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专利名称：用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种用多波长吸收同步测量技术实现多种酶活性同步测量方法，具体涉及一种单通道同步测定多波长吸收而同步测量多种酶活性的方法。
背景技术：
定义酶活性测量灵敏度为吸收变化速度对酶量响应曲线斜率，酶活性测量的定量限(limit of quantification, L0Q)为上述响应曲线中直线部分截距加上回归估计标准差5倍对应酶量。测定酶活性都要求灵敏度尽量高、定量限尽量低而分析效率尽量高。用针对特定酶的高专一性显色底物可简便高灵敏度连续测定吸收变化反应曲线而测定酶活性；这类酶活性测定过程常规用于临床生化检验、卫生检验检测酶抑制剂类食品或环境污染物、高通量筛选酶抑制剂类组合库和酶标记免疫分析等。另一方面，酶活性测定 的高特异性和高灵敏度使酶作为标记信号用于免疫分析，代表性技术即酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunoassay, ELISA),这是临床检验领域选择性测定混合物中特定大分子或小分子的最常用方法之一。ELISA应用过程中需用捕获成分包被微孔板以便分离免疫反应复合物，并需洗涤过程，单次分析常需130min以上，分析效率低。所以，提高酶活性测量效率在应用中有重要意义。连续跟踪酶反应曲线测定酶活性都每次使用一个显色底物测定一种酶活性，即每个反应通道每次只测定一种酶。在临床检验领域经常需测定相同标本中的两种甚至多种酶活性，如测定肝功状态需测定相同标本中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、Y -谷氨酰基转移酶、碱性磷酸酶等，诊断急性胰腺炎时需测定相同标本中的淀粉酶和脂肪酶。另一方面，ELISA技术主要缺点是其分析效率低，单次分析耗时长。再有，筛选酶抑制剂组合化学库时，每次只测定一种靶酶活性的筛选成本很高而效率低，对组合库样品的消耗量大。发展新技术显著提高测定酶活性效率，并保障测量酶活性的灵敏度和定量限与单组分测定时相当，无疑有重要意义。提高酶法分析效率的最简单策略是在一个酶反应体系，即酶反应通道，每次使用多种显色底物实时同步或基本实时同步地连续跟踪多种酶显色产物吸收变化曲线同步测定多种酶活性。同步测定多波长吸收光度计已普及，如Biotek ELX800酶标仪可同步测量三波长吸收、美谱达UV1600PC普通光度计可同步测定七波长吸收。这些常规设备同步测定不同波长吸收实际上有较短时差；用有双单色器或用二极管阵列检测器的光度计可基本实时同步测量多波长吸收。所以，建立单通道同步测定多种酶的显色底物组合原理及所需数据处理方法，就有望实现单通道多波长吸收同步跟踪多种酶反应过程同步测量多种酶活性并保障与单组分测定定量限和灵敏度相当，此方法用于ELISA及酶抑制剂高内涵筛选都可显著提高效率。很早报道用两种酶标记单通道测量两组分的ELISA技术，但没有实现单通道两种酶同步反应和吸收连续跟踪。Blake等1982年报道用碱性磷酸酶和β -半乳糖苷酶标记两种抗原竞争结合测定单通道同步测定半抗原(Clin Chem 1982; 28 (7) : 1469-1473)。但这两种酶反应是在不同反应体系进行而非同步进行，且不能连续跟踪任一标记酶反应的过程，其使用酚酞单磷酸酯为碱性磷酸酶显色底物，比活性低于对硝基苯基磷酸酯为显色底物时比活性的7%而降低了灵敏度，而酚酞单磷酸酯的成本又很高，使得此技术没有得到实际应用。其它单通道检测两组分的ELISA技术中两种酶反应及两种酶显色产物检测都不同步，也不能连续跟踪两种酶反应曲线(Dean et al.’Clin Chem, 1983; 29 (6) : 1051-1056。Ng, etal.Clin Chem, 1987;33(12):2286-2288。Choi,et al. Clin Chem, 1991;37(5):673-677。Porstmann T,et al.J Tmmunol Methods. 1993;158:95—106。Krambovitis E, et al. Clinchem 1995;41:48-53。Osuchowski,et al. Methods2006;38:304-311 和 Sun J, et al. AnalChim Acta 2010;666:76-82)。因此，现有ELISA技术都未实现单通道同步反应同步连续跟踪多种酶显色显色产物；在筛选酶抑制剂领域，也没有实现单通道同步 测量多种酶活性筛选酶抑制剂的报道。显然，需建立测定酶活性的显色底物设计组合原理及对应的特殊数据处理方法，才可能用常规设备多波长吸收单通道同步测量多种酶活性。在863项目2011AA02A108资助下，发明人建立了本发明权利要求书中所提出的方法。

