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专利名称：唾液预处理试剂盒及唾液预处理方法
技术领域：
本发明涉及通过利用抗原抗体反应的免疫层析法，用于鉴定和定量测定作为人唾液中存在的致龋细菌之一的变异链球菌(Streptococcimutans)的唾液预处理试剂盒，以及使用该唾液预处理试剂盒的唾液预处理方法。
背景技术：
已知人口腔内的变异链球菌的存在与龋齿的产生间有密切的关系，因此，如果可以简便地检查人口腔内变异链球菌的有无以及量，则可以了解患病风险和目前的患病状况，为相当多的人带来益处。
以住是实施在检查中利用抗原抗体反应的检查技术。例如，免疫酶技术，这是使用酶以发色浓度进行鉴定和定量测定的方法，为处理抗体和试样需要特殊的洗涤器和复杂精确的操作，并且为进行酶反应还需要温育器。另外，荧光抗体技术作为一种对与用荧光染料标记的抗体反应的抗原特异染色的方法不常使用，原因是需要荧光显微镜作为测定器。
因此，提出了多种简便地利用抗原抗体反应的技术。例如，利用层析法的测定技术(例如参照美国专利5,591,645号、4,855,240号、4,435,504号和4,980,298号，和日本专利申请JP-A-61-145459和JP-A-6-160388号公报)。该技术简便性优异，因为抗原的有无及量仅通过在含有要鉴定和定量测定的抗原的试验溶液中混入这样采集的体液，然后渗入检查器具中即可测定。该技术一般称为免疫层析技术，鉴定和定量测定的原理已有详细揭示(例如参照，Se-Hwan Peak，Seung-Hwa Lee，Joung-Hawan Cho和Young-Sang Kim，“Development ofrapid One-Step immunochromatographic assay，Methods”，22卷，53-60页(2000))。
看起来人口腔内的变异链球菌的鉴定和定量测定可以通过应用该技术实施，但由于存在下列问题该技术还没有投入实际应用。即，免疫层析技术使用的试样需要通过毛细管现象通过多孔膜。但是，由于变异链球菌这样的口腔细菌检查应用的主要试样是唾液，因此唾液中存在的称为粘蛋白的高粘性物质会阻塞多孔膜的孔。另外，由于粘蛋白具有将从口腔粘膜剥落的上皮附着细胞聚集的功能，所以多孔膜的孔被这些物质阻塞，从而阻碍了变异链球菌的通过。
除粘蛋白外，存在的另外一个问题是免疫层析技术把变异链球菌的鉴定和定量测定变得复杂。即，要测定的变异链球菌是自体直径约1μm的细菌，但由于链球菌的性质，经常形成由10-20个或更多个细菌构成的链，这可能是妨碍在多孔膜中移动的因素之一。另外，变异链球菌从食物中的蔗糖形成具有粘着性的葡聚糖，并且经常严重聚集。变异链球菌的链形成和聚集造成多孔膜中的阻塞，另外减少了链球菌的表面积，对变异链球菌表面存在的抗原数的定量测定产生影响，这降低了测定的准确性。
在免疫层析技术中，一般通过使用两个抗体进行分析对象的检测。第一抗体保持在由试样滴下那一侧的玻璃纤维等形成的多孔膜中，并且抗体一般用乳胶颗粒、金胶体颗粒等进行标记(以下有时称为标记抗体)。试样中存在要测定的对象时，当试样通过多孔膜时标记抗体识别要测定的分析对象并与其结合。分析对象与标记抗体的复合体通过毛细管现象向以例如带状固定有第二抗体(以下有时称为捕捉抗体)的另一多孔膜流动，并且识别、捕捉分析对象与标记抗体的复合体，并作为可见信号(此时呈带状)被检测出来。但是，免疫层析技术应用于作为试样的唾液时，标记抗体与变异链球菌的复合体被捕捉在保持标记抗体的膜中，但不能通过毛细管现象向固定有捕捉抗体的多孔膜有效流动，引起测定的准确性下降的问题。

发明内容
本发明的目的是通过利用抗原抗体反应的免疫层析法解决与鉴定和定量测定作为人唾液中的致龋细菌之一的变异链球菌的常规技术相关的问题，以及提供唾液预处理试剂盒及唾液预处理方法，其中可以以简便的操作消除由粘蛋白及变异链球菌的链形成引起的聚集，并且标记抗体与变异链球菌的复合体可以有效地从保持标记抗体的膜中流出。
本发明人为解决上述课题进行了认真的研究，结果发现，通过用特定的酸和碱溶液进行处理可以得到下面的效果，从而完成了本发明。
(1)唾液中的粘蛋白和葡聚糖溶解，作用于变异链球菌的外膜，从而抑制聚集。
(2)而且，通过使用特定的表面活性剂，变异链球菌中的蛋白质被增溶，从而变异链球菌可有效地流过多孔膜。
(3)此外，通过使用特定的金属盐，即氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁或硫酸锰，标记抗体与变异链球菌的复合体可以有效地从保持标记抗体的膜中流出。
一方面，本发明涉及唾液预处理试剂盒，含有(A)氢氧化钠水溶液，浓度为0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或柠檬酸的水溶液，浓度为0.01-3mol/L，和(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂，成分(C)与成分(A)和(B)的至少一个混合，或与成分(A)和(B)分别提供，并且选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质以5-25重量％的量包含在成分(A)、(B)和(C)的至少一个中。该方面中优选(D)三(羟甲基)氨基甲烷与成分(A)、(B)和(C)的至少一个混合。
