专利名称：斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，可用于科研、疾病诊断和食 品安全领域。
背景技术：
金标免疫检测技术是继同位素、荧光素和酶标记技术之后的一种新型免疫标记技 术。该方法简便、快捷、不需要特殊设备，结果判定有极好的可视性。适用于‘床边’检测、 疾病普查和流行病监测，以及海关、食品安全和养殖业等领域。常用的金标免疫检测包括侧向免疫金层析法(Bilateral immune-chromatographic assay)禾口SE；1^ 1:^^50 ! (Dot immune-gold filtration assay)。侧向免疫金层析法是受测样本和胶体金标记探针在一种微孔膜(例如硝酸纤维素 膜)上受虹吸作用做侧向运动，与预先包被在膜另一端的捕获探针相遇而聚集，呈现肉眼可 见的红色线条。由于受测样本和标记探针是在混合状态下做同步运动，这种方法在检测抗 体时会因为待测样本中的非特异性抗体存在而消耗标记探针，从而降低检测的灵敏度。在 这种情况下通常使用双抗原夹心法取代间接抗体法。但双抗原夹心法要求包被抗原与标记 抗原的抗原决定簇有尽可能大的差异而避免竞争性抑制，从而对试剂质量和成本提出更高 的要求，成为该技术的主要缺陷。竞争法则以不显色为阳性结果，在很多情况下给结果判定 带来不便。所以，目前该技术的临床应用受到局限。斑点免疫金渗滤法是让待测样本垂直渗滤过微孔膜(例如硝酸纤维素膜)，被膜 上包被的捕获探针捕获，再以同样方式让胶体金标探针渗滤过微孔膜，与被捕获的配体结 合后聚集形成肉眼可见的红色斑点。这种方法的缺陷是大部分待测样本和标记探针从斑点 以外的非相关区域流失，影响检测灵敏度，致使该技术尚未在临床检验中广泛使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种高灵敏度和高准确度的斑点免疫金定向渗滤检测试剂 盒，以克服现有技术的不足。本发明的另一目的是提供斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒在科研、疾病诊断和 食品安全领域中的应用。本发明的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒包括斑点免疫金渗滤卡片，纳米胶体 金或乳胶微球标记的检测探针，阴性和阳性标准品以及冲洗液，其工作原理是在传统斑点 免疫金渗滤法的基础上，在微孔膜与吸水膜之间设置一个渗滤限制装置，使待测样本和胶 体金标探针依次沿着包被探针所覆盖的区域渗滤，避免试剂在其它非相关区域的流失，以 提高检测灵敏度。本发明实现过程如下一种斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，包括斑点免疫金渗滤卡片，纳米胶体金或乳 胶微球标记的检测探针，阴性和阳性标准品以及冲洗液，其特征在于该斑点免疫金渗滤卡片为斑点免疫金定向渗滤卡片，其能够使待测样本和胶体金标探针依次沿着包被探针覆盖 的区域渗滤。所述的斑点免疫金定向渗滤卡片有以下两种实现方式，可以使待测样本和胶体金 标探针依次沿着包被探针覆盖的区域渗滤。其中一种实现方式是在传统斑点免疫金渗滤 法的基础上，在具有微孔和层析作用的微孔膜与吸水垫之间设置渗滤限制层，使待测样本 和金标探针通过微孔膜时先向膜中央聚集，然后通过膜中央的探针包被区垂直渗滤至吸水 垫，从而降低试剂在其它非相关区域里的流失，提高检测灵敏度。这种斑点免疫金定向渗滤 卡片从上到下由表层、微孔膜、渗滤限制层和吸水垫4层组成，表层为非吸水材料，中央有 一开孔；微孔膜为一种与蛋白分子有亲和力的微孔膜(孔径为0. 