发明内容
本发明的目的是提供一种用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其基于无相互作用物质吸收的线性加和性、酶显色底物和相应显色产物的等吸收波长建立所需显色底物设计和组合应用的新原理，并建立多种物质吸收光谱重叠干扰的数据处理方法，以及消除不同酶的底物与产物之间相互干扰的数据处理方法，单通道多波长吸收同步测定多种酶活性。本发明用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，包括下列步骤a.确定用多波长吸收单通道同步测定多种酶活性所需显色底物组合al根据待测酶的专一性筛选满足下列条件的显色底物组合所选显色团能分别用于制备待测酶的显色底物；所得这些显色底物组合中，将显色底物在对应待测酶作用下所得显色产物相对该显色底物的差吸收峰最大波长从大到小排列，相邻的显色产物差吸收峰最大波长之间相距大于30nm且尽量远；在按显色产物差吸收峰最大波长从大到小的排列中，除了显色产物差吸收峰最靠近红外端的显色底物外，每个显色底物在对应酶作用下所得显色产物差吸收峰最大波长，都与此排列中某个显色底物的最大等吸收波长相差小于25nm且尽量短；a2用步骤al所选显色团分别合成待测酶的对应显色底物并组合使用；b.在一个反应混合物或酶反应体系即单反应通道中，同步启动多个待测酶针对组合使用的显色底物混合物对应显色底物的专一催化反应；c.选择测量波长组合以显色产物差吸收峰最靠近红外端的显色底物为显色底物A，在显色底物A的显色产物差吸收峰最大波长下测定该显色产物吸收；在显色底物A的等吸收波长处测定其余待测酶显色产物或显色底物的吸收；d.在所选多个测量波长组合下，通过快速变换测量波长，多波长吸收同步测量实现同步跟踪单通道中多个待测酶的反应过程；e.基于无相互作用物质吸收的线性加和性建立消除反应通道中显色物质吸收重叠干扰的数据处理方法，获得消除吸收光谱重叠干扰后每个待测酶的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰且其底物浓度在对应酶米氏常数的3倍以上，用经典初速度法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰但所用显色底物浓度在该酶米氏常数的5%以上而低于米氏常数的3倍，联用经典初速度法和反应过程分析法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；当某个待测酶受反应体系中其自身和/或其它酶的底物和/或产物的干扰时，将描述反应体系动力学的微分速度方程组数值积分后分析活性受到干扰待测酶反应的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线，确定其最大反应速度表示其活性，或据其微分速度方程和所得最大反应速度换算成底物浓度为起始底物浓度93 %时初速度表示酶活性。进一步，应用该方法时，显色产物相对显色底物差吸收峰最大波长在300nm以上且其显色底物吸收峰最大波长小于相应显色产物吸收峰最大波长，否则用逆反应测定该酶的活性；对待测酶显色底物组合中显色产物差吸收峰最大波长相邻的任两个显色底物，显色产物差吸收峰最大波长更靠近红外端者的最大等吸收波长与显色产物差吸收峰最大波 长更靠近紫外端者的差吸收峰最大波长相等或相距不超过5nm为优化组合；所用显色底物组合中每个显色底物都仅被样品中的一种待测酶作用生成显色产物，而不被样品中其它任何酶作用或作用效果不明显；此处所述不被其它任何酶作用或作用效果不明显，指当样品中酶I所对应显色底物的浓度与其米氏常数相差小于50%时，样品中其它任何酶作用于该显色底物的比活性都低于酶I作用于该显色底物比活性的1%;权利要求I的步骤b中，选择适于同步测定活性的待测酶发挥作用的缓冲介质和反应条件，具体包括缓冲介质PH位于pH 5.0到9. O之间且接近比活性最低待测样品的最适pH，所用样品反应温度在摄氏20到40度之间。进一步，该方法应用时所述显色底物包括天然显色底物和非天然显色底物；天然显色底物包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；非天然显色底物由显色团和被酶识别基团组成，显色团包括但不限于4-硝基苯酚、4-硝基苯硫酚、4-硝基苯胺、4-硝基-I-萘酚、4-硝基-I-萘硫酚、4-硝基-I-萘胺、2-萘酚、4-氯苯酚、玫红酸或其衍生物。