另一方面，本发明还涉及唾液预处理试剂盒，含有(A)氢氧化钠水溶液，浓度为0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或柠檬酸的水溶液，浓度为0.01-3mol/L，(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂，和(D)含有三(羟甲基)氨基甲烷的水溶液，成分(C)与成分(A)、(B)和(D)的至少一个混合，或与成分(A)、(B)和(D)分别提供，并且选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质以5-25重量％的量包含在成分(A)、(B)、(C)和(D)的至少一个中。
具体实施例方式
在本发明的唾液预处理试剂盒中，优选作为成分(C)的非离子表面活性剂是选自聚乙二醇单辛基苯基醚、正辛基-β-D-葡糖苷、正庚基-β-D-硫葡糖苷、正辛基-β-D-硫葡糖苷、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(nonylphenoxypolyethoxyethanol)和聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯的一种、或两种以上的混合物，以及作为成分(C)的两性表面活性剂为选自CHAPS(3-((3-胆酰胺丙基)-二甲基铵基)-1-丙烷磺酸盐)和CHAPSO(3-((3-胆酰胺丙基)-二甲基铵基)-1-羟基丙烷磺酸盐)的一种、或两种以上的混合物。
一方面，通过利用本发明的唾液预处理试剂盒的免疫层析法鉴定和定量测定变异链球菌的唾液预处理方法包括下面的步骤将选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质以5-25重量％的量与选自下述(A)、(B)和(C)的至少一个混合(A)氢氧化钠水溶液，浓度为0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或柠檬酸的水溶液，浓度为0.01-3mol/L，和(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂；和通过以任意顺序滴下成分(A)、(B)和(C)将它们混合(以下称为第一方法)。
另一方面，通过免疫层析法鉴定和定量测定变异链球菌的唾液预处理方法也包括下面的步骤将选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质以5-25重量％的量与选自下述(A)和(B)的至少一个混合(A)氢氧化钠水溶液，浓度为0.01-10mol/L和(B)酒石酸和/或柠檬酸的水溶液，浓度为0.01-3mol/L；将(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂混入(A)和(B)的至少一个中；和通过以任意顺序滴下成分(A)和(B)将它们混合(以下称为第二方法)。
另一方面，通过免疫层析法鉴定和定量测定变异链球菌的唾液预处理方法包括下面的步骤将选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质以5-25重量％的量与选自下述(A)、(B)、(C)和(D)的至少一个混合(A)氢氧化钠水溶液，浓度为0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或柠檬酸的水溶液，浓度为0.01-3mol/L，(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂，和(D)三(羟甲基)氨基甲烷；和通过以成分(A)与成分(B)在成分(D)的存在下接触的顺序滴下成分(A)、(B)、(C)和(D)，将它们混合(以下称为第三方法)。
在第一方法中，优选将(D)三(羟甲基)氨基甲烷混入成分(A)、(B)和(C)的至少一个中，并且通过以成分(A)与成分(B)在成分(D)的存在下接触的顺序滴下成分(A)、(B)、和(C)，将它们混合。在第二方法中，优选将(D)三(羟甲基)氨基甲烷混入成分(A)和(B)的至少一个中，并通过以任意顺序滴下成分(A)和(B)将它们混合。在第三方法中，优选通过以成分(A)与成分(B)在成分(D)的存在下接触的顺序滴下成分(A)、(B)和(D)(其中至少一个与成分(C)混合)，将它们混合。
作为成分(A)用于本发明的唾液预处理试剂盒和唾液预处理方法中的浓度为0.01-10mol/L的氢氧化钠水溶液具有对唾液中的粘蛋白和存在于变异链球菌的外膜上的葡聚糖起作用，抑制变异链球菌聚集的功能，从而使作为抗原的变异链球菌在多孔膜中的移动变得容易。作为碱溶液的氢氧化钠的使用是必要的，但碳酸钠、磷酸氢二钠等不适合，使用氢氧化钠以外的碱溶液不能进行变异链球菌的检查。推测这是由于氢氧化钠以外的碱溶液可能损害变异链球菌的抗原的结构。水溶液中氢氧化钠的浓度为0.01-10mol/L是必要的，低于0.01mol/L的浓度不能得到充分的效果，而超过10mol/L时破坏变异链球菌的抗原，从而降低检测精度。
