〔0015〕段)。
因而，本发明的目的在于提供使性质不同的多种多样的物质能够特异的、有效且再现性良好地被固定的、形成最佳载体表面的固定化用载体，以及提供通过该载体的使用而具有改善的特性的固相。

发明内容
本发明的固化用载体的特征在于，在其表面上设置电解质薄膜。即，本发明的第1个方面是，(1)固定化用载体，其特征在于，在载体的表面上设置电解质薄膜。
上述电解质薄膜的材料也可以使用无机材料，优选使用高分子材料形成电解质薄膜。因而，本发明的第2个方面是，(2)上述(1)的固定化用载体，所述电解质薄膜由高分子材料形成。
上述电解质薄膜可以为由聚阴离子或者聚阳离子构成的薄膜，因而，本发明的第3个方面是，(3)上述(2)的固定化用载体，所述电解质薄膜由聚阴离子薄膜或者聚阳离子薄膜构成。
较优选的是，上述电解质薄膜可以通过将多个不同聚阴离子薄膜或者聚阳离子薄膜任意组合并层压形成层压膜。特别优选的是，上述聚阴离子薄膜和聚阳离子薄膜交替层压形成该电解质薄膜。即，本发明的第4个方面是，(4)上述(2)的固定化用载体，所述电解质薄膜由聚阴离子薄膜和聚阳离子薄膜交替层压形成。
本发明的固定化用载体可以应用在制作用于抗原抗体反应、核酸的杂交、受体分析、生物传感器等中的固相。特别是，本发明的固定化用载体可以用于由生物体由来的物质·组织·细胞·菌体·病毒或者与它们结合或者与它们具有亲和性的物质等的固定化中，有利的是，在固定相上补足测定的对象物质时，可以提供在该固相载体上结合与对象物质成对的补足物质的最佳固相载体表面。因而，本发明的第5个方面是，(5)上述(1)～(4)任一项的固定化用载体，用于固定与检测物结合的物质或者具有亲和性的物质。
作为在本发明的固定化用载体上固定化的对象，可以举出蛋白质、糖蛋白质、肽、糖肽、多糖、核酸、脂质、糖脂质等由生物体由来的物质、细胞或者与它们结合的物质或者与它们具有亲和性的物质。因而，本发明的第6个方面是，(6)上述(1)～(5)任一项的固定化用载体，用于固定化蛋白质、糖蛋白质、肽、糖肽、多糖、核酸、脂质、糖脂质等由生物体由来的物质、细胞或者与它们结合的物质或者与它们具有亲和性的物质。
另外，本发明还提供使用上述(1)～(4)记载的固定化用载体的可提供给各种测定·试验等的固相，在该固相中，与检测物结合的物质或者与检测物具有亲和性的物质，尤其是蛋白质、糖蛋白质、肽、糖肽、多糖、核酸、脂质、糖脂质等由生物体由来的物质、细胞或者与它们结合的物质或者与它们具有亲和性的物质等特异性极高、能被有效且再现性良好地固定化。因而，本发明的第7个和第8个方面是，(7)在上述(1)～(4)任一项的固定化用载体上，具有将与检测物结合的物质或者与检测物具有亲和性的物质固定化的固相，(8)在上述(1)～(4)任一项的固定化用载体上，具有将蛋白质、糖蛋白质、肽、糖肽、多糖、核酸、脂质、糖脂质等由生物体由来的物质、细胞或者与它们结合的物质或者与它们具有亲和性的物质固定化的固相。
通过上述各构成，本发明可以提供能够特异地、有效且再现性良好地将性质不同的多种多样的物质结合的固定化用载体，并提供具有优异特性的固相。
具体实施例方式
本发明的固定化用载体在其基材的表面上设置电解质薄膜。
作为本发明的固定化用载体的基材的材质，可以使用本领域技术人员公知的任何材质，可以举出聚苯乙烯和聚碳酸酯等塑料、纤维素等生物高分子物质、玻璃、陶瓷树脂、金属、导电性塑料等，对此没有限定。这些基材根据所需的用途，可以为任意形状，例如，微板和珠子、膜、色谱条、片、管、针或者槽状体等形式。
关于本说明书中使用的术语“电解质薄膜”的含义，一般来说，术语“电解质”是对水溶性的材料使用的，但在制作可在本发明中使用的电解质薄膜时，不一定必须使用水溶性材料。例如，即使是带电微粒等不溶性、油性材料，只要以分散在有机溶剂中的状态使用，也可以作为本发明的电解质薄膜的材料使用。另外，本发明的电解质薄膜的材料不一定必须为聚合物(高分子材料)，也可以使用高分子材料以外的无机材料等，但在薄膜化和降低制造成本方面，较优选高分子材料。
适合作为电解质聚合物的，该高分子材料可优选使用带负电电解质聚合物，如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚对苯亚苯基(-)、聚噻吩-3-乙酸、聚酰胺等水溶性阴离子聚合物，作为带正电电解质聚合物，可以使用聚芳胺盐酸盐、聚二甲基二芳基氯化铵、聚吡咯、聚苯胺、聚对苯亚苯基(+)、聚对乙烯撑、聚乙基亚胺等水溶性阳离子聚合物，对此没有限定。