进一步，该方法应用于同步测量两种酶活性，步骤a中，所述样品中含两种待测酶分别命名为酶A和酶B，所需两种显色底物分别命名为显色底物A和显色底物B，在两种待测酶作用下生成两种显色产物分别命名为显色产物A和显色产物B，这些显色底物及显色产物的组合需满足下列条件(I)显色产物A差吸收峰最大波长Xl靠近红外端，显色产物B差吸收峰最大波长X2靠近紫外端，显色产物B差吸收峰最大波长X2与显色产物A差吸收峰最大波长Xl相距大于30nm且尽量远；(2)显色产物A的最大等吸收波长为Yl且与显色产物B差吸收峰最大波长X2相距小于25nm且且尽量短。该方法应用于同步测量两种酶活性的步骤b和c及d中，在一个反应通道同步启动样品中两种酶针对显色团A和显色团B合成的对应显色底物A和显色底物B的反应，并得到显色产物A和显色产物B ；以显色产物A的最大等吸收波长Yl为λ 2处测定显色产物B吸收，以显色产物A的差吸收峰最大波长Xl为λ I处测定显色产物A吸收；通过快速变换测量波长，两波长吸收同步测量实现同步跟踪单个反应体系中两种待测酶的反应过程。
该方法应用于同步测量两种酶活性的步骤e中，基于吸收线性加和性建立数据解析消除多种物质吸收重叠干扰方法；以显色产物A差吸收峰最大波长前后不超过25nm的波长为λ I且在此波长下吸收为Al，以显色产物A和显色底物A最大等吸收波长附近不超过25nm的波长为λ 2且此波长下吸收为A2，基于吸收线性加和性消除物质吸收重叠干扰需解如下二元一次方程组=A1=Altl + Ε31ΧΡ1+Ε34ΧΡ2
A2=A20 E32 X PJE35 X P2进一步可转变成如下二元一次方程组A1=Altl + Ala+R33 X A2b A2=A20 + A2b+R31 XAlaR31=E32/E31R33=E34/E35P1为显色产物A瞬时浓度；P2为显色产物B瞬时浓度；E31为显色产物A与显色底物A在λ I下差摩尔消光系数；Ε32为显色产物A与显色底物A在λ 2下差摩尔消光系数Ε32 ；Ε34为显色产物B与显色底物B在λ I下差摩尔消光系数；Ε35为显色产物B与显色底物B在λ 2下差摩尔消光系数夂为校正吸收干扰前在λ I瞬时总吸收，A2为校正吸收干扰前在λ 2瞬时总吸收；Ala为校正吸收干扰后显色产物A在λ I瞬时净吸收，其等于P1和Ε31乘积，A2b为校正吸收干扰后显色产物B在λ 2瞬时净吸收，其等于P2和Ε35乘积；Altl为反应体系未生成任何显色产物前在λ I的吸收,为来自反应体系的本底,相当于含相同浓度全部显色底物反应体系在λ I吸收与含相同浓度样品反应体系在λ I吸收的加和；A2tl为反应体系未生成任何显色产物前在λ 2的吸收,为来自反应体系的本底,相当于含浓度相同全部显色底物的反应体系在λ 2吸收与含相同浓度样品反应体系在λ 2吸收的加和；当仅某种酶显色产物对另一种酶有竞争抑制作用时，确定显色产物A及显色产物B在λ 下和在λ2下的无干扰吸收变化曲线Ala和A2b;设初始显色底物A的浓度为Cl，初始显色底物B的浓度为C2 ;设酶B最大反应速度为VmB，由Vnfi换算成初速度所用预设显色底物浓度等于C2的93%，酶B对显色底物B的米氏常数为KmB ;如显色产物A对酶B为竞争性抑制，其竞争性抑制常数为Kia，酶B动力学方程为
权利要求
1.一种用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于包括下列步骤 a.确定用多波长吸收单通道同步测定多种酶活性所需显色底物组合 al根据待测酶的专一性筛选满足下列条件的显色底物组合所选显色团能分别用于制备待测酶的显色底物；所得这些显色底物组合中，将显色底物在对应待测酶作用下所得显色产物相对该显色底物的差吸收峰最大波长从大到小排列，相邻的显色产物差吸收峰最大波长之间相距大于30nm且尽量远；在按显色产物差吸收峰最大波长从大到小的排列中，除了显色产物差吸收峰最靠近红外端的显色底物外，每个显色底物在对应酶作用下所得显色产物差吸收峰最大波长，都与此排列中某个显色底物的最大等吸收波长相差小于25nm且尽量短； a2用步骤al所选显色团分别合成待测酶的对应显色底物并组合使用； b.在一个反应混合物或酶反应体系即单反应通道中，同步启动多个待测酶针对组合使用的显色底物混合物对应显色底物的专一催化反应； c.选择测量波长组合以显色产物差吸收峰最靠近红外端的显色底物为显色底物A，在显色底物A的显色产物差吸收峰最大波长下测定该显色产物吸收；在显色底物A的等吸收波长处测定其余待测酶显色产物或显色底物的吸收； d.