作为成分(B)用于本发明的唾液预处理试剂盒和唾液预处理方法中的浓度为0.01-3mol/L的酒石酸和/或柠檬酸的水溶液具有抑制变异链球菌的链形成的功能，从而使作为抗原的变异链球菌在多孔膜中的移动变得容易。酒石酸和/或柠檬酸作为酸使用是必要的，但其它酸，如盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、乳酸和马来酸是不适合的，并且即使其它酸与氢氧化钠组合使用，也不能得到目标检查精度。推测这是由于酒石酸和柠檬酸以外的酸可能损害变异链球菌的抗原的结构。水溶液中酒石酸和/或柠檬酸的浓度为0.01-3mol/L是必要的，低于0.01mol/L的浓度不能得到充分的效果，而超过3mol/L也不适合，原因是酒石酸和/或柠檬酸的溶解度到达了产生沉淀的极限。
作为成分(C)用于本发明的唾液预处理试剂盒和唾液预处理方法中非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂具有将变异链球菌表面的蛋白质增溶的功能，从而使变异链球菌有效通过多孔膜变得容易。离子表面活性剂经常用在免疫层析法中，用来促进试样溶液或抗原溶液在检查器内平滑移动。但是，实验结果证明在本发明的用于鉴定和定量测定变异链球菌的唾液预处理试剂盒和唾液预处理方法中使用的表面活性剂必须为非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂，但是通过十二烷基硫酸钠和十二烷基苯磺酸钠等阴离子表面活性剂不能进行通过抗体检测抗原。
本发明中使用的这样的表面性活剂可以是任何非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂而没有特别的限制，并且一般用作膜蛋白增溶剂的那些都可以使用。变异链球菌的检测灵敏度随使用的非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂的种类而变化，从检测灵敏度的角度考虑，优选使用选自聚乙二醇单辛基苯基醚、正辛基-β-D-葡糖苷、正庚基-β-D-硫葡糖苷和正辛基-β-D-硫葡糖苷的一种、或两种以上的混合物作为非离子表面活性剂，选自CHAPS(3-((3-胆酰胺丙基)-二甲基铵基)-1-丙烷磺酸盐)和CHAPSO(3-((3-胆酰胺丙基)-二甲基铵基)-1-羟基丙烷磺酸盐)的一种、或两种以上的混合物作为两性表面活性剂。
在本发明的唾液预处理试剂盒和唾液预处理方法中，非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂(C)以唾液处理后浓度为0.05-90重量％这样的方式使用是优选的。浓度低于0.05重量％时，由于存在抗原抗体反应的检测灵敏度降低的倾向因而不优选，当超过90重量％时，由于抗原抗体反应的检测灵敏度容易降低也不优选。
在本发明的唾液预处理试剂盒和唾液预处理方法中，非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂(C)可以与(A)浓度为0.01-10mol/L的氢氧化钠水溶液和(B)浓度为0.01-3mol/L的酒石酸和/或柠檬酸的水溶液分别提供，此时其可以是水溶液的形式。也可以以与(A)浓度为0.01-10mol/L的氢氧化钠水溶液和(B)浓度为0.01-3mol/L的酒石酸和/或柠檬酸的水溶液之一或两者的混合物的形式提供，此时酸和碱分解性必须予以注意。
在本发明的唾液预处理试剂盒和唾液预处理方法中，在(A)浓度为0.01-10mol/L的氢氧化钠水溶液、(B)浓度为0.01-3mol/L的酒石酸和/或柠檬酸的水溶液和(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂的至少一个中，以5-25重量％的量含有选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质，以使标记抗体与变异链球菌的复合体从保持标记抗体的膜中有效流出。选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质具有通过盐析使唾液中存在的各种蛋白质聚集并抵消标记抗体与保持该抗体的膜间的相互作用的功能，从而通过该功能提供促进标记抗体与变异链球菌的复合体从保持标记抗体的膜中有效流出的效果。
选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质以5-25重量％的量包含在(A)浓度为0.01-10mol/L的氢氧化钠水溶液、(B)浓度为0.01-3mol/L的酒石酸和/或柠檬酸的水溶液和(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂的至少一个中是必要的。该量低于5重量％时，不能得到充分的效果，并且标记抗体与变异链球菌的复合体不能有效地从保持标记抗体的膜中流出。另一方面，超过25重量％时，检测灵敏度降低。
