专利名称：用于检测触酶阳性菌的电流型酶电极及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物传感技术领域的装置及其制备方法，具体是一种用于检 测触酶阳性菌的电流型酶电极及其制备方法。
背景技术：
触酶阳性菌是指能产生过氧化氢酶的细菌，它们广泛存在于各类食品中。许多触 酶阳性菌，包括大肠埃希氏菌、李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌 等在病原学上作为人畜共患和食源性疾病的致病菌已得到世界范围的普遍公认，直接威胁 到人类健康。因此建立一种快速有效的检测食品中金黄色葡萄球菌的方法，对于保障食品 安全及公众健康具有重要实用价值。目前检测触酶阳性菌的方法主要是传统的细菌鉴定法、聚合酶链反应、酶联免疫 分析方法等，传统的细菌检测方法操作繁琐、耗时长；免疫检测特异性强、灵敏度高，但通常 只能用于检测单一病原菌且需要相关精密仪器及专业操作人员，无法满足现场大通量快速 检测食品中常见触酶阳性污染菌的需要。经对已有相关文献和专利的检索发现，中国专利申请号为CN101498666A，
公开日
2009-8-5，记载了一种“荧光法快速测定活细菌总数”的方法，该技术通过荧光分光光度计 测定细菌胞内NADH的荧光强度，可快速测定出活体细胞的总数。该方法需先提取细菌胞内 NADH，操作复杂，稳定性不高，检测限较高，且检测成本较高，不适合现场大通量快速检测。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种用于检测触酶阳性菌的电流型酶 电极及其制备方法，通过生物传感技术来快速检测食品中触酶阳性菌，本发明制备所得电 极具有灵敏度高、不需细菌培养的优点，且通过置换不同的一次性的电极条即可实现多个 样品的连续检测，操作简单，易于产业化推广，在食品细菌污染监控方面具有重要的实用价 值。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及一种用于检测触酶阳性菌的电流型酶电极，包括电极基片、接线端 子、电极连线、工作电极、对电极、绝缘层和反应底物膜，其中接线端子、电极连线、工作电 极和对电极分别设置于电极基片和绝缘层之间，工作电极位于对电极中间且留有间隙，两 根电极连线的一端分别与工作电极或对电极相连接，两根电极连线的另一端分别与两个接 线端子相连接，反应底物膜位于工作电极和对电极上方。所述的电极基片为聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或聚乙烯中的一种或其组合制 成，优选聚氯乙烯，电极基片为片材或卷材，其长度为35 38mm，宽度为9 10mm，厚度为 0. 4 ~ 0. 45mm。所述的接线端子为导电银浆薄膜或导电碳浆薄膜制成，其长度为9 10mm，宽度 为1 L 2mm。
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所述的电极连线为导电材料薄膜制成，其长度为20 25mm，宽度为0. 8 1mm。所述的工作电极为圆形块状导电材料薄膜制成，为直径1mm的实心块状。所述的对电极为半圆环形块状导电材料薄膜制成，其外径为4mm、内径为2mm。所述的反应底物膜为辣根过氧化物酶制成，其直径为5 6mm，厚度为80 100 u m。所述的两条平行电极连线之间的间距为2. 8 3mm。所述的绝缘层为聚氯乙烯制成。本发明涉及上述用于测试食品中触酶阳性菌的电流型酶电极的制备方法，包括以 下步骤第一步、将导电银浆或导电碳浆丝网印刷在电极基片上分别制成工作电极、对电 极、电极连线和接线端子，然后在中间部分的电极连线表面涂覆一层聚氯乙烯绝缘体，经抛 光处理和酸蚀处理后进行清洗，制成一次性丝网印刷电极所述的抛光处理是指用300nm的二氧化钛纳米粉对工作电极以及对电极进行抛 光1 2min ；所述的酸蚀处理是指用质量百分比为50%的硝酸浸泡电极基片1 3min ；第二步、在一次性丝网印刷电极的工作电极与对电极表面采用涂布法用涂布器涂 覆一层壳聚糖膜，然后通过滴加辣根过氧化酶液并低温冷冻，制成电流型酶电极；所述的壳聚糖膜是利用三蒸水配制的质量百分比为3%壳聚糖溶液低温干燥而 成；所述的辣根过氧化酶的用量为1 5 y L，其浓度为3mg/mL ；所述的低温冷冻是指将一次性丝网印刷电极置于4°C保存备用；利用本发明检测食品中触酶阳性菌的具体操作方法为将食品样品与适当含量的 过氧化氢及电子增强剂盐酸邻联甲苯胺混合反应5 10分钟，然后将此混合产物滴加到电 极反应区，用微型电流仪或电化学工作站记录电流响应信号及推算出食品中触酶阳性菌含 量。