在所选多个测量波长组合下，通过快速变换测量波长，多波长吸收同步测量实现同步跟踪单通道中多个待测酶的反应过程； e.基于无相互作用物质吸收的线性加和性建立消除反应通道中显色物质吸收重叠干扰的数据处理方法，获得消除吸收光谱重叠干扰后每个待测酶的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰且其底物浓度在对应酶米氏常数的3倍以上，用经典初速度法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰但所用显色底物浓度在该酶米氏常数的5%以上而低于米氏常数的3倍，联用经典初速度法和反应过程分析法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；当某个待测酶受反应体系中其自身和/或其它酶的底物和/或产物的干扰时，将描述反应体系动力学的微分速度方程组数值积分后分析活性受到干扰待测酶反应的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线，确定其最大反应速度表示其活性，或据其微分速度方程和所得最大反应速度换算成底物浓度为起始底物浓度93 %时初速度表示该待测酶的活性。
2.根据权利要求I所述用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于显色产物相对显色底物差吸收峰最大波长在300nm以上且其显色底物吸收峰最大波长小于其对应显色产物吸收峰最大波长，否则测定该酶催化逆反应的速度表示该酶的活性；显色产物差吸收峰最大波长相邻的任两个显色底物中，显色产物差吸收峰最大波长更靠近红外端显色底物的最大等吸收波长与显色产物差吸收峰最大波长更靠近紫外端显色产物的差吸收峰最大波长相等或相距不超过5nm为优化的显色底物组合；所用显色底物组合中每个显色底物都仅被样品中的一种待测酶作用生成对应显色产物，而不被样品中其它任何酶作用或作用效果不明显；步骤b中，选择适于同步测定活性的待测酶发挥作用的缓冲介质和反应条件，即缓冲介质PH位于pH 5. O到9. O之间且接近比活性最低待测样品的最适PH，所用反应温度在摄氏20到40度之间。
3.根据权利要求2所述的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于所述显色底物包括天然显色底物和非天然显色底物；天然显色底物包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；非天然显色底物由显色团和被酶识别基团组成，显色团包括但不限于4-硝基苯酚、4-硝基苯硫酚、4-硝基苯胺、4-硝基-I-萘酚、4-硝基-I-萘硫酚、4-硝基-I-萘胺、2-萘酚、4-氯苯酚、玫红酸或这些芳香酚及芳香胺的衍生物。
4.根据权利要求1、2或3所述的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于采用两波长吸收单通道同步测量两种酶活性 步骤a中，将两种待测酶分别命名为酶A和酶B，所需两种显色团分别为显色团A和显色团B，对应的两种显色底物分别为显色底物A和显色底物B，在两种待测酶作用下生成的两种显色产物分别为显色产物A和显色产物B，这些显色底物及显色产物的组合需满足下列条件(I)显色产物A差吸收峰最大波长Xl靠近红外端，显色产物B差吸收峰最大波长X2靠近紫外端，显色产物B差吸收峰最大波长X2与显色产物A差吸收峰最大波长Xl相距大于30nm且尽量远；(2)显色产物A的最大等吸收波长为Yl且与显色产物B差吸收峰最大波长X2相距小于25nm且尽量短； 步骤b、c和d中，在一个反应通道同步启动样品中两种酶针对显色底物A和显色底物B的反应，并得到显色产物A和显色产物B ;选择显色产物A的差吸收峰最大波长Xl为λ I测定显色产物A吸收，选择显色产物A的最大等吸收波长Yl为λ 