在本发明的唾液预处理试剂盒和唾液预处理方法中，由于(A)浓度为0.01-10mol/L的氢氧化钠水溶液与(B)浓度为0.01-3mol/L的酒石酸和/或柠檬酸的水溶液之间发生中和反应，因此优选使用缓冲剂，并且为在中和反应中得到有效的缓冲作用，优选使用三(羟甲基)氨基甲烷作为缓冲剂。但是此时，已经确认通过其它缓冲剂如碳酸氢钠与碳酸钠的组合、以及柠檬酸与柠檬酸钠的组合不能得到充分的缓冲作用。三(羟甲基)氨基甲烷可以与成分(A)、(B)和(C)中的一个混合，或者可以单独提供，此时优选以水溶液的形式。在本发明的唾液预处理试剂盒中，(A)浓度为0.01-10mol/L的氢氧化钠水溶液与(B)浓度为0.01-3mol/L的酒石酸和/或柠檬酸的水溶液因引起中和反应而必须单独提供。
在本发明的第一方法中，通过免疫层析法对变异链球菌进行鉴定和定量测定时，选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质以5-25重量％的量与(A)、(B)和(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂的至少一个混合，然后通过以任意的顺序滴下(A)浓度为0.01-10mol/L的氢氧化钠水溶液、(B)浓度为0.01-3mol/L的酒石酸和/或柠檬酸的水溶液和(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂而将它们混合。为简化本发明的第二方法的操作，将(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂与(A)浓度为0.01-10mol/L的氢氧化钠水溶液及(B)浓度为0.01-3mol/L的酒石酸和/或柠檬酸的水溶液的至少一个预先混合，然后通过以任意顺序滴下(A)浓度为0.01-10mol/L的氢氧化钠水溶液和(B)浓度为0.01-3mol/L的酒石酸和/或柠檬酸的水溶液而将它们混合。
在本发明的唾液预处理方法中，由于(A)浓度为0.01-10mol/L的氢氧化钠水溶液与(B)浓度为0.01-3mol/L的酒石酸和/或柠檬酸的水溶液之间发生中和反应，因此优选使用缓冲剂，并且为在中和反应中得到有效的缓冲作用，优选使用(D)三(羟甲基)氨基甲烷作为缓冲剂。尽管用成分(A)、(B)和(C)的处理因各成分的功能相互独立而可以任意顺序进行，但在唾液预处理试剂盒中含有(D)三(羟甲基)氨基甲烷时，为在成分(A)与成分(B)的中和反应中得到缓冲作用，成分(A)与成分(B)相互接触在(D)三(羟甲基)氨基甲烷存在下进行是必要的。
除第一和第二方法外，在本发明的第三方法中，通过免疫层析法鉴定和定量测定变异链球菌时，选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质以5-25重量％的量与(A)浓度为0.01-10mol/L的氢氧化钠水溶液、(B)浓度为0.01-3mol/L的酒石酸和/或柠檬酸的水溶液、(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂和(D)三(羟甲基)氨基甲烷的至少一个混合，然后通过以成分(A)与成分(B)在成分(D)存在下接触的顺序滴下成分(A)、(B)、(C)和(D)，将它们混合。此时优选通过以成分(A)与成分(B)在成分(D)存在下接触的顺序滴下成分(A)、(B)和(D)(其中至少一个与成分(C)混合)，将它们混合。
在本发明的唾液预处理方法中，处理优选以这样的方式进行处理后的唾液的pH在5-9的范围内，因为抗原抗体反应在该pH范围内进行。尽管该范围随使用的抗体而变化，但当pH在该范围以外时，由于抗体与抗原相互离开、并且它们具有非特异的亲合力，故存在测定结果的可靠性下降的倾向。
可以通过使用常规的免疫层析技术的抗原抗体反应，对通过本发明的唾液预处理试剂盒及唾液预处理方法处理的唾液试样进行变异链球菌的鉴定和定量测定。抗体可以通过通常使用的方法得到。例如，可以通过由Kohler和Milstein(Kohler G，C.Milstein，Continuous culturesof fused cells secreting antibody of predefined specificity，Nature，256卷，495-497页(1976))的细胞融合建立杂交瘤得到，或可以使用那些从用抗原免疫的动物血清中简单纯化的那些。
实施例以下将参照实施例详细说明本发明，但本发明不限于这些实施例。如果没有特别指明，操作在室温下进行，pH为在20-25℃下的pH。
(1)试剂和试验装置的准备1.抗体的制作通过使用BHI培养基(Brain Heart Infusion培养基，DIFCOLaboratories制)在37℃过夜，分别培养变异链球菌(ATCC 25175菌株)和远缘链球菌(Streptococci sobrinus)(ATCC 33478菌株)。通过离心从培养液收集细菌细胞后，用PBS(10mmol磷酸盐缓冲的盐水)将其洗涤两次，用甲醛水溶液终止生长。直接用细菌的分解液将小鼠免疫，然后通过使用Kohler和Milstein的细胞融合建立杂交瘤，得到下面所示的抗体各两种。