2-5 μ m的硝酸纤维素膜、 醋酸纤维素膜或PVDF膜)，其上至少包被一种探针；渗滤限制层为非吸水材料(非吸水高分 子薄膜、双面胶或防水涂料)，中央有一开孔。另一种实现方式是从上到下由表层、微孔膜和吸水垫3层组成，表层为非吸水材 料，中央有一开孔；微孔膜为一种与蛋白分子有亲和力的微孔膜(孔径为0. 2-5 μ m的硝酸 纤维素膜、醋酸纤维素膜或PVDF膜)，微孔膜上至少包被一种探针；吸水垫中央设置有凹 槽，凹槽的中心设置有与包被探针形状大小相匹配的突起，探针包被区域与吸水垫突起部 分紧密接触，微孔膜其余部分与吸水垫非接触，也就是微孔膜的其余部分与吸水垫相对应 的凹槽悬空隔离。使用微量点样或喷涂技术，将1-2μ 1捕获探针(lmg/ml)在微孔膜中央固定成直 径为2 3mm的圆形斑点或2X IOmm2的条形，常温或37°C吹风干燥，用1%牛血清白蛋白、 小牛血清或脱脂牛奶浸泡微孔膜，以封闭膜上的空白结合点，常温或37°C吹风干燥。所述的斑点免疫金定向渗滤卡片表层开孔为圆形或椭圆形，开孔直径8 12mm。所述的斑点免疫金定向渗滤法卡片表层为PVC、ΡΕ、PP、PS、ABS塑料、或其它非吸 水高分子材料。所述的吸水垫为2_3mm厚的吸水纸板、吸水纤维板或吸水棉垫。所述的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒还可以设置有与卡片表层开孔适配的 漏斗状滤过膜，与卡片表层中央的微孔膜适配，并可自由拆卸。该滤过膜为孔径0. 2-0. 45 微米滤纸制成，吸附有抗凝剂，可滤除样本中的有形成分。所述的纳米胶体金或乳胶微球标记的检测探针是用10-40nm胶体金或乳胶微球 连接的检测探针，包括抗原、半抗原、抗体、蛋白分子、多肽、核酸，这些标记探针在渗滤过程 中与配体结合后聚集，呈现肉眼可见的颜色。所述的冲洗液为磷酸缓冲液，Tris-缓冲液，或含有Tween 20的缓冲液。本发明斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒可用于科研、食品安全和疾病诊断，检 测抗原、半抗原、抗体、蛋白分子、多肽、核酸；可检测食品中的药物残留和化学物质残留； 可检测多种疾病标志物感染性疾病包括单纯泡疹病毒1/2、水痘病毒、EB病毒、巨细胞病毒、人类泡疹病 毒-6/8 ；流感病毒A/B、付流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腺病毒、非典病毒、肝炎、 脊髓灰质炎病毒、流行性乙脑病毒、出血热病毒、多价禽流感病毒、艾滋病毒1/2、狂犬病毒； 脑膜炎球菌、布鲁氏菌、破伤风杆菌、梅毒、肺炎支原体、兔弓形体、百日咳杆菌、多价肺炎球 菌、多价大肠杆菌、多价白喉杆菌、结核杆菌、伤寒杆菌、幽门螺旋体、血吸虫；自身免疫性疾病包括双链DNA、组蛋白、心磷脂、核仁抗原、着丝�？乖�、髓过氧化酶、 蛋白激酶3、核蛋白、‘史密斯’抗原、Jo-I抗原、Scl-70抗原、SS-A/B抗原、甲状腺球蛋白、 线粒体抗原、心肌抗原、平滑肌抗原、肾小球基底膜抗原、胶原I-IV、髓磷脂基本蛋白、蛋白 脂质蛋白、髓磷脂神经胶质细胞糖蛋白、以及类风湿因子和环瓜氨酸多肽；肿瘤标志物包括癌抗原27.四、癌胚抗原、癌抗原19. 9、甲胎球蛋白、绒毛膜促性腺 激、癌抗原125、抗-癌抗原27.