2处测定显色产物B吸收；通过快速变换测量波长，两波长吸收同步测量同步跟踪单通道中两种待测酶的反应过程；步骤e中，基于吸收的线性加和性建立消除多种物质吸收重叠干扰的数据处理方法，获得消除吸收光谱重叠后两个待测酶的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰且其底物浓度在对应酶米氏常数的3倍以上，则用经典初速度法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰但所用底物浓度在该酶米氏常数的5%以上而低于米氏常数的3倍，联用经典初速度法和反应过程分析法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；当某个待测酶受到反应体系中其自身或其它酶的底物或产物的干扰时，将描述反应体系动力学的微分速度方程组数值积分后分析活性受到干扰待测酶反应的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线，确定其最大反应速度表示其活性，或据其微分速度方程和所得最大反应速度换算成底物浓度为起始底物浓度93%时初速度表示酶活性；以显色产物A差吸收峰最大波长前后不超过25nm的波长为λ I并测定在此波长下吸收为Al，以显色产物A和显色底物A最大等吸收波长附近不超过25nm的波长为λ 2下并测定此波长下吸收为Α2，基于吸收线性加和性消除多种物质吸收重叠干扰计算无干扰的显色产物或底物吸收，需解下列二元一次方程组A1=A10 + Ε31ΧΡ1+Ε34ΧΡ2A2=A20 Ε32 X PJE35 X P2 进一步可转变成如下二元一次方程组A1=A10 + Ala+R33XA2bA2=A20 + A2b+R31 XAla 其中R31=E32/E31R33=E34/E35 上述公式中，P1为显色产物A瞬时浓度；P2为显色产物B瞬时浓度；E31为显色产物A与显色底物A在λ I下差摩尔消光系数；Ε32为显色产物A与显色底物A在λ 2下差摩尔消光系数Ε32 ；Ε34为显色产物B与显色底物B在λ I下差摩尔消光系数；Ε35为显色产物B与显色底物B在λ 2下差摩尔消光系数A1为校正吸收干扰前在λ I瞬时总吸收，A2为校正吸收干扰前在λ 2瞬时总吸收；Ala为校正吸收干扰后显色产物A在λ I瞬时净吸收，其等于P1和Ε31乘积，A2b为校正吸收干扰后显色产物B在λ 2瞬时净吸收，其等于P2和Ε35乘积汸1(|为反应体系未生成任何显色产物前在λ I的吸收,为来自反应体系的本底,相当于含相同浓度全部显色底物反应体系在λ I吸收与含相同浓度样品反应体系在λ I吸收的加和；八2(|为反应体系未生成任何显色产物前在λ 2的吸收,为来自反应体系的本底,相当于含浓度相同全部显色底物的反应体系在λ 2吸收与含相同浓度样品反应体系在λ 2吸收的加和； 上述计算公式中，酶A将显色底物A转变成显色产物A的计量关系为1: 1，酶B将显色底物B转变成显色产物B的计量关系也为1:1; 如反应通道中某种酶的底物或产物抑制或激活另一种酶，则如下测量被干扰酶活性 获得两种显色底物或显色产物的无干扰吸收变化曲线，据此换算出产生干扰作用物质的浓度变化曲线；用含干扰作用微分动力学方程数值积分计算理论反应曲线拟合被干扰酶显色底物或显色产物的无干扰吸收变化曲线，对应最好拟合的最大反应速度Vm为无干扰时的待测酶活性；据该酶的微分动力学方程、Vm和其初始底物浓度的93%，计算在刚启动反应时干扰物质还没有明显积累的初速度表示该待测酶活性； 当仅一种酶显色产物对另一种酶有竞争抑制作用时，先确定显色产物A及显色产物B在λ 下和在λ2下的无干扰吸收变化曲线Ala和A2b;设初始显色底物A的浓度为Cl，初始显色底物B的浓度为C2 ;设酶B最大反应速度为VmB，由Vnfi换算成初速度所用预设显色底物浓度等于C2的93%，酶B对显色底物B的米氏常数为KmB ;如显色产物A对酶B为竞争性抑制，其竞争性抑制常数为Kia，酶B动力学方程为
5.根据权利要求4所述的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，特征在于 步骤a中，如下选择显色团A和显色团B组合显色产物A的最大等吸收波长Yl与显色产物B差吸收峰最大波长X2相等或相距不超过5nm ； 步骤c中，选择产物A差吸收峰最大波长Xl为λ I后，如下选择测量波长λ 2 :显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数在显色产物A最大等吸收波长Yl处高于在显色产物B差吸收峰最大波长Χ2处的30%，则选择显色产物A最大等吸收波长Yl为λ 2，否则，用最靠近显色产物A最大等吸收波长Yl的显色产物B差吸收峰波长为λ 2，或最靠近显色产物B差吸收峰且其它待测显色显色产物与显色显色底物差摩尔消光系数都小于显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数20%的波长为λ 2测量显色产物B吸收； 步骤e中，需测定R31为显色产物A吸收干扰的校正系数；测定R31时，仅用酶A所需的全部显色底物而不加其它待测酶的任何显色底物，使反应体系无来自显色底物B及显色产物B在两个测量波长λ I和λ 2的吸收，此时同步测定反应通道中在两个测量波长下的吸收变化，直到在λ 2吸收变化大于O. 