SM1抗体抗变异链球菌抗体SM2抗体抗变异链球菌抗体SS1抗体抗远缘链球菌抗体SS2抗体抗远缘链球菌抗体2.抗体的金胶体标记用粒径40nm的金胶体标记SM2抗体及SS2抗体。金胶体使用市售品(British Biocell International制)，并用含有1％牛血清清蛋白(BSA，商品名，Sigma-Aldrich Corp.制)、1％非离子表面活性剂(Tween-20，商品名，Sigma-Aldrich Corp.制)的PBS稀释到抗体浓度为0.1μg/mL。用金胶体标记的抗体溶液分别称为SM2标记抗体和SS2标记抗体。
3.抗体固定化的多孔膜条的制作使用用塑料薄膜(SXHF，商品名，Millipore Corp.Japan制)衬里的硝化纤维素膜作为多孔膜。将该膜切成5mm×40mm的长方形。用含有1％牛血清清蛋白的50mmol磷酸盐缓冲液将SM1抗体或SS1抗体稀释成1mg/mL的浓度，并用微量移液管将抗体稀释溶液在这样切出的硝化纤维素膜的中央部沿与膜的纵向垂直的方向涂布，涂布量达到约1μL/cm。固定化的抗体有时分别称为SM1捕捉抗体和SS1捕捉抗体。在该膜的一端用夹子固定15mm见方的滤纸作为吸水体，使互相紧密接触。在与吸水体相对的膜的另一端用夹子固定5mm×20mm的聚丙烯基质(Quick Release Conjugate Pad，商品名，Millipore Corp.Japan制)作为保持标记抗体的多孔膜(以下称为标记抗体保持体)，在它上面滴下30μL的SM2标记抗体溶液或SS2标记抗体溶液。将装置在37℃干燥2小时，然后在使用前保存在干燥器中。
(2)变异链球菌的定量测定通过使用前述试剂和装置的免疫层析法对唾液中的变异链球菌的定量测定结果与通过由菌落数计算的常规方法算出的唾液中的变异链球菌数进行比较。
1.通过免疫层析法进行的试验方法变异链球菌与在抗体固定化的多孔膜条上固定化的抗体的反应性通过下面的原理检测。唾液通过抗体固定化的多孔膜条的标记抗体保持体时，标记抗体与唾液中的变异链球菌结合，变为红色。变异链球菌与标记抗体的复合体在抗体固定化的多孔膜条中移动，然后它被抗体固定化的多孔膜条上的以例如带状固定化的抗体(捕捉抗体)捕捉，从而作为带状痕迹被确认。
2.通过常规方法从菌落数计算变异链球菌数变异链球菌、远缘链球菌和夹杂菌在MSB培养基上形成菌落。为准确测定它们的菌落数，测定在MSB培养基上形成的菌落数后，收集一部分菌落并破碎后，并用具有对变异链球菌或远缘链球菌特异的序列的合成DNA引物进行PCR(聚合酶链反应)。用琼脂凝胶对由此扩增的基因断片进行电泳，以确认菌株。
实施例1使用这样的抗体固定化的多孔膜条在其中央部将SM1抗体固定化，在另一端的标记抗体保持体中含有SM2标记抗体。通过下面的方式进行检查。
让被试验者咀嚼收集唾液用的树胶5分钟，将唾液收集在试管中。这样收集的一部分唾液用PBS稀释并涂布在MSB培养基上。在37℃进行厌氧培养2或3天后，测定菌落数。测定后，收集一部分菌落。将细菌细胞破碎后，用具有对变异链球菌或远缘链球菌特异的序列的合成DNA引物进行PCR(聚合酶链反应)，并用琼脂凝胶对由此扩增的基因断片进行电泳，以判别菌株。从作为判别结果的、确认为变异链球菌的菌落数计算细菌细胞数(CFU/mL)。
通过在含有1.0mol/L氢氧化钠(成分(A))的含有1.0mol/L三(羟甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加23.3重量％氯化钠准备溶液(AD溶液)。通过在含有0.5mol/L柠檬酸(成分(B))的含有1.0mol/L三(羟甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加5重量％作为非离子表面活性剂(成分(C))的聚乙二醇单辛基苯基醚(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制)准备溶液(BCD溶液)。
在250μL唾液中加入50μL AD溶液，然后搅拌。然后在其中加入100μL BCD溶液，然后搅拌。从这样处理的唾液中取100μL，滴到标记抗体保持体一侧的条上。这样处理的溶液的pH为7.2。溶液中成分(C)的浓度为1.25重量％。滴下15分钟后，确认了与捕捉抗体的反应，并且标记抗体保持体中残留的SM2标记抗体与变异链球菌的复合体的量通过目视进行了观察。
对5个被试验者a～e进行前述试验。这样得到的结果如下表1所示。与抗体的反应性分四级评价，即，红色带可清楚确认(++)，红色带可确认(+)，红色带稍微可以确认(±)，以及不能确认带(-)。标记抗体保持体中残留的SM2标记抗体与变异链球菌的复合体的量(以下简称为残留抗体量)通过目视进行了观察，并分三级评价，即作为红色在标记抗体保持体中确认大量残留抗体(+)，稍微确认残留抗体(±)，和无残留抗体确认(-)。表中使用的单位CFU/mL是指每1mL唾液的细菌菌落数。
