专利名称：用于检测低水平融合蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及对肿瘤特异性融合蛋白等的检测。更特异地，本发明涉及通过检测生物样品中的融合蛋白的存在而提示染色体易位的存在的技术。
在对各种类型癌症的诊断中，例如白血病、淋巴瘤和实体瘤，常常用染色体畸变进行预后相关亚组的分组。多种这样的染色体畸变都形成了融合基因，即经一个基因的上游部分和另一个基因的下游部分结合成的异常结合的基因，或反之亦然。融合基因可以被转录成融合基因转录物并被翻译成融合蛋白。一般而言，融合蛋白在肿瘤发生的过程中起到了重要作用。例如，近35％的成人急性淋巴细胞白血病(ALL)和近95％的慢性髓性白血病(CML)患者在其白血病细胞中都有着染色体缺陷，即染色体9和22之间的易位，形成了费城(Ph)染色体。该易位发生在名为ABL的蛋白酪氨酸激酶的基因组位点上，形成了异常的BCR-ABL融合蛋白，它是ABL基因与另一种称为BCR的基因的框内融合的基因产物。一般而言，融合蛋白在肿瘤发生的过程中起到了重要作用。例如，BCR-ABL融合蛋白中的ABL的激酶活性被激活并下调，造成了在ALL和在CML中所观察到的不受控制的细胞生长。
当一个患者被诊断为ALL时，其白血病细胞总数通常在1011到1012个的范围内。细胞生长抑制或细胞毒治疗诱导了绝大多数淋巴恶性肿瘤患者的完全缓解。但是，这些患者中的许多患者都会复发。完全缓解并不意味着白血病细胞被完全地清除出体内，只是它们的水平超出了经典细胞形态学方法的敏感性水平。因为细胞形态学技术的检出限度是不低于1-5％恶性细胞，这意味着在患者体内仍有最多达1010个恶性细胞，这也被称作为“微小残留病变”(MRD)。当前的治疗方案显然不能杀死这些复发患者中的所有的恶性细胞，尽管根据细胞形态学标准，他们都已达到了所谓的完全缓解。因此，很明显的是细胞形态学技术只能提供关于治疗有效性的表面信息。
在早期治疗反应的过程中，对较少数目的残留恶性细胞的检测容许对化疗过程中的肿瘤减少的动力学进行精确评价。现在已知MRD信息代表着一种最终预后的有力的预后因素。对MRD水平的增高的检测使得能预测即将发生的复发。因此具有检测MRD的高敏感性的技术对于得到更好的关于在诱导治疗期间肿瘤量的缩小以及进一步的在巩固治疗期间恶性细胞的根除的认识是关键的。
用于检测染色体畸变的现有技术包括传统技术例如细胞遗传学分析和生物分子技术例如Southern印迹法或荧光原位杂交(FISH)分析。但是细胞遗传学、FISH分析和Southern印迹法的检测敏感度通常都不低于1-5％，这使得它们不适用于MRD的检测。
尽管PCR在本质上非常适合于快速的和大量的诊断性测试或者筛选，但是每个PCR分析通常只分析0.1到4-5kb核酸(DNA或RNA)，这极大地阻碍了对巨大量的染色体和染色体内的断点簇或融合区域或其基因产物的快速筛选。PCR的其他缺点是其对错配引物的固有的敏感性。可以一直存在于与引物互补的基因片段的核酸序列内的较小的变更将使得按所需的作用操纵PCR成为不可能，并可以造成误诊和假阴性的结果。特别是假阴性的结果使得基于PCR的诊断性测试法虽然非常的特异，却不适用于可靠的诊断，毫无疑问，只有对恶性肿瘤的可靠诊断才能有助于对预后的认识以及有助于对合适治疗的设计。
如上所述，绝大多数的现有技术都针对于检测特异的染色体畸变，包括在染色体或核酸(DNA或RNA)水平的分析。但是，在蛋白水平检测染色体畸变也是可能的。