005或在λ I吸收变化大于O. 500 ;以在λ I下吸收为横坐标，在λ 2下吸收为纵座标进行回归分析，所得回归直线斜率为校正系数R31 ； 步骤e中，需测定R33为显色产物B吸收干扰的校正系数；测定R33时，仅用酶B所需的全部显色底物而不加其它待测酶的任何显色底物，使反应体系无来自显色底物A及显色产物A在两个测量波长λ I和λ 2的吸收，此时同步测定反应通道中在两个测量波长下的吸收变化，直到在λ 2吸收变化大于O. 500或在λ I吸收变化大于O. 005 ;以在λ 2下吸收为横坐标，在λ I下吸收为纵座标进行回归分析，所得回归直线斜率为校正系数R33。
6.根据权利要求4或5所述的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于 与酶A对应的显色底物包括水解反应最大等吸收波长在310到330nm间的4-硝基苯基乙酸酯，水解反应最大等吸收波长在330到350nm间的4-硝基苯基磷酸酯、4-硝基苯基硫酸酯、4-硝基苯基-β -D-半乳糖苷和Y -谷氨酰基-4-硝基苯胺，还原反应最大等吸收波长在350到370nm间的5-巯基-2-硝基苯甲酸及5-巯基-2-硝基苯乙酸对应显色底物为二硫化物可被酶作用所释放的硫醇还原；与此类酶A的显色底物A对应的酶B的显色底物B主要是天然显色底物，包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸； 与显色底物A对应的酶A包括但不限于芳香酯酶、磷酸酶、硫酸酯酶、Y -谷氨酰基转移酶、天然氨基酸α-羧基对应的酰胺酶和糖苷酶；与此类酶A对应的酶B包括但不限于乳酸脱氢酶LDH、苹果酸脱氢酶MDH、偶联LDH的谷丙转氨酶和偶联MDH的谷草转氨酶。
7.根据权利要求1、2或3所述的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于采用三波长吸收单通道同步测量三种酶活性 步骤a中，将三种待测酶分别命名为酶A、酶B和酶C，所需显色底物分别为显色底物A、显色底物B和显色底物C，在对应酶作用下生成显色产物分别为显色产物A、显色产物B和显色产物C ;这些显色底物和显色产物的组合需满足下列条件(I)显色产物A差吸收峰最大波长为Xl且最靠近红外端，显色产物C差吸收峰最大波长为X3且最靠近紫外端，显色产物B差吸收峰最大波长为X2且位于Xl和X3之间，X2与Xl及X3相距都大于30nm且尽量远；(2)显色产物A的最大等吸收波长为Yl且次大等吸收波长为Ys ;显色底物B生成显色产物B的最大等吸收波长为Y2且与Yl相距尽量远而和Ys相距尽量短；(3) Yl与X2相距小于25nm且相距尽量短；Y2和Ys及Χ3相距都小于25nm且相距尽量短； 步骤b中，在一个反应通道同步启动三种酶针对显色底物A、显色底物B和显色底物C的反应，并得到对应的显色产物A、显色产物B和显色产物C ； 步骤c中，以显色产物A差吸收峰最大波长Xl或相距25nm以内波长为λ I测定显色产物A吸收，选择显色产物A最大等吸收波长Yl或相距25nm以内波长为λ 2测定显色产物B吸收，选择显色产物B最大等吸收波长Υ2或相距25nm以内波长为λ 3测定显色产物C吸收； 步骤d中，通过快速变换测量波长，三波长吸收同步测量实现同步跟踪单个反应体系中两种样品的反应过程； 步骤e中，先建立消除多种物质吸收重叠干扰的数据处理方法，获得消除吸收光谱重叠后每个待测酶的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线；某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰且其底物浓度在对应酶米氏常数的3倍以上，则用经典初速度法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰但所用底物浓度在该酶米氏常数的5%以上而低于米氏常数的3倍，联用经典初速度法和反应过程分析法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；当某个待测酶受到反应体系中其自身或其它酶的底物或产物的干扰时，将描述反应体系动力学的微分速度方程组数值积分后分析活性受到干扰待测酶反应的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线，确定其最大反应速度表示其活性，或据其微分速度方程和所得最大反应速度换算成底物浓度为起始底物浓度93%时初速度表示酶活性；基于吸收线性加和性消除多种物质吸收重叠干扰需解如下三元一次方程组 