表1

实施例2使用除使用SS1捕捉抗体代替SM1捕捉抗体，SS2标记抗体代替SM2标记抗体外与实施例1同样的抗体固定化的多孔膜条，以下面的方式进行试验。
通过在含有1.0mol/L氢氧化钠(成分(A))的溶液中添加25.0重量％氯化钠准备溶液(A溶液)。通过在含有1.0mol/L三(羟甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加0.5mol/L柠檬酸(成分(B))准备溶液(BD溶液)。准备含有5重量％聚乙二醇单辛基苯基醚(Wako PureChemical Industries，Ltd.制)作为非离子表面活性剂(成分(C))的水溶液(C溶液)。
在250μL唾液中加入80μL BD溶液，然后搅拌。然后在其中加入50μL C溶液，然后搅拌。最后在其中加入40μL A溶液，然后搅拌。从这样处理的唾液中取100μL，滴到标记抗体保持体一侧的条上。这样处理的溶液的pH为6.6。溶液中成分(C)的浓度为0.60重量％。滴下15分钟后，确认了与捕捉抗体的反应，并且标记抗体保持体中残留的SS2标记抗体与变异链球菌的复合体的量通过目视进行了观察。
对5个被试验者a～e进行前述试验，并进行与实施例1同样的评价。这样得到的结果如下表2所示。
表2

实施例3使用与实施例1同样的使用SM1捕捉抗体和SM2标记抗体的抗体固定化的多孔膜条，以下面的方式进行试验。
通过在含有5重量％聚乙二醇单辛基苯基醚(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制)作为非离子表面活性剂(成分(C))的水溶液中添加1.0mol/L氢氧化钠(成分(A))准备溶液(AC溶液)。通过在含有0.5mul/L柠檬酸(成分(B))的含有1.0mol/L三(羟甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加12.0重量％氯化钠准备溶液(BD溶液)。
在250μL唾液中加入75μL AC溶液，然后搅拌。然后在其中加入75μL BD溶液，然后搅拌。从这样处理的唾液中取100μL，滴到标记抗体保持体一侧的条上。这样处理的溶液的pH为7.5。溶液中成分(C)的浓度为0.94重量％。滴下15分钟后，确认了与捕捉抗体的反应，并且标记抗体保持体中残留的SM2标记抗体与变异链球菌的复合体的量通过目视进行了观察。
对3个被试验者a～c进行前述试验，并进行与实施例1同样的评价。这样得到的结果如下表3所示。
表3

实施例4使用与实施例2同样的使用SS1捕捉抗体和SS2标记抗体的抗体固定化的多孔膜条，以下面的方式进行试验。
准备含有4.0mol/L氢氧化钠(成分(A))的水溶液(A溶液)。准备含有1.0mol/L柠檬酸(成分(B))的溶液(B溶液)。准备含有5重量％聚乙二醇单辛基苯基醚(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制)作为非离子表面活性剂(成分(C))的水溶液(C溶液)。通过在含有1.0mol/L三(羟甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加12.0重量％氯化钠准备溶液(D溶液)。
在250μL唾液中加入40μL C溶液，然后搅拌。然后在其中加入40μL B溶液，然后搅拌。进一步在其中加入40μL D溶液，然后搅拌。最后在其中加入40μLA溶液，然后搅拌。从这样处理的唾液中取100μL，滴到标记抗体保持体一侧的条上。这样处理的溶液的pH为8.0。溶液中成分(C)的浓度为0.49重量％。滴下15分钟后，确认了与捕捉抗体的反应，并且标记抗体保持体中残留的SS2标记抗体与变异链球菌的复合体的量通过目视进行了观察。
对3个被试验者a～c进行前述试验，并进行与实施例1同样的评价。这样得到的结果如下表4所示。
表4

实施例5使用与实施例1同样的使用SM1捕捉抗体和SM2标记抗体的抗体固定化的多孔膜条，以下面的方式进行试验。
通过在含有1.0mol/L氢氧化钠(成分(A))的含有5重量％聚乙二醇单辛基苯基醚(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制)作为非离子表面活性剂(成分(C))的水溶液中添加12重量％氯化钠准备溶液(AC溶液)。准备含有0.5mol/L柠檬酸(成分(B))的水溶液(B溶液)。通过在含有1.0mol/L三(羟甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加12.0重量％氯化钠准备溶液(D溶液)。
在250μL唾液中加入75μL AC溶液，然后搅拌。然后在其中加入75μL B溶液，然后搅拌。最后在其中加入50μL D溶液，然后搅拌。从这样处理的唾液中取100μL，滴到标记抗体保持体一侧的条上。这样处理的溶液的pH为7.2。溶液中成分(C)的浓度为0.83重量％。滴下15分钟后，确认了与捕捉抗体的反应，并且标记抗体保持体中残留的SM2标记抗体与变异链球菌的复合体的量通过目视进行了观察。