四、前列腺癌特异性抗原；心脑血管疾病包括肌红蛋白、肌钙蛋白I、超敏-C反应蛋白、磷酸肌酸激酶MB、新型脂 肪酸结合蛋白；家禽家畜疾病包括鸡禽流感病毒、鸡新城疫病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪口蹄 疫、猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、犬细小病毒；寄生虫病包括猪蛔虫病、旋毛虫病、姜片吸虫病、囊尾虫病、肉孢子虫病、弓形虫病、棘 头虫病；猪肺线虫病、猪鞭虫病、猪类圆线虫病、猪结节虫病、猪肾虫病、猪胃虫圆线虫病、牛 焦虫病、牛球虫病、牛住肉孢子虫病、牛弓形虫病、牛胎毛滴虫病、牛囊尾蚴病、牛棘球蚴病、 牛肝片形吸虫病、牛血吸虫病、羊肝片吸虫病、羊血吸虫病、羊前后盘吸虫病、羊双腔吸虫 病、羊脑多头蚴病、羊棘球蚴病、羊细颈囊尾蚴病、羊胃肠线虫病、羊肺线虫病、羊绦虫病、羊 血孢子虫病、羊球虫病、羊泰勒虫�。灰呙缧Ъ鄄舛òㄅ６灰呙�、脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、腺病毒疫苗、黄热病疫苗、 风疹疫苗、腮腺炎疫苗、甲型肝炎疫苗、流感疫苗、水痘疫苗、轮状病毒疫苗、乙型脑炎疫苗、 狂犬病疫苗、流行性出血热疫苗、卡介苗、伤寒疫苗、斑疹伤寒疫苗、霍乱疫苗、布氏菌疫苗、 炭疽疫苗、痢疾疫苗、百日咳疫苗、鼠疫疫苗、肺炎链球菌疫苗、沙门Vi多糖疫苗、脑膜炎球 菌A/C疫苗、痢疾疫苗、百日咳疫苗、鼠疫疫苗、肺炎链球菌疫苗、沙门Vi多糖疫苗、脑膜炎 球菌A/C疫苗、流感嗜血杆菌疫苗、白喉疫苗，SARS疫苗。发明的优点与积极效果(1)本发明所述的斑点免疫金定向渗滤技术与传统斑点免疫金渗滤法相比，显著提高 了检测灵敏度。(2)本发明与免疫金层析法相比，制作简单，试剂消耗量少，检测范围广，可操作性 更好。
( 3 )本发明技术成本低，适合大规模推广。
图1是本发明斑点免疫金定向渗滤卡片(4层)的结构示意图； 图2是本发明斑点免疫金定向渗滤卡片(4层)的渗滤方向示意图； 图3是本发明斑点免疫金定向渗滤卡片(3层)的结构示意图；图4是本发明斑点免疫金定向渗滤卡片(3层)的渗滤方向示意图； 图5是本发明斑点免疫金定向渗滤卡片检测的阳性结果示意图。
具体实施例方式如图1所示，本发明斑点免疫金定向渗滤卡片从上到下由①非吸水材料制成的表 层、②包被有捕获探针的微孔膜、③非吸水材料制成的渗滤限制膜和④吸水垫4层组成，四层复合后成为本发明斑点免疫金定向渗滤卡片。如图2所示，将斑点免疫金定向渗滤卡在室温下水平放置，将受测血清或血浆做 适当稀释(1: (5-10))，用微量移液器将50-100μ1该稀释样本滴注到卡片中央的微孔膜 上，待其渗滤完后滴注50-100 μ 1 PBS冲洗液；待其渗滤完后滴注50-100 μ 1金标检测探 针；待其渗滤完后滴注50-100 μ 1 PBS冲洗液；用同样方法对阳性和阴性标准品检测，作为 检测过程的质量控制。肉眼观察捕获探针区域的显色反应红色斑点为阳性，不显色为阴 性。结果判定若阳性对照和受测样本均为阳性，则判定受测样本为阳性；若阳性对照为阳 性，受测样本为阴性，则判定受测样本为阴性；若阳性对照为阴性，说明试验过程有误，应重 复。整个过程大约需要3-5分钟。预先对受测样本做梯度稀释，可对被检品滴度作定量分 析。如图3、4所示，本发明斑点免疫金定向渗滤卡片从上到下由非吸水材料制成的表 层①、包被有捕获探针的微孔膜②和吸水垫④3层组成，三层复合后成为本发明斑点免疫 金定向渗滤卡片。吸水垫④中央设置有凹槽，凹槽的中心设置有与包被探针形状大小相匹 配的突起，探针包被区域与吸水垫突起部分紧密接触，微孔膜的其余部分与吸水垫相对应 的凹槽悬空隔离，非接触，以保证溶液按照箭头所指方向定向渗滤，富集样品，提高检测灵 敏度。