专利名称：对异硫氰基苯基五氮杂环四乙酸螯合物及其制备方法
技术领域：
本发明属于有机杂环化合物合成技术领域，涉及对-异硫氰基苯基五氮杂环四乙酸螯合物及其制备方法以及该螯合物作为均相时间分辨荧光免疫分析试剂用于免疫分析的应用。
背景技术：
时间分辨荧光免疫分析法以其灵敏度高、快速、自动化分析仪器的使用及技术的发展使这一分析法得到迅速的发展和广泛的应用。该方法是以镧系元素为标记物，用来标记抗体(或抗原)、寡核苷酸、生物大分子、靶细胞等，然后进行抗原抗体的免疫反应生成免疫复合物，或进行核酸杂交分析、检测DNA序列等，其原理是镧系离子如铕、钐、铽、镝等与具有紫外吸收的配基螯合，受某一波段的紫外光激发后，配基能将激发态能转移给镧系离子，发射强度高且寿命长的荧光光谱，不同的元素具有不同的荧光光谱且谱线窄。而且激发光(300-350nm)与所要测量的发射光谱(490-643nm)之间有很长的Stokes位移，发射的荧光寿命长(从微秒到毫秒级)，所以用其作标记物通过光谱分辨和时间分辨，待本底荧光(纳秒级)淬灭后再进行标记物或标记物复合物的荧光测量，用作微量生物活性物的测量大大提高了灵敏度。
近年来，国内外文献大量的报道了时间分辨荧光分析的研究进展并对1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷的衍生物作为核磁共振显像造影剂和放射性药物的潜在配体已进行了广泛的研究。但是将其衍生物与镧系元素螯合作为时间分辨荧光免疫分析试剂尚未见有研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种全新的对异硫氰基苯基五氮杂环四乙酸螯合物，它是钢性穴状化合物，可螯合铕、钐、铽等镧系元素形成鏊合物。
本发明的另一个目的在于公开了对异硫氰基苯基五氮杂环四乙酸螯合剂的制备方法。
本发明的再一个目的在于公开了对异硫氰基苯基五氮杂环四乙酸镧系元素螯合物用来标记抗体(或抗原)进行荧光免疫分析，遗传学诊断，各种病原体诊断，癌基因、抑癌基因的检出等，还可标记DNA做成探针进行基因诊断、酶分析、受体分析等等。
发明的技术方案如下 具有下述结构的对异硫氰基苯基五氮杂环四乙酸螯合物
其中R＝Eu3+，Sm3+，Tb3+，In3+ 本发明所述螯合物的制备方法，其特征在于， (1)化合物III与化合物V进行成环缩合反应，制得化合物VI；
(2)将化合物VI水解制得化合物VII； (3)在有机溶剂中，将化合物VII与对氟硝基苯进行取代反应，制得化合物VIII；所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、甲苯、吡啶、DMF、乙腈、氯仿等等。
(4)化合物VIII与溴乙酸反应，制得化合物IX。
(5)化合物IX与R螯合，得到螯合物X；其中R为铕、钐、铽或镝离子。
(6)化合物X还原制得化合物XI。
(7)化合物X与硫代光气反应，得到化合物I。
本发明所述的对异硫氰基苯基五氮杂环四乙酸螯合物的制备方法其中化合物VII与对氟硝基苯的摩尔比为1∶0.2-0.5mol反应温度50-80℃，反应时间6-8小时。
其中化合物VIII溴乙酸的摩尔比为1∶4-6，反应温度30-60℃，反应时间4-8小时。
其中化合物IX还原所用还原剂为5-10％Pd/C，化合物IX与还原剂的摩尔比为1∶0.03-0.06mol，反应温度15-30℃，反应时间3-5小时。
其中化合物X与硫代光气的摩尔比为1∶3-5，反应温度20-30℃，反应时间1-3小时。
本发明所述的1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷四乙酸，其制备方法中对现有文献方法做了一定的改进 参考文献①EUR.J.MED.CHIM.THER.1984.19(5)42；②Inors.Chem.1991.302092；③CN 1225461C；具体如下 1)生成N，N′，N″-三对甲苯磺酰二乙烯三胺，反应温度20-35℃，反应时间2-5小时，重结晶溶剂甲醇或乙醇。
2)生成的N，N′-二对甲苯磺酰羟乙基-N，N′-二对甲苯磺酰乙二胺，反应温度-5-5℃，反应时间1-3小时，重结晶溶剂甲醇或乙醇。
3)N，N′，N″-三对甲苯磺酰二乙烯三胺可和甲醇钠(乙醇钠)或NaH成盐。4)1，4，7，10，13-五对甲苯磺酰五氮杂环十五烷反应温度100-120℃，反应时间3-5小时。
本发明的对-异硫氰基苯基五氮杂环四乙酸螯合剂的合成路线如下