对3个被试验者a～c进行前述试验，并进行与实施例1同样的评价。这样得到的结果如下表5所示。
表5

实施例6使用与实施例1同样的使用SM1捕捉抗体和SM2标记抗体的抗体固定化的多孔膜条，以下面的方式进行试验。
通过在含有3.0mol/L氢氧化钠(成分(A))的含有1.0mol/L三(羟甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加12.0重量％氯化钠准备溶液(AD溶液)。通过在含有1.0mol/L三(羟甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加1.0mol/L酒石酸和0.5mol/L柠檬酸(成分(B))准备溶液(BD溶液)。通过在含有5重量％聚乙二醇单辛基苯基醚(Wako PureChemical Industries，Ltd.制)作为非离子表面活性剂(成分(C))的水溶液中添加2mol/L氯化钠准备溶液(C溶液)。
在250μL唾液中加入40μL BD溶液，然后搅拌。然后在其中加入40μL A溶液，然后搅拌。最后在其中加入40μL C溶液，然后搅拌。从这样处理的唾液中取100μL，滴到标记抗体保持体一侧的条上。这样处理的溶液的pH为6.9。溶液中成分(C)的浓度为0.54重量％。滴下15分钟后，确认了与捕捉抗体的反应，并且标记抗体保持体中残留的SM2标记抗体与变异链球菌的复合体的量通过目视进行了观察。
对3个被试验者a～c进行前述试验，并进行与实施例1同样的评价。这样得到的结果如下表6所示。
表6

实施例7使用与实施例1同样的使用SM1捕捉抗体和SM2标记抗体的抗体固定化的多孔膜条，以下面的方式进行试验。
通过在含有1.0mol/L氢氧化钠(成分(A))的水溶液中添加25.0重量％氯化钠准备溶液(A溶液)。通过在含有0.5mol/L柠檬酸(成分(B))的水溶液中添加5.0重量％聚乙二醇单辛基苯基醚(Wako PureChemical Industries，Ltd.制)作为非离子表面活性剂(成分(C))准备溶液(BC溶液)。准备含有2mol/L三(羟甲烷)氨基甲烷(成分(D))的缓冲液(D溶液)。
在250μL唾液中加入40μL D溶液，然后搅拌。然后在其中加入40μL A溶液，然后搅拌。最后在其中加入70μL BC溶液，然后搅拌。从这样处理的唾液中取100μL，滴到标记抗体保持体一侧的条上。这样处理的溶液的pH为6.9。溶液中成分(C)的浓度为0.88重量％。滴下15分钟后，确认了与捕捉抗体的反应，并且标记抗体保持体中残留的SM2标记抗体与变异链球菌的复合体的量通过目视进行了观察。
对5个被试验者a～e进行前述试验，并进行与实施例1同样的评价。这样得到的结果如下表7所示。
表7

比较例1除使用不含氯化钠的AD溶液外，对5个被试验者a～e进行与实施例1同样的试验，并进行与实施例1同样的评价。这样得到的结果如下表8所示。
表8

比较例2除使用不含氯化钠的D溶液外，对3个被试验者a～c进行与实施例4同样的试验，并进行与实施例1同样的评价。这样得到的结果如下表9所示。
表9

从以上的结果可以确认使用本发明的唾液预处理试剂盒的唾液预处理方法可以消除由唾液中的粘蛋白及变异链球菌的链形成引起的聚集，并且由于在标记抗体保持体中残留的标记抗体与变异链球菌的复合体的量少，所以确认了防止标记抗体与变异链球菌的复合体残留在保持标记抗体的膜中这种现象的效果。
如上所详述，通过利用抗原抗体反应的免疫层析法鉴定和定量测定作为人唾液中存在的一种致龋细菌的变异链球菌时，本发明的唾液预处理试剂盒和唾液预处理方法通过简便的操作可以消除由唾液中的粘蛋白及变异链球菌的链形成引起的聚集，并且可以使标记抗体与变异链球菌的复合体从保持标记抗体的多孔膜有效流出，从而可以进行高精度的鉴定和定量测定。因此，它提供对牙科领域有贡献的非常大的价值。
权利要求
1.一种唾液预处理试剂盒，含有(A)氢氧化钠水溶液，浓度为0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或柠檬酸的水溶液，浓度为0.01-3mol/L，和(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂，成分(C)与成分(A)和(B)的至少一个混合，或可以与成分(A)和(B)分别提供，以及在成分(A)、(B)和(C)的至少一个中含有选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质，含量为5-25重量％。
2.如权利要求1所述的唾液预处理试剂盒，其中(D)三(羟甲基)氨基甲烷与成分(A)、(B)和(C)的至少一个混合。
3.一种唾液预处理试剂盒，含有(A)氢氧化钠水溶液，浓度为0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或柠檬酸的水溶液，浓度为0.01-3mol/L，(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂，和(D)含有三(羟甲基)氨基甲烷的水溶液，成分(C)与成分(A)、(B)和(D)的至少一个混合，或可以与成分(A)、(B)和(D)分别提供，以及在成分(A)、(B)、(C)和(D)的至少一个中含有选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质，含量为5-25重量％。