本发明还可以在斑点免疫金定向渗滤卡中央的微孔膜上加置一个过滤膜，用微量 移液器将5-10 μ 1血清、血浆或全血样本滴注到过滤膜上，随即滴注50-100 μ 1 PBS冲洗 液，待其渗滤完后滴注50-100 μ 1金标检测探针，以下步骤同上。图5是本发明斑点免疫金定向渗滤卡片检测的阳性结果示意图，根据捕获探针的 包被区域形状显示为①圆斑状或②条状。实施例1斑点免疫金定向渗滤试剂盒的制备斑点免疫金定向渗滤卡片的表层为白色5X4X0. 5cm3的PVC卡片，中央有一直径为 0. 8cm的圆孔；渗滤卡片的微孔膜为直径为1. 2cm的NC膜(微孔为0. 45)。使用微量点样或 喷涂技术将1-2 μ 1捕获探针(lmg/ml)固定于微孔膜中央，呈直径为2mm的圆型斑点(或 条状)，室温或吹风干燥后，浸入1%牛血清1分钟，室温或吹风干燥后室温或吹风干燥20分 钟；渗滤卡片的渗滤限制层为5X4X0. 5cm3的双面胶薄膜，中央开有一直径为2mm的圆孔 (或条状)，与微孔膜中央的包被探针区相对应；渗滤卡片的吸水垫为5X4X0. 3cm3的吸水 纸板。以上四层经不干胶依次紧密粘合，制成的卡片用铝箔袋密封保存。阳性和阴性对照品分别为经标准品校对过的阳性和阴性样品。金标捕获探针为直 径为20nM标记的检测探针，冲洗液为0. IM的PBS缓冲液。或者，上述的渗滤限制层的双面胶薄膜被省略，在渗滤卡片的吸水垫中央冲压一 直径为10mm、深为1. 5mm的圆形凹陷，凹陷中央保留一直径为2mm的圆柱状突起。将该吸水 垫与上述的微孔膜和PVC卡片依次由下而上紧密粘合，制成的卡片用铝箔袋密封保存。实施例2双斑点免疫金定向渗滤卡片的制作双斑点免疫金定向渗滤卡片是在同一检测孔中同时显示阳性对照和检测斑点。斑 点免疫金定向渗滤卡片的表层为白色5X4X0. 5cm3的PVC卡片，中央有一直径为Icm的 圆型或椭圆形开孔；渗滤卡片的微孔膜为直径为1. 5cm的NC膜(微孔为0. 45)。使用微量 点样或喷涂技术将1_2μ 1抗金标探针抗体(lmg/ml)和捕获探针(lmg/ml)分别固定于微孔膜中央，二者相距4mm，呈直径为2mm的圆型斑点(或条状)，室温或吹风干燥后，浸入 1%牛血清1分钟，室温或吹风干燥后室温或吹风干燥20分钟；渗滤卡片的渗滤限制层为 5X4X0. 5cm3的双面胶薄膜，中央开有两个直径为2mm的圆孔(或条状)，与微孔膜中央的2 个包被探针区相对应；渗滤卡片的吸水垫为5X4X0. 3cm3的吸水纸。以上四层经不干胶依 次紧密粘合，完成卡片的制作。制成的卡片用铝箔袋密封保存待用。实施例3检测抗原的斑点免疫金定向渗滤卡片(双抗体法)的制作斑点免疫金定向渗滤卡片的表层为白色5X4X0. 5cm3的PVC卡片，中央有一直径为 0. 8cm的圆孔；渗滤卡片的微孔膜为直径为1. 2cm的NC膜(微孔为0. 45)。使用微量点样或 喷涂技术将1-2 μ 1捕获抗体(lmg/ml)固定于微孔膜中央，呈直径为2mm的圆型斑点(或 线状和环状)，室温或吹风干燥后，浸入1%牛血清1分钟，室温或吹风干燥后室温或吹风干 燥20分钟；其余操作同实施例1。实施例4检测抗体的斑点免疫金定向渗滤卡片(间接抗体法)的制作斑点免疫金定向渗滤卡片的表层为白色5X4X0. 5cm3的PVC卡片，中央有一直径为 0. 8cm的圆孔；渗滤卡片的微孔膜为直径为1. 2cm的NC膜(微孔为0. 45)。使用微量点样或 喷涂技术将1-2 μ 1抗原(捕获探针)(lmg/ml)固定于微孔膜中央，呈直径为2mm的圆型 斑点(或线状和环状)，室温或吹风干燥后，浸入1%牛血清1分钟，室温或吹风干燥后室温或 吹风干燥20分钟；其余操作同实施例1。