本发明测试原理如下先将食品中的触酶阳性菌与适量过氧化氢进行反应，然后利用基于辣根过氧化物 酶的生物传感体系来检测剩余的过氧化氢量，由于传感器响应电流值与的剩余过氧化氢量 呈线性关系，从而可利用此传感体系来间接测试食品样品中的触酶阳性菌污染指数。在本 发明的具体实施过程中，先设计并制备出丝网印刷电极，然后将辣根过氧化物酶固定于丝 网印刷电极的反应区。在测试时，将食品中的触酶阳性菌与适当含量的过氧化氢及电子增 强剂盐酸邻联甲苯胺混合反应一段时间后，将此混合产物滴加到电极反应区，用微型电流 仪或电化学工作站记录电流响应信号及推算出食品中触酶阳性菌含量。本发明具有下列优点灵敏度高、重复性好、使用范围广泛。本发明的一次性电流型酶电极检测限能达到 103CFU/mL，重复样品检测相对标准差(RSD)为1. 8%，其适用范围十分广阔。本发明结构简单、操作简便快速，免除了传统细菌检测方法中细菌培养和检测过 程中必须的无菌条件，因此可用于食品中触酶阳性菌的直接快速检测；检测时间短，按测试 程序操作5秒内即可得出结果，非专业人员可在几分钟内学会。
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本发明的检测结果形象、准确。一次性电流型酶电极通过电化学分析方法直接判 定结果，同时还可直观以显色程度进行判断，背景清晰，无人为操作误差。本发明的一次性电流型酶电极有效期长、成本低、易于产业化制作。酶电极能有效 保存一年以上，可批量生产，成本低廉，在食品中触酶阳性菌现场快速检测领域具有很广泛 的应用前景。
图1为本发明平面示意图。图2为本发明结构示意图。图3为本发明效果示意图；其中图3a为电流型酶电极检测触酶阳性菌时间-电流曲线图；图3b为触酶阳性 菌与电流的标准曲线图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。实施例1如图1和图2所示，本实施例制备所得的用于测试食品中触酶阳性菌的电流型酶 电极电极，包括电极基片1、接线端子2、电极连线3、工作电极4、对电极5、绝缘层6、反应 底物膜7，其中接线端子2、电极连线3、工作电极4和对电极5分别设置于电极基片1和 绝缘层6之间，工作电极4位于对电极5中间且留有间隙，两根电极连线3的一端分别与工 作电极4或对电极5相连接，两根电极连线3的另一端分别与两个接线端子2相连接，反应 底物膜7位于工作电极4和对电极5上方。所述电极基片1，长37mm、宽9mm、厚0. 4mm。所述接线端子2，长9mm、宽1mm。所述电极连线3，长24mm、宽1_。所述工作电极4，为直径1mm的实心块状。所述对电极5，为外直径4mm、内直径2mm的半圆环形实心块状。所述反应底物膜7，直径5mm，厚80 y m。所述两条平行电极连线之间的间距为2. 8mm。所述电极基片为聚氯乙烯。所述的工作电极形状为圆形块状，对电极形状为与工作电极同心相离的半圆环形 块状。所述绝缘材料为PVC (聚氯乙烯)。采用丝网印刷技术将导电银浆在电极基片上印刷上电极基体，它们上端分别为裸 露的工作电极与对电极，中间部分的电极连线表面上涂覆一层聚氯乙烯绝缘体，下端为相 互平行的接线端子。用300nm的二氧化钛纳米粉将电极抛光，再用质量百分比为50%的硝 酸浸泡处理，最后用蒸馏水冲洗三次。用涂布法在工作电极和对电极上涂布一层质量百分比为3%的水溶性壳聚糖，晾干，然后滴加3mg/mL辣根过氧化酶3 u L，4°C晾干，最后将做好 的电极条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封于4°C保存。在实际测试样品时，将电流型酶电极固定于微电流检测仪内，并使含菌的食品样 品与适当含量过氧化氢及电子增强剂盐酸邻联甲苯胺混合反应8分钟，然后取反应后的混 合产物30 y L，滴加到电极反应区，用微型电流仪或电化学工作站记录电流响应信号及推算 出食品中触酶阳性菌含量。以下结合实际操作来介绍触酶阳性菌检测电流型酶电极的使用。(1)触酶阳性菌的培养和筛选用无菌注射器取食品样品浸出清液5ml接种到 100ml上述培养基，37°C摇床培养24h ；划平板进行触酶阳性菌分离，挑取单菌落再接种到 20ml培养基，37°C摇床培养24h，通过过氧化氢实验进行粗�。舫龆怨趸夥从衔� 烈的菌种，接种于20ml上述培养基37°C增菌培养。(2)电流型酶电极检测触酶阳性菌操作程序首先将触酶阳性菌液用无菌培养基 配成不同浓度梯度，分别为103 109CFU/mL。