在本发明的设置于固定化用载体的基材表面的电解质薄膜可以起到在该载体的表面上特异性、有效且再现性良好地结合多种多样物质的吸附膜的作用，其可以由一层薄膜形成，或者由多层薄膜层构成的层压膜形成。作为层压膜，在形成上述电解质薄膜的场合，可以将带正电荷的第1带电(电解质)膜和带负电荷的第2带电膜任意组合并层压，形成该电解质薄膜。一般来说，考虑到同种电荷之间的相斥，优选第1带电膜和第2带电膜交替层压。另外，带正电荷的多种带电膜和带负电荷的多种带电膜也可以任意或者电荷交替层压。
无论形成带负电还是带正电的薄膜，在形成由一层构成的电解质薄膜的场合，可以在上述阴离子聚合物的水溶液或者阳离子聚合物水溶液中浸渍载体基材的表面。
另外，在形成电解质薄膜作为层压膜的场合，可以任意或者交替组合带负电的电解质聚合物薄膜和带正电的电解质薄膜并层压，使用G.Decker，ThinSolid Films，210/211，831(1992)，D.S.Yoo，Macromolecules，31，4309(1998)，有贺克彦，化学和工业，第52卷，第7号，853-856页中记载的方法可以形成作为带负电的聚合物薄膜和带正电的电解质薄膜的层压(吸附)膜的一种的交替吸附层压膜。一般来说，可以进行在带负电的聚合物薄膜(阴离子)水溶液和带正电的电解质薄膜(阳离子)水溶液中交替浸渍载体的操作。
另外，除浸渍之外，还可以使用注射筒、吸管、分注器、刷毛·刷子、喷墨喷嘴、压印或者印刷等，在载体上的任意位置，滴加·涂布·喷雾·压印聚合物溶液，在载体表面任意地形成本发明的电解质薄膜。而且，也可以通过使用原子间力显微镜探针的浸蘸笔纳米平版印刷术(DPN，Dip-PenNanolithography)，在极其微小的区域涂布。
对形成的电解质薄膜的膜厚没有特别的限定，优选1层的厚度为0.1～50nm，层压数1～1000层，膜厚0.001～50μm，较优选1层的厚度为0.1～50nm，层压数1～500层，膜厚0.001～25μm，特别优选1层的厚度为0.1～50nm，层压数1～100层，膜厚0.001～5μm。膜形成时的温度优选4～60℃，较优选10～45℃，特别优选15～37℃。另外，对在阴离子聚合物水溶液或阳离子聚合物水溶液中浸渍的时间没有特别的限定，优选1～60分钟，较优选3～30分钟，特别优选3～15分钟。
在上述交替层压膜形成时，形成1层后，可以迅速形成另一层，也可以隔几天或几小时后，再形成另一层。膜形成工序的洗涤工序一般用水冲洗载体来完成洗涤。只要对膜形成没有障碍，对水的纯度没有限定。另外，洗涤用液也不一定必须是水，也可以使用能溶解高分子电解质的溶剂。
另外，如上所述，一般术语“电解质”是指对水溶性材料使用的，在制作可以用于本发明的膜时，不一定必须使用水溶液的材料。例如，也可以使用带电微粒子(例如，铁氧体微粒子)等不溶性材料和油性材料，只要以分散在有机溶剂或水中的状态使用，就可以用作本发明的电解质膜的材料。本发明的电解质膜的材料也不一定必须是聚合物(高分子材料)。例如，也可以使用金属络合物单体作为阳离子膜，或者使用无机氧化物作为阴离子膜。
膜形成后的固定化用载体可以在常温下保存，通常具有1年以上的稳定性。
之后，在本发明的固定化用载体上，可以固定化各种物质，例如由生物体由来的物质·组织·细胞·菌体·病毒或者与它们结合或者与它们具有亲和性的物质，尤其是蛋白质、糖蛋白质、肽、糖肽、多糖、核酸、脂质、糖脂质、维生素类、类固醇、儿茶酚胺和甲状腺素等激素类、前列腺素类、GABA、乙酰胆碱、5-羟色胺和多巴胺等各种神经传递物质、抗生素所代表的由生物体由来的物质、细胞或者与它们结合的物质或者与它们具有亲和性的物质等，固定化时，使用本领域技术人员公知的任何方法均可。这样，在载体上固定了各种物质的固相优选用于利用该固相的各种抗原抗体反应、核酸的杂交、受体分析、生物传感器等中。
如上所述，根据本发明，可以用非常简单的操作工序制作具有优异的固化能力和稳定性的固定化用载体，可以提供具有优异特性的固相。
根据本发明的固定化用载体，在固定化用载体的基材表面涂布电解质薄膜，可以有效且以良好的再现性在该涂布的载体表面固定所需物质，可以提供具有优异特性的固定化用载体和利用该载体的固相。