实施例5检测乙肝病毒抗原(双抗体法)试剂盒内容包括乙肝病毒表面抗原(HbsAg)、核心抗原(HbcAg)和e抗原(HbeAg)特 异性抗体分别包被的斑点免疫金定向渗滤卡片，乙肝病毒阳性和阴性对照血清，20nm胶体 金标记的抗乙肝病毒表面抗原、核心抗原和e抗原特异性抗体，以及PBS冲洗液。操作过程 如下将受测血清或血浆用PBS做1 :10稀释，用移液器将100 μ 1该稀释样本滴注在卡片 中央的微孔膜上，待渗滤后滴注100 μ 1 PBS缓冲液冲洗；待渗滤后滴注50 μ 1金标探针；待 渗滤后滴注100 μ 1 PBS缓冲液冲洗；观测斑点显色。阳性和阴性对照血清并行检测作为质 量控制，同时与传统斑点免疫金渗滤卡片做比较。对20例乙肝阳血清和20例正常对照检 测结果显示本发明所述的斑点免疫金定向渗滤法和传统斑点免疫金渗滤法的灵敏度分别 为95%和40% ；特异性均为100%ο实施例6检测丙肝病毒抗体(间接抗体法)试剂盒内容包括重组丙肝病毒非结构抗原(HCVns)和核心抗原(HCVc)包被的斑点免 疫金定向渗滤卡片，丙肝病毒阳性和阴性对照血清，20nm胶体金标记的羊抗人IgG抗体，以 及PBS冲洗液。操作过程同实施例5.对20例丙肝血清和20例正常对照检测结果显示本 发明所述的斑点免疫金定向渗滤法和传统斑点免疫金渗滤法的灵敏度分别为85%和45% ； 特异性均为100%。实施例7检测艾滋病毒(HIV)抗体(间接抗体法)试剂盒内容包括重组HIV1+2抗原包被的斑点免疫金定向渗滤卡片，HIV阳性和阴性 对照血清，20nm胶体金标记的羊抗人IgG抗体，以及PBS冲洗液。操作过程同实施例5。对 20例HIV血清和20例正常对照检测结果显示本发明所述的斑点免疫金定向渗滤法和传 统斑点免疫金渗滤法的灵敏度分别为95%和40% ；特异性均为100%。实施例8检测梅毒螺旋体抗体(间接抗体法)试剂盒内容包括重组梅毒螺旋体抗原包被的斑点免疫金定向渗滤卡片，梅毒阳性和 阴性对照血清，20nm胶体金标记的羊抗人IgG抗体，以及PBS冲洗液。操作过程同实施例 5。对20例梅毒血清和20例正常对照检测结果显示本发明所述的斑点免疫金定向渗滤法 和传统斑点免疫金渗滤法的灵敏度分别为95%和20% ；特异性均为100%。实施例9检测流行性出血热病毒(Hantan virus)抗体试剂盒内容包括重组流行性出血热病毒包被的斑点免疫金定向渗滤卡片，流行性出 血热病毒阳性和阴性对照血清，20nm胶体金标记的羊抗人IgG+IgM抗体，以及PBS冲洗液。 操作过程同实施例5。对20例流行性出血热病毒血清和20例正常对照检测结果显示本 发明所述的斑点免疫金定向渗滤法和传统斑点免疫金渗滤的灵敏度分别为90%和15% ；特 异性均为100%。实施例10检测自身免疫性抗体试剂盒内容包括双链DNA、组蛋白、心磷脂、核仁抗原、着丝�？乖⑺韫趸�、蛋白 激酶3、核蛋白、‘史密斯’抗原、Jo-I抗原、Scl-70抗原、SS-A/B抗原、甲状腺球蛋白、线粒 体抗原、心肌抗原、平滑肌抗原、肾小球基底膜抗原、胶原ι-ιν、髓磷脂基本蛋白、蛋白脂质 蛋白、髓磷脂鞘神经胶质细胞糖蛋白、以及类风湿因子和环瓜氨酸多肽(CCP)分别包被的斑 点免疫金定向渗滤卡片，相关自身免疫性疾病对照血清和正常对照血清，20nm胶体金标记 的羊抗人IgG抗体，以及PBS冲洗液。操作过程同实施例5。其中，对20例类风湿性关节炎 血清和20例正常对照的抗CCP抗体检测结果显示本发明所述的斑点免疫金定向渗滤法和 传统斑点免疫金渗滤法的灵敏度分别为95%和30% ；特异性均为100%。实施例11使用斑点免疫金定向渗滤卡片检测肿瘤标志物试剂盒内容包括癌抗原27. 29 (CA27. 29)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原19. 