本发明进一步公开了对-异硫氰基苯基五氮杂环四乙酸螯合物作为在制备用于时间分辨荧光免疫分析方面的应用。特别是在标记抗体或抗原进行荧光免疫分析方面的应用。具有代表意义的螯合物为对-异硫氰基苯基-1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷四乙酸铕。用此螯合剂标记抗体(或抗原)用于时间分辨荧光免疫分析，检测激素，癌标志物，或用于标记寡核苷酸，进行基因诊断等等。
具体实施例方式 为了更充分的解释本发明的实施，提供下述对-异硫氰基苯基五氮杂环四乙酸螯合剂制备实施实例。典型的是对-异硫氰基苯基-1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷四乙酸铕螯合物制备方法，这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。
下面是对异硫氰基苯基-1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷四乙酸铕螯合物的合成路线
参考实施例 实施例1 N，N’-二对甲苯磺酰羟乙基-N，N’-二对甲苯磺酰乙二胺(化合物III) 77g(0.4mol)对甲苯磺酰氯在100ml吡啶中，剧烈搅拌下，滴加14.8g(0.1mol)N，N’-二(2-羟乙基)乙二胺在200ml吡啶中的溶液，滴毕室温搅拌3小时。将溶液倒入250ml冰和250ml浓盐酸中过滤，水洗，乙醇重结晶，得淡黄色晶体，mp99-100℃(70％)。
实施例2 N，N’，N”-三对甲苯磺酰二乙三胺(化合物IV) 10.3g(0.1mol)二乙烯三胺加106ml(0.4mol)氢氧化钠溶液中，在剧烈搅拌下，0℃滴加57.1g(0.3mol)对甲苯磺酰氯在375ml的乙醚溶液，加毕，继续搅拌1小时，过滤得粗品，用乙醇重结晶，mp200-202℃(60％) 实施例3 N，N’，N”-三对甲苯磺酰二乙三胺二钠盐(化合物V) 56.4g(0.1mol)化合物2加到13.6g(0.2mol)乙醇钠在150ml无水乙醇溶液80℃加热1小时，减压除去溶剂，真空干燥得到产品。
制备实施例 实施例1 1，4，7，10，13-五对甲苯磺酰基五氮杂环十五烷(化合物VI) 先加入100ml DMF，然后通氮气，100℃加热，搅拌下缓慢同时滴加76.4g(0.1mol)化合物III在200ml DMF的溶液和61g(0.1mol)化合物V在200ml DMF的溶液，滴毕，棕色反应液在100-110℃反应3小时。冷却，搅拌下，倒入水中，滤出沉淀，水洗，醇洗，用乙醇重结晶得白色晶体mp289-290℃(文献290-291℃，278-280℃)(65％)。
实施例2 1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷(化合物VII) 2.0g(2.03mmol)化合物VI和10ml98％浓硫酸混合，通氮气，在180℃加热搅拌，水解反应4-5小时，得棕灰色液体。冰水冷却下缓慢从滴液漏斗加入50ml乙醚，灰色沉淀很快过滤立即用乙醚洗，然后溶解在20ml水中，用过量NaOH片碱，调成pH 8左右，用CHCl3提�。ト芗恋玫桨咨峋В颐阎亟峋В玫浇峋p90-91℃(文献100-102℃)(80％)。
1HNMR，δ2.774(s，20H，CH2)；1.829(s，5H，NH)。
实施例3 1’-对硝基苯基1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷(化合物VIII) 43.82g(0.20mol)化合物VII溶解在500ml乙腈中，60℃搅拌加50ml水，然后该溶液滴加到对氟硝基苯(7.66g，0.054mol)的50ml乙腈溶液，60℃反应8小时，过滤，粗品溶于1升沸水中，得到的溶液用水稀释1∶1上柱(
XAO1600)用水洗去未反应的原料，用甲醇洗脱，除去甲醇得产品。mp170-172℃，(收率73.1％)。
实施例4(与铕离子螯合) 1-对硝基苯基1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷四乙酸(化合物IX) 29.64g(0.21mol)溴乙酸搅拌下加到13.41g(0.04mol)化合物VIII在50ml水中的溶液，用2NNaOH调PH＝10，在50℃条件下反应6小时，冷却，过滤，滤液用盐酸调PH＝3，再用水1∶1稀释后上柱(
XAO1600)，用水洗去未反应的原料，用甲醇洗，蒸干得到的产品与10.32g(0.04mol)EuCl3在pH为6的醋酸缓冲溶液中螯合得到相应的铕螯合物。