实施例下面通过实施例更详细地说明本发明，当然本发明不受下面实施例的限定。
(实施例1)在聚丙烯酸水溶液(浓度10-2M)中，在25℃下，浸渍96个孔的微板15分钟后，用水洗涤。此时，聚丙烯酸水溶液的pH保持在3.5。另一方面，如下制备溶液在0.1M的2(N-吗啉基)乙烷磺酸(MES)缓冲液(pH6)中，加入使5’-末端氨基化的寡脱氧胸苷(20mer)至1.3mM，进一步加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)至25mM。向上述板的每个孔中加入制备的溶液75μL，在60℃反应6小时，将寡脱氧胸苷固定在孔内表面。用水冲洗未反应的寡脱氧胸苷后，加入含有0.5vol％的荧光检测试剂OliGreen的10mM三(羟基)氨基甲烷盐酸盐-1mM乙二胺-N，N，N’，N’-四乙酸(TE)缓冲液(pH8.0)75μL，进行荧光测定。或者，在寡脱氧胸苷没有固定化的孔中也加入荧光检测试剂，测定荧光强度，差额作为空白。
n＝8的试验结果如表1所示，可以看出在所得微板中，各微孔的荧光强度都强，寡脱氧胸苷大多数结合。
(对比例1)使用合成石英制低压水银灯，对96个孔的微平板照射200mJ/cm2紫外线。使用该微平板，和实施例1一样，将寡脱氧胸苷固定在孔内表面，以下进行和实施例1一样的操作。
n＝8的试验结果如表1所示，在所得微板中，荧光强度比实施例1的弱，再现性也差。
表1

(荧光强度)H＞5000，M2000～5000，L＜2000(实施例2)在聚丙烯酸水溶液(浓度10-2M)中，在25℃下，浸渍96个孔的微板15分钟后，用水洗涤，然后在聚芳胺水溶液(浓度10-2M)中，在25℃下，浸渍96个孔的微板15分钟后，用水洗涤，将其交替反复10次，形成交替层压膜。此时，两电解质水溶液的pH保持在3.5。在100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中溶解螨虫抗原蛋白质(Der f II，生化学工业制)以使其达到5μg/mL的浓度，在形成交替层压膜的平板的孔中加入100μL，在4℃吸附一夜。用PBS洗涤孔3次后，加入400μL的1％牛血清白蛋白溶液(用蒸馏水稀释KPL社制的Diluent/Blocking Solution Concenrate10倍)，在25℃反应1小时，封闭未反应的固相。用PBS洗涤孔3次后，往孔中加入具有螨虫特异IgE抗体的螨虫过敏患者的血清100μL，在25℃反应2小时。用PBS洗涤孔3次后，加入调制成1μg/mL的过氧化物酶标识的抗人的IgE抗体(KPL社制)100μL，在25℃反应1小时。用PBS洗涤孔5次后，加入TMB(KPL社制3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)100μL，反应3小时，然后加入100μL 1M磷酸，终止反应。使用微板读数器，测定450nm的吸光度。作为阴性对照，加入健康人的血清代替螨虫过敏患者的血清，也进行同样的操作。从阴性对照的5次测定求出标准偏差(SD)，进一步将其2倍化的数值与5次测定的平均值相加的值作为MEAN+2SD。另一方面，从螨虫过敏患者血清的5次测定求出标准偏差(SD)，进一步将用平均值减去其2倍化的数值得到的值作为MEAN-2SD。把用MEAN-2SD减去MEAN+2SD的值为0或者负值作为阴性(-)，把正值作为阳性(+)。
其结果示于表2中。从表2可以看出，可以判定所有的螨虫过敏患者为阳性(+)。
(对比例2)用合成石英制的低压水银灯，对96孔的微板照射200mJ/cm2紫外线。使用该微板，和实施例2一样，进行螨虫抗原蛋白质的固定化，下面施行和实施例2一样的操作和计算。如表2所示，不能判定在所得微平板中，所有的螨虫过敏患者为阳性(+)。
表2