9(CA19. 9)、甲 胎球蛋白(AFP)、绒毛膜促性腺激(b-hCG)、癌抗原125(CA12Q、前列腺癌特异性抗原(PSA) 特异性抗体分别包被的斑点免疫金定向渗滤卡片，相关肿瘤阳性和阴性对照血清，20nm胶 体金标记的相关肿瘤标志物抗体，以及PBS冲洗液。操作过程同实施例5。其中，对20例 PSA血清和20例正常对照检测结果显示本发明所述的斑点免疫金定向渗滤法和传统斑点 免疫金渗滤法的灵敏度分别为65%和10% ；特异性均为100%。实施例12使用斑点免疫金定向渗滤卡片检测心脑血管疾病生物标志物 试剂盒内容包括肌红蛋白、肌钙蛋白I、超敏-C反应蛋白、磷酸肌酸激酶MB和新型脂肪酸结合蛋白特异性抗体分别包被的斑点免疫金定向渗滤卡片，阳性和阴性对照血清， 20nm胶体金标记的相关心脑血管疾病生物标志物抗体，以及PBS冲洗液。操作过程同实施 例5。其中，对20例患者血清和20例正常对照的超敏-C反应蛋白检测结果显示本发明 所述的斑点免疫金定向渗滤法和传统斑点免疫金渗滤法的灵敏度分别为70%和15% ；特异 性均为100%。实施例13检测食品中残留化学物质-三聚氰胺试剂盒内容包括兔抗三聚氰胺抗体包被的斑点免疫金定向渗滤卡片，阳性和阴性对 照品，20nm胶体金标记的羊抗三聚氰胺抗体，以及PBS冲洗液。操作过程同实施例5。其中， 对20阳性样品和20例正常样品的检测结果显示本发明所述的斑点免疫金定向渗滤法和 传统斑点免疫金渗滤法的灵敏度分别为100%和35% ；特异性均为100%。实施例14检测家禽感染性疾病试剂盒内容包括灭活鸡禽流感病毒和鸡新城疫病毒抗原包被的斑点免疫金定向渗滤 卡片，鸡禽流感血清、鸡新城疫血清和正常鸡血清对照品，20nm胶体金标记的羊抗鸡IgM和 IgG抗体，以及PBS冲洗液。操作过程同实施例5。其中，对20鸡禽流感血清和20例正常 血清样品的检测结果显示本发明所述的斑点免疫金定向渗滤法和传统斑点免疫金渗滤法 的灵敏度分别为90%和25% ；特异性均为100%。
实施例15检测家畜感染性疾病试剂盒内容包括灭活猪细小病毒、猪圆环病毒、猪口蹄疫、猪蓝耳病病毒抗原包被的 斑点免疫金定向渗滤卡片，感染血清和正常血清对照品，20nm胶体金标记的羊抗猪IgM和 IgG抗体，以及PBS冲洗液。操作过程同实施例5。其中，对20猪细小病毒感染血清和20 例正常血清样品的检测结果显示本发明所述的斑点免疫金定向渗滤法和传统斑点免疫金 渗滤法的灵敏度分别为90%和20% ；特异性均为100%。
权利要求
1.一种斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，包括斑点免疫金渗滤卡片，纳米胶体金或 乳胶微球标记的检测探针，阴性和阳性标准品以及冲洗液，其特征在于该斑点免疫金渗滤 卡片为斑点免疫金定向渗滤卡片，其能够使待测样本和胶体金标探针依次沿着包被探针覆 盖的区域渗滤。
2.根据权利要求1所述的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，其特征在于所述的斑 点免疫金定向渗滤卡片从上到下由表层、微孔膜、渗滤限制层和吸水垫4层组成，表层为非 吸水材料，中央有一开孔；微孔膜为一种与蛋白分子有亲和力的微孔膜，其上至少包被一种 探针；渗滤限制层为非吸水材料，中央有一开孔，开孔与包被的探针相对应，形状匹配。
3.根据权利要求2所述的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，其特征在于所述的斑 点免疫金定向渗滤卡片渗滤限制层为PVC、ΡΕ、PP、PS、ABS塑料、双面胶或防水涂料制成。