A1=A10 + Ala+R33 X A2b+R35 X A3c A2=A20 + A2b+R31 X Ala+R36 X A3c A3=A30 + ASc+R32 X Ala+R34 X A2b 其中R31=E32/E31R32=E33/E31R33=E34/E35R34=E36/E35 R35=E37/E39R36=E38/E39 上述公式中，A1为校正吸收干扰前在λ I瞬时吸收，A2为校正吸收干扰前在λ 2瞬时吸收，A3为校正吸收干扰前在λ 3瞬时吸收;Ala为校正吸收干扰后显色产物A在λ I瞬时净吸收，A2b为校正吸收干扰后显色产物B在λ 2瞬时净吸收，Α3。为校正吸收干扰后显色产物C在λ 3瞬时净吸收；Α1(Ι为反应体系未生成任何显色产物前在λ I吸收，A20为反应体系未生成任何显色产物前在λ 2吸收，A30为反应体系未生成任何显色产物前在λ 3吸收；Ε31为显色产物A与显色底物A在λ I下差摩尔消光系数，Ε32为显色产物A与显色底物A在λ 2下差摩尔消光系数，Ε33为显色产物A与显色底物A在λ 3下差摩尔消光系数；Ε34为显色产物B与显色底物B在λ I下差摩尔消光系数，Ε35为显色产物B与显色底物B在λ 2下差摩尔消光系数，Ε36为显色产物B与显色底物B在λ 3下差摩尔消光系数；Ε37为显色产物C与显色底物C在测量波长λ I下差摩尔消光系数，Ε38为显色产物C与显色底物C在测量波长λ 2下差摩尔消光系数，Ε39为显色产物C与显色底物C在测量波长λ 3下差摩尔消光系数；上述公式中，显色底物A转变成显色产物A计量关系为I: I ;显色底物B转变成显色产物B的计量关系为I: I ;显色底物C转变成显色产物C的计量关系为1:1; 如反应通道中某种酶的底物或产物抑制或激活另一种酶，则如下测量被干扰酶活性 获得两种显色底物或显色产物的无干扰吸收变化曲线，据此换算出产生干扰作用物质的浓度变化曲线；用含干扰作用微分动力学方程数值积分计算理论反应曲线拟合被干扰酶显色底物或显色产物的无干扰吸收变化曲线，对应最好拟合的最大反应速度Vm为无干扰时的待测酶活性；据该酶的微分动力学方程、Vm和其初始底物浓度的93%，计算在刚启动反应时干扰物质还没有明显积累的初速度表示该待测酶活性； 当仅一种酶显色产物对另一种酶有竞争抑制作用时，先确定显色产物A及显色产物B在λ 下和在λ2下的无干扰吸收变化曲线Ala和A2b;设初始显色底物A的浓度为Cl，初始显色底物B的浓度为C2 ;设酶B最大反应速度为VmB，由Vnfi换算成初速度所用预设显色底物浓度等于C2的93%，酶B对显色底物B的米氏常数为KmB ;如显色产物A对酶B为竞争性抑制，其竞争性抑制常数为Kia，酶B动力学方程为
8.根据权利要求7所述的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于采用三波长吸收单通道同步测量三种酶活性 步骤a中，可用如下原则选择显色底物组合所用显色底物A、显色底物B及显色底物C使显色产物A的最大等吸收波长Yl与显色产物B差吸收峰最大波长X2相等或相距不超过5nm、显色产物B最大等吸收波长Y2和显色产物A次大等吸收波长Ys及显色产物C差吸收峰最大波长X3之间相等或任两者相距都不超过5nm ； 步骤c中，选择显色产物A差吸收峰最大波长Xl为λ I后，按如下原则选择另外两个测量波长λ 2和λ 3 :显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数在显色产物A最大等吸收波长Yl处高于显色产物B与显色底物B在二者差吸收峰最大波长Χ2处差摩尔消光系数的30%时，选择Yl为测量波长λ 2，否则，用最靠近显色产物A最大等吸收波长Yl的显色产物B差吸收峰波长，或靠近显色产物B差吸收峰且其它显色产物与显色显色底物差摩尔消光系数都小于显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数20%的波长为λ 2测量显色产物B吸收；显色产物C与显色底物C差摩尔消光系数在显色产物A次大等吸收波长Ys处或显色产物B与显色底物B最大等吸收波长Υ2处应高于二者在其差吸收峰最大波长Χ3处差摩尔消光系数的30%时，则选择Υ2或Ys为为λ 3测量显色产物B吸收，否则用最靠近显色产物B最大等吸收波长Υ2或显色产物A次大等吸收波长Ys或靠近显色产物C差吸收峰最大波长且其它显色产物与显色底物差摩尔消光系数都小于显色产物C与显色底物C差摩尔消光系数20%的波长为λ 3测量显色产物C吸收； 步骤e中需测定显色产物A吸收干扰校正系数R31和R32 ;测定时仅用酶A的全部显色底物而不用其它待测酶的任何显色底物，使反应体系无来自显色底物B及显色产物B、显色底物C及显色产物C在λ I、λ 2和λ 3的吸收，同步测定反应通道中三个波长下的吸收变化，直到在λ 2及λ 3吸收变化都大于O. 