(实施例3)往96个孔的微板中注入聚丙烯酸水溶液(浓度10-2M，pH5.0)，在25℃放置3分钟，用水洗涤，然后注入聚丙烯酸水溶液(浓度10-2M，pH2.5)，在25℃放置3分钟，用水洗涤。将其交替反复2.5次，形成交替层压膜。在100mM磷酸钠缓冲液(PBS)(pH7.0)中溶解从兔子由来的缩醛酶使浓度达到1μg/μL，往形成交替层压膜的平板的孔中加入100μL，在4℃吸附1夜。用PBS洗涤孔3次后，加入1％牛血清白蛋白溶液(用蒸馏水稀释KPL社制的Diluent/Blocking Solution Concenrate10倍)360μL，在25℃吸附1小时，进行封闭。除去白蛋白溶液，往孔中加入过氧化物酶标识的缩醛酶特异抗体的PBS溶液100μL，在25℃反应2小时。用PBS洗涤孔4次后，加入100μL TMB(KPL社制3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)，并反应15分钟，加入100μL 1M磷酸终止反应。用微板读数器测定450nm的吸光度。n＝8的试验结果如表3所示，在形成交替层压膜的孔中，吸光度高。
(对比例3)和实施例3一样，使没有形成交替层压膜的96个孔的微板吸附缩醛酶，封闭后，加入过氧化物酶标识的缩醛酶特异抗体，通过TMB反应，测定吸光度。如表3所示，吸光度比实施例3的弱。
表3

(吸光度)H＞1.4，M1.0-1.4，L＜1.0(实施例4)往96个孔的微板中注入聚丙烯酸水溶液(浓度10-2M，pH5.0)，在25℃放置3分钟，用水洗涤，然后注入聚丙烯酸水溶液(浓度10-2M，pH2.5)，在25℃放置3分钟，用水洗涤。将其交替反复4.5次，形成交替层压膜。在100mM磷酸钠缓冲液(PBS)(pH7.0)中溶解由蛋白由来的溶菌酶使浓度为1ng/μL，往形成交替层压膜的板的孔中加入100μL，在4℃吸附1夜。用PBS洗涤孔3次后，加入1％牛血清白蛋白溶液(用蒸馏水稀释KPL社制的Diluent/Blocking Solution Concenrate 10倍)360μL，在25℃吸附1小时，进行封闭。除去白蛋白溶液，往孔中加入过氧化物酶标识的溶菌酶特异抗体的PBS溶液100μL，在25℃反应2小时。用PBS洗涤孔4次后，加入100μL TMB(KPL社制3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)，并反应15分钟，加入100μL 1M磷酸终止反应。用微板读数器测定450nm的吸光度。n＝8的试验结果如表4所示，在形成交替层压膜的孔中，吸光度高。
(对比例4)和实施例4一样，使没有形成交替层压膜的96个孔的微板吸附溶菌酶，封闭后，加入过氧化物酶标识的溶菌酶特异抗体，通过TMB反应，测定吸光度。如表4所示，吸光度比实施例4的弱。
表4

(吸光度)H＞1.2，M0.8-1.2，L＜0.8
权利要求
1.一种固定化用载体，其特征在于，在载体的表面上设置电解质薄膜。
2.权利要求1所述的固定化用载体，所述电解质薄膜由高分子材料形成。
3.权利要求2所述的固定化用载体，所述电解质薄膜由聚阴离子薄膜或聚阳离子薄膜的任何一种构成。
4.权利要求2所述的固定化用载体，所述电解质薄膜由聚阴离子薄膜和聚阳离子薄膜交替层压构成。
5.权利要求1～4任一项所述的固定化用载体，用于固定与检测物结合的物质或者与检测物具有亲和性的物质。
6.权利要求1～5任一项所述的固定化用载体，用于固定蛋白质、糖蛋白质、肽、糖肽、多糖、核酸、脂质、糖脂质等由生物体由来的物质、细胞或者与它们结合的物质或者与它们具有亲和性的物质。
7.一种固相，在权利要求1～4任一项所述的固定化用载体上，固定与检测物结合的物质或者与检测物具有亲和性的物质。
8.一种固相，在权利要求1～4任一项所述的固定化用载体上，固定蛋白质、糖蛋白质、肽、糖肽、多糖、核酸、脂质、糖脂质等由生物体由来的物质、细胞或者与它们结合的物质或者与它们具有亲和性的物质。
全文摘要
本发明的目的在于提供使性质不同的多种多样的物质能够特异的、有效且再现性良好地被固定的、形成最佳载体表面的固定化用载体，以及提供通过该载体的使用而具有改善的特性的固相。本发明的固定化载体的特征在于，在载体的表面设置电解质薄膜。该固定化用载体可以应用在例如用于抗原抗体反应、核酸的杂交、受体分析、生物传感器等中的固相的制作。
文档编号G01N33/543GK1682113SQ03821608
公开日2005年10月12日 申请日期2003年9月12日 优先权日2002年9月13日
发明者中岛文一郎, 武田信司, 泽崎健, 前川麦, 须藤邦宏 申请人:日立化成工业株式会社