4.根据权利要求1所述的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，其特征在于所述的斑 点免疫金定向渗滤卡片从上到下由表层、微孔膜和吸水垫3层组成，表层为非吸水材料，中 央有一开孔；微孔膜为一种与蛋白分子有亲和力的微孔膜，微孔膜上至少包被一种探针； 吸水垫中央设置有凹槽，凹槽的中心设置有与包被探针形状大小相匹配的突起，探针包被 区域与吸水垫突起部分紧密接触，微孔膜其余部分与吸水垫非接触。
5.根据权利要求2或4所述的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，其特征在于使用 微量喷涂技术，将捕获探针固定在微孔膜中央成直径为2 3mm的圆斑或2X IOmm2的条形。
6.根据权利要求2或4所述的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，其特征在于所述 的斑点免疫金定向渗滤卡片表层开孔为圆形或椭圆形，开孔直径8 12mm。
7.根据权利要求6所述的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，其特征在于所述的斑 点免疫金定向渗滤法卡片表层为PVC、PE、PP、PS、ABS塑料材料。
8.根据权利要求2或4所述的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，其特征在于所述 的斑点免疫金定向渗滤卡片的微孔膜为硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜或PVDF膜，孔径为 0. 2-5微米。
9.根据权利要求2或4所述的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，其特征在于所述 的吸水垫为2-3mm厚的吸水纸板、吸水纤维板、吸水棉垫、吸水性树脂或复合吸水材料。
10.根据权利要求1、2或4所述的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，其特征在于所述 的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒还包括有与卡片表层开孔适配的漏斗状过滤膜，该过 滤膜为孔径为0. 2-0. 45微米滤纸制成，吸附有抗凝剂，滤除样本中的有形成分。
11.根据权利要求1、2或4所述的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，其特征在于所 述的纳米胶体金或乳胶微球标记的检测探针是用10-40nm胶体金或乳胶微球连接的检测 探针，探针包括抗原、半抗原、抗体、蛋白分子、多肽、核酸，这些标记探针在渗滤过程中与配 体结合后聚集，呈现肉眼可见的颜色。
12.根据权利要求1、2或4所述的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒，其特征在于所 述的冲洗液为磷酸缓冲液，Tris-缓冲液，或含有Tween 20的缓冲液。
13.权利要求1、2或4所述的斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒在科研、食品安全和疾 病诊断中的应用。