005或在λ I吸收变化大于O. 500 ;以在λ I下吸收变化为横坐标，在λ 2下和在λ 3下吸收变化为纵座标进行回归分析，所得在λ 2下吸收变化回归直线斜率为校正系数R31，在λ 3下吸收变化回归直线斜率为校正系数R32 ；步骤e中需测定显色产物B吸收干扰校正系数R33和R34 ;测定时仅用酶B的全部显色底物而不用其它待测酶的任何显色底物，使反应体系无来自显色底物A及显色产物A、显色底物C及显色产物C在λ I、λ 2和λ 3的吸收，同步测定反应通道中三个波长下的吸收变化，直到在λ 2及λ 3吸收变化都大于O. 005或在λ I吸收变化大于O. 500 ;以在λ 2下吸收变化为横坐标，在λ I下和在λ 3下吸收变化为纵座标进行回归分析，所得在λ I下吸收变化回归直线斜率为校正系数R33，在λ 3下吸收变化回归直线斜率为校正系数R34 ；步骤e中需测定显色产物C吸收干扰校正系数R35和R36 ;测定时仅用酶C的全部显色底物而不用其它待测酶的任何显色底物，使反应体系无来自显色底物A及显色产物A、显色底物B及显色产物B在λ I、λ 2和λ 3的吸收，同步测定反应通道中三个波长下的吸收变化，直到在λ 2及λ I吸收变化都大于O. 005或在λ 3吸收变化大于O. 500 ;以在λ 3下吸收变化为横坐标，在λ I下和在λ 2下吸收变化为纵座标进行回归分析，所得在λ I下吸收变化回归直线斜率为校正系数R35，在λ 2下吸收变化回归直线斜率为校正系数R36。
9.根据权利要求7或8所述的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于 步骤a中，与酶A对应显色底物A包括4-硝基-I-萘基磷酸酯且其水解两个等吸收波长分别在315到335nm之间及395到415nm之间、4-硝基-I-萘基硫酸酯且其水解两个等吸收波长分别在315到335nm之间及395到415nm之间、4-硝基-I-萘基乙酸酯且其水解时两个等吸收波长分别在310到330nm之间及375到395nm之间、4-硝基-I-萘基-D-半乳糖苷且其水解时两个等吸收波长分别在320到345nm之间及390到410nm之间、4-硝基-I- (N-赖氨酰)萘胺且其水解的最大等吸收波长分别在385到410nm之间，这些显色底物A被酶A作用生成4-硝基-I-萘酚或4-硝基-I-萘胺或其衍生物作为显色产物A ;与此类显色底物A对应的显色底物B主要是4-硝基苯酚或4-硝基苯胺衍生物，在相应的酶B作用下生成显色产物B为4-硝基苯酚或4-硝基苯胺或4-硝基苯基硫醇；与此类显色底物A和显色底物B对应的显色底物C包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸； 与显色底物A对应酶A包括但不限于芳香酯酶、磷酸酶、硫酸酯酶、Y -谷氨酰基转移酶、肽酶即天然氨基酸α -羧基对应的酰胺酶和糖苷酶；与显色底物B对应的酶B包括与已选酶A不同但属于酶A的其它水解酶；与显色底物C对应的酶包括但不限于乳酸脱氢酶LDH、苹果酸脱氢酶MDH、偶联LDH的谷丙转氨酶和偶联MDH的谷草转氨酶。
全文摘要
本发明公开了一种用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法；基于光吸收线性加和性及酶显色底物与其对应显色产物的等吸收波长，建立多波长吸收同步测量单通道同步测定多种酶活性所需显色底物组合设计原理及消除吸收光谱重叠干扰的数据处理方法，并以数值积分的速度方程分析酶反应过程测定最大反应速度消除各种底物及产物对待测酶活性的干扰，使单通道同步测定多种酶活性的范围及检测限都与单独测定时相当；该方法可用于同步测定生物样品多种酶活性、酶标记免疫分析同步测定多组分含量、同步筛选不同靶酶的抑制剂，可用于临床生化分析和临床免疫检验、卫生检验、酶抑制剂筛选等常规实践，也可用于这类酶法分析技术适用的各种基础研究。
文档编号G01N21/31GK102879343SQ20121035560
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者廖飞, 杨晓兰, 刘红博, 党济政, 龙高波, 李元丽, 刘霖 申请人:重庆医科大学