实施例5 1-对氨基苯基1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷四乙酸(化合物X) 11.39g(0.02mol)化合物X的50ml水溶液中，加入5％Pd/C 0.7g室温催化氢化，大约4小时，过滤，滤液浓缩得到粗品，不需纯化，直接进行下步反应。
实施例6 1-对异硫氰基苯基1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷四乙酸(化合物I) 对氨基苯基化合物(化合物X)4.13g(6mmol)溶于50ml水中，加NaHCO3至pH8.5，室温滴加CSCl2(硫代光气)1.07g(9mmol)的氯仿溶液20ml，滴毕，室温搅拌2h。分去CHCl3层，水层用CHCl3提取后，合并有机层，减压蒸去CHCl3，残渣(含产品)用半制备高压液相C18柱分离，收集相应的部分，减压浓缩至干，即得到最终对异硫氰基铕螯合物。
1H NMR(D2O)δ＝7.15(d，2H)，6.7(d，2H)，3.6(s，4H)，3.4(s，4H)，3.3(s，2H)，3.27(s，8H)，3.1(s，4H)。
实施例7 1-对硝基苯基1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷四乙酸(化合物IX) 表1镧系元素 29.64g(0.21mol)溴乙酸搅拌下加到13.41g(0.04mol)化合物VIII在50ml水中的溶液，用2NNaOH调pH＝10，在50℃条件下反应6小时，冷却，过滤，滤液用盐酸调pH＝3，再用水1∶1稀释后上柱(
XAO1600)，用水洗去未反应的原料，用甲醇洗，蒸干得产品与表1的镧系元素在pH为6的醋酸缓冲液中螯合得到相应的镧系元素螯合物。
权利要求
1、具有下述结构的对异硫氰基苯基五氮杂环四乙酸螯合物
其中R＝Eu3+，Sm3+，Tb3+，In3+I。
2、权利要求1所述螯合物的制备方法，其特征在于，
(1)化合物III与化合物V进行成环缩合反应，制得化合物VI；
(2)将化合物VI水解制得化合物VII；
(3)在有机溶剂中，将化合物VII与对氟硝基苯进行取代反应，制得化合物VIII；
(4)化合物VIII与溴乙酸反应，制得化合物IX；
(5)化合物IX与R螯合，得到螯合物X；
(6)化合物X还原制得化合物XI；
其中R为铕、钐、铽或镝离子；
(7)化合物X与硫代光气反应，得到化合物I。
3、如权利要求2所述螯合物的制备方法，其中化合物VII与对氟硝基苯的摩尔比为1∶0.2-0.5mol；反应温度50-80℃，反应时间6-8小时。
4、如权利要求2所述螯合物的制备方法，其中化合物VIII∶溴乙酸的摩尔比为1∶4-6mol，反应温度30-60℃，反应时间4-8小时。
5、如权利要求2所述螯合物的制备方法，其中化合物IX还原所用还原剂为5-10％Pd/C，化合物IX与还原剂的摩尔比为1∶0.03-0.06mol，反应温度15-30℃，反应时间3-5小时。
6、如权利要求2所述螯合物的制备方法，其中化合物X与硫代光气的摩尔比为1∶3-5mol，反应温度20-30℃，反应时间1-3小时。
7、权利要求1所述螯合物在制备用于时间分辨荧光免疫分析方面的应用。
8、权利要求1所述螯合物在标记抗体或抗原进行荧光免疫分析方面的应用。
9、如权利要求8所述螯合物，其特征在于所述螯合物为对异硫氰基苯基-1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷四乙酸铕螯合物。
全文摘要
本发明涉及异硫氰基苯基五氮杂环四乙酸螯合物及其制备方法，其中包括缩合、水解、取代反应，生成物与溴乙酸缩合，再和镧系元素螯合得到对硝基苯基五氮杂环四乙酸，再经5％Pd/C还原，最后和硫代光气反应，得到目标化合物I。本发明的对异硫氰基苯基五氮杂环四乙酸螯合物为未知化合物，形成的钢性穴状化合物和铕、铟、钐、铽等镧系元素螯合，经元素分析、红外光谱、紫外光谱、核磁及质谱确定其结构，所制备的螯合物主要用做时间分辨荧光免疫分析。
文档编号G01N33/52GK101348468SQ200710058139
公开日2009年1月21日 申请日期2007年7月16日 优先权日2007年7月16日
发明者施培基, 王荣先, 浩 王, 李美佳, 周晓靓, 傅榕赓, 鹏 尹, 黄海舟, 吕茜茜 申请人:中国医学科学院放射医学研究所
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