14.根据权利要求13所述用途，其特征在于可检测抗原、半抗原、抗体、蛋白分子、多 肽、核酸；可检测食品中的药物残留和化学物质残留；可检测多种疾病标志物感染性疾病包括单纯泡疹病毒1/2、水痘病毒、EB病毒、巨细胞病毒、人类泡疹病 毒-6/8 ；流感病毒A/B、付流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腺病毒、非典病毒、肝炎、 脊髓灰质炎病毒、流行性乙脑病毒、出血热病毒、多价禽流感病毒、艾滋病毒1/2、狂犬病毒； 脑膜炎球菌、布鲁氏菌、破伤风杆菌、梅毒、肺炎支原体、兔弓形体、百日咳杆菌、多价肺炎球 菌、多价大肠杆菌、多价白喉杆菌、结核杆菌、伤寒杆菌、幽门螺旋体、血吸虫；自身免疫性疾病包括双链DNA、组蛋白、心磷脂、核仁抗原、着丝�？乖�、髓过氧化酶、 蛋白激酶3、核蛋白、‘史密斯’抗原、Jo-I抗原、Scl-70抗原、SS-A/B抗原、甲状腺球蛋白、 线粒体抗原、心肌抗原、平滑肌抗原、肾小球基底膜抗原、胶原ι-ιν、髓磷脂基本蛋白、蛋白 脂质蛋白、髓磷脂神经胶质细胞糖蛋白、以及类风湿因子和环瓜氨酸多肽；肿瘤标志物包括癌抗原27.四、癌胚抗原、癌抗原19. 9、甲胎球蛋白、绒毛膜促性腺 激、癌抗原125、抗-癌抗原27.四、前列腺癌特异性抗原；心脑血管疾病包括肌红蛋白、肌钙蛋白I、超敏-C反应蛋白、磷酸肌酸激酶MB、新型脂 肪酸结合蛋白；家禽家畜疾病包括鸡禽流感病毒、鸡新城疫病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪口蹄 疫、猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、犬细小病毒；寄生虫病包括猪蛔虫病、旋毛虫病、姜片吸虫病、囊尾虫病、肉孢子虫病、弓形虫病、棘 头虫�。恢矸蜗叱娌�、猪鞭虫病、猪类圆线虫病、猪结节虫病、猪肾虫病、猪胃虫圆线虫病、牛 焦虫病、牛球虫病、牛住肉孢子虫病、牛弓形虫病、牛胎毛滴虫病、牛囊尾蚴病、牛棘球蚴病、 牛肝片形吸虫病、牛血吸虫病、羊肝片吸虫病、羊血吸虫病、羊前后盘吸虫病、羊双腔吸虫 病、羊脑多头蚴病、羊棘球蚴病、羊细颈囊尾蚴病、羊胃肠线虫病、羊肺线虫病、羊绦虫病、羊 血孢子虫病、羊球虫病、羊泰勒虫�。灰呙缧Ъ鄄舛òㄅ６灰呙�、脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、腺病毒疫苗、黄热病疫苗、 风疹疫苗、腮腺炎疫苗、甲型肝炎疫苗、流感疫苗、水痘疫苗、轮状病毒疫苗、乙型脑炎疫苗、 狂犬病疫苗、流行性出血热疫苗、卡介苗、伤寒疫苗、斑疹伤寒疫苗、霍乱疫苗、布氏菌疫苗、 炭疽疫苗、痢疾疫苗、百日咳疫苗、鼠疫疫苗、肺炎链球菌疫苗、沙门Vi多糖疫苗、脑膜炎球 菌A/C疫苗、痢疾疫苗、百日咳疫苗、鼠疫疫苗、肺炎链球菌疫苗、沙门Vi多糖疫苗、脑膜炎 球菌A/C疫苗、流感嗜血杆菌疫苗、白喉疫苗，SARS疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种斑点免疫金定向渗滤检测法试剂盒及其应用。本试剂盒包括斑点免疫金渗滤卡片，纳米胶体金或乳胶微球标记的检测探针，阴性和阳性标准品以及冲洗液，技术特征在于该斑点免疫金渗滤卡片为斑点免疫金定向渗滤卡片，其能够使待测样本和胶体金标探针依次沿着包被探针覆盖的区域渗滤。本发明制作简单，试剂消耗量少，检测范围广，可操作性好，与传统斑点免疫金渗滤法相比，显著提高了检测灵敏度。
文档编号G01N33/543GK102053153SQ20101055931
公开日2011年5月11日 申请日期2010年11月25日 优先权日2010年11月25日
发明者廖帮琳, 林远 申请人:西安微通生物技术有限公司
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