采用500 yL测试杯，在测试杯中依次加入菌 液100iil、0.01mOl/L盐酸邻联甲苯胺溶液100iil、0.015%过氧化氢溶液100 yl，室温反 应5分钟。吸取30 y L混合液于酶修饰电极的反应区，反应10分钟后测定并记录电极的 时间电流值，采用本发明研制的电流型酶电极检测触酶阳性菌，最低检测限能达到103CFU/ mL,当触酶阳性菌浓度为104 108CFU/mL时，电流值与触酶阳性菌浓度呈良好线性关系，满 足线性方程Y = -3. 29(lgX)+31.79，见图3(3)重复性试验用不同批次制作的电流型酶电极重复检测5次不同稀释倍数的 触酶阳性菌液，重复样品检测相对标准差(RSD)2.8%，结果准确率达到95%以上。采用该 电流型酶电极检测食品中的触酶阳性菌，结果准确、重复性好、检测时间短、样品前处理简 单，并且该电极条成本低、可大批量生产，从而可以实现现场大通量触酶阳性菌的快速检 测。实施例2在丝网印刷电极的制备过程中，除电极基片选用聚苯乙烯外，其他与实施例1同。实施例3在丝网印刷电极的制备过程中，丝网印刷电极接线端子、电极连线、工作电极和对 电极均用导电碳浆印制，其他与实施例1同。
权利要求
一种用于检测触酶阳性菌的电流型酶电极，包括电极基片、接线端子、电极连线、工作电极、对电极、绝缘层和反应底物膜，其特征在于接线端子、电极连线、工作电极和对电极分别设置于电极基片和绝缘层之间，工作电极位于对电极中间且留有间隙，两根电极连线的一端分别与工作电极或对电极相连接，两根电极连线的另一端分别与两个接线端子相连接，反应底物膜位于工作电极和对电极上方。
2.根据权利要求1所述的用于检测触酶阳性菌的电流型酶电极，其特征是，所述的电 极基片为聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或聚乙烯中的一种或其组合制成，电极基片为片材 或卷材。
3.根据权利要求1所述的用于检测触酶阳性菌的电流型酶电极，其特征是，所述的接 线端子为导电银浆薄膜或导电碳浆薄膜制成。
4.根据权利要求1所述的用于检测触酶阳性菌的电流型酶电极，其特征是，所述的反 应底物膜为辣根过氧化物酶制成。
5.一种根据权利要求1所述的用于检测触酶阳性菌的电流型酶电极的制备方法，其特 征在于，包括以下步骤第一步、将导电银浆或导电碳浆丝网印刷在电极基片上分别制成工作电极、对电极、电 极连线和接线端子，然后在中间部分的电极连线表面涂覆一层聚氯乙烯绝缘体，经抛光处 理和酸蚀处理后进行清洗，制成一次性丝网印刷电极；第二步、在一次性丝网印刷电极的工作电极与对电极表面采用涂布法用涂布器涂覆一 层壳聚糖膜，然后通过滴加辣根过氧化酶液并低温冷冻，制成电流型酶电极。
6.根据权利要求5所述的用于检测触酶阳性菌的电流型酶电极的制备方法，其特征 是，所述的抛光处理是指用300nm的二氧化钛纳米粉对工作电极以及对电极进行抛光1 2min。
7.根据权利要求5所述的用于检测触酶阳性菌的电流型酶电极的制备方法，其特征 是，所述的酸蚀处理是指用质量百分比为50%的硝酸浸泡电极基片1 3min。
8.根据权利要求5所述的用于检测触酶阳性菌的电流型酶电极的制备方法，其特征 是，所述的壳聚糖膜是利用三蒸水配制的质量百分比为3%壳聚糖溶液低温干燥而成。
9.根据权利要求5所述的用于检测触酶阳性菌的电流型酶电极的制备方法，其特征 是，所述的辣根过氧化酶的用量为1 5μ L，其浓度为3mg/mL。
10.根据权利要求5所述的用于检测触酶阳性菌的电流型酶电极的制备方法，其特征 是，所述的低温冷冻是指将一次性丝网印刷电极置于4°C保存备用。
全文摘要
一种生物传感技术领域的用于检测触酶阳性菌的电流型酶电极及其制备方法，包括电极基片、接线端子、电极连线、工作电极、对电极、绝缘层和反应底物膜，其特征在于接线端子、电极连线、工作电极和对电极分别设置于电极基片和绝缘层之间，工作电极位于对电极中间且留有间隙，两根电极连线的一端分别与工作电极或对电极相连接，两根电极连线的另一端分别与两个接线端子相连接，反应底物膜位于工作电极和对电极上方。本发明制备所得电极具有灵敏度高、不需细菌培养的优点，且通过置换不同的一次性的电极条即可实现多个样品的连续检测，操作简单，易于产业化推广，在食品细菌污染监控方面具有重要的实用价值。
文档编号G01N27/327GK101825603SQ201010148879
公开日2010年9月8日 申请日期2010年4月17日 优先权日2010年4月17日
发明者刘国艳, 刘晓芳, 姚冰, 柴春彦 申请人:上海交通大学
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