4.如权利要求1-3的任一项所述的唾液预处理试剂盒，其中作为成分(C)的非离子表面活性剂为选自聚乙二醇单辛基苯基醚、正辛基-β-D-葡糖苷、正庚基-β-D-硫葡糖苷、正辛基-β-D-硫葡糖苷、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇和聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯的一种、或两种以上的混合物。
5.如权利要求1-4的任一项所述的唾液预处理试剂盒，其中作为成分(C)的两性表面活性剂为选自CHAPS(3-(3-胆酰胺丙基)-二甲基铵基)-1-丙烷磺酸盐)和CHAPSO(3-(3-胆酰胺丙基)-二甲基铵基)-1-羟基丙烷磺酸盐)的一种、或两种以上的混合物。
6.一种唾液预处理方法，用于通过免疫层析法鉴定和定量测定变异链球菌，包括下列步骤将选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质以5-25重量％的量与选自下述(A)、(B)和(C)的至少一个混合，(A)氢氧化钠水溶液，浓度为0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或柠檬酸的水溶液，浓度为0.01-3mol/L，和(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂；和通过以任意顺序滴下成分(A)、(B)和(C)将它们混合。
7.如权利要求6所述的唾液预处理方法，其中(D)三(羟甲基)氨基甲烷与成分(A)、(B)和(C)的至少一个混合，并且通过以成分(A)与成分(B)在成分(D)的存在下接触的顺序滴下成分(A)、(B)和(C)，将它们混合。
8.一种唾液预处理方法，用于通过免疫层析法鉴定和定量测定变异链球菌，包括下列步骤将选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质以5-25重量％的量与选自下述(A)和(B)的至少一个混合，(A)氢氧化钠水溶液，浓度为0.01-10mol/L和(B)酒石酸和/或柠檬酸的水溶液，浓度为0.01-3mol/L；将(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂混入成分(A)和(B)的至少一个中；和通过以任意顺序滴下成分(A)和(B)将它们混合。
9.如权利要求8所述的唾液预处理方法，其中(D)三(羟甲基)氨基甲烷与成分(A)和(B)的至少一个混合，并且通过以任意顺序滴下成分(A)和(B)，将它们混合。
10.一种唾液预处理方法，用于通过免疫层析法鉴定和定量测定变异链球菌，包括下列步骤将选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质以5-25重量％的量与选自下述(A)、(B)、(C)和(D)的至少一个混合，(A)氢氧化钠水溶液，浓度为0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或柠檬酸的水溶液，浓度为0.01-3mol/L，(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂，和(D)三(羟甲基)氨基甲烷；和通过以成分(A)与成分(B)在成分(D)的存在下接触的顺序滴下成分(A)、(B)、(C)和(D)，将它们混合。
11.如权利要求10所述的唾液预处理方法，其中通过以成分(A)与成分(B)在成分(D)的存在下接触的顺序滴下至少其中之一已与成分(C)混合的成分(A)、(B)和(D)，将它们混合。
全文摘要
在通过利用抗原抗体反应鉴定和定量测定变异链球菌时的唾液预处理试剂盒和唾液预处理方法，它通过简便的操作可以消除由唾液中的粘蛋白及变异链球菌的链形成引起的聚集，并且可以使标记抗体与变异链球菌的复合体从保持标记抗体的多孔膜有效流出，所述的唾液预处理试剂盒含有(A)氢氧化钠水溶液，浓度为0.01－10mol/L，(B)酒石酸和/或柠檬酸的水溶液，浓度为0.01－3mol/L，和(C)非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂，其中成分(C)与成分(A)和(B)的至少一个混合，或可以分别提供，以及在成分(A)、(B)和(C)的至少一个中含有选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸锰的至少一种物质，含量为5－25重量％。
文档编号G01N33/543GK1492230SQ0315914
公开日2004年4月28日 申请日期2003年9月9日 优先权日2002年9月9日
发明者立野敦史 申请人:株式会社Gc