在白血病诊断学领域已经进行了相当大的努力，以建立一种免疫检测染色体畸变所形成的融合蛋白的合适技术。这些研究中的多个研究都集中于寻找只与肿瘤特异蛋白反应而不会免疫检测机体内正常生成的非融合蛋白的免疫试剂(抗体)(见，例如Nagasaki et al.，J.Imm.Methods162，235-245，1993和Van Denderen et al.，J Exp Med.1989 169(1)87-98)。这些抗体通常与正常的细胞蛋白有着交叉反应。仅仅当已知特异的融合位点时，选择通过与融合位点的表位选择性结合而只与肿瘤特异蛋白反应的特异的免疫试剂才是可能的。但是，患者之间(DNA水平上的不同断点)和患者内(mRNA剪切变异)的融合蛋白的变异是如此之大，特异的免疫试剂只有在少数情况中才能发挥作用，这常常只根据患者的个体情况(patient-by-patient)(见Van Dongen et al.，Leukemia 1999；131901-1928)。另外，包括对融合蛋白的融合点的免疫检测的诊断性测试法有着主要的固有的缺点，就是它们要求专门的和较好装备的实验室以及受过训练的和非常熟练的个人。上面的测试法通常也只用于恶性肿瘤的可疑病例，它们并不适用于对白血病患者的染色体畸变的存在情况的大规模筛查。
容许只对融合蛋白A-B进行检测的更快速的和更便利的免疫学方法的发展是针对于检测融合蛋白的诊断性测试领域的重大步骤(见PCT/NL98/00289)。所报告的方法包括应用所谓的识别融合蛋白的一部分(A部分)的捕获抗体和标记的识别融合蛋白的另一部分(B部分)的检测抗体。在这样的一个系统中，捕获抗体与固体的支持层相连，例如EILSA板或测试条(P.Berendes，“Recognition of tumor-specific proteins in humancancer.”PhD Thesis Erasmus University Rotterdam，ISBN 90-73436-36-2)。捕获抗体也可以被固定到可以被流式细胞术所分析的珠上(见例如PCT/NL01/00945)。在珠结合的捕获抗体与怀疑含有融合蛋白的细胞裂解液孵育之后，用标记的检测抗体检测被结合的融合蛋白。
一种(基于珠的)捕获/检测抗体系统允许只对融合蛋白进行检测，并且它是精致和容易进行的，特别是当使用流式细胞术时。这样的一种检测系统也容许高通量的诊断多种临床样品。在诊断包括融合蛋白的恶性肿瘤时，当与可能含有天然(非融合的)蛋白的正常细胞的数目比较时，诊断性样品通常含有相当大量的具有融合蛋白的恶性细胞。当一个患者被诊断为ALL时，白血病细胞的总数接近于1012个，其中通常近乎25％到98％的细胞都含有编码融合蛋白的融合基因。因此，捕获/检测抗体细胞适合于快速筛查生成融合蛋白的染色体畸变。但是，捕获/检测抗体系统的敏感性常常表现出不足以检测到大量正常细胞的背景中的低频率的(＜1％)恶性细胞。作为一个实例，当前的捕获/检测抗体系统对于检测治疗随诊过程中的MRD是不适当的。因此，捕获/检测抗体系统的诊断性应用主要局限于最初诊断的阶段，此时骨髓或血液中的恶性细胞的频率是高的(一般＞10％)。总而言之，目前对容许便利地只对样品中的融合蛋白进行检测的方法有着特殊的需要，特别是当样品中只含有微量的融合蛋白的情况下。
现在已经意识到，在当前的方法中，融合蛋白和非融合的天然(即野生型)蛋白通常竞争与用于检测融合蛋白的探针的特异性结合。例如，融合蛋白A-B和非融合的天然蛋白A将竞争性与那些与融合蛋白的A部分特异性反应的捕获抗体、或其他类型的探针结合。类似的，融合蛋白A-B和非融合的天然蛋白B竞争性与那些与融合蛋白的B部分反应的捕获抗体特异性结合。因此，样品中所具有的融合蛋白相对于天然的非融合蛋白的比例很大程度上决定了用于检测包括至少两种天然蛋白的部分的融合蛋白的捕获/检测抗体系统的敏感性。当天然蛋白大大地多于感兴趣的融合蛋白时，天然蛋白可能占据捕获抗体的即使不是全部的也是绝大多数的结合位点，从而基本上阻止了融合蛋白的结合。此外，即使捕获抗体能有效地捕获到一些融合蛋白，但是提示标记的检测抗体的结合的信号强度可能不足以产生可靠的测试结果。
本发明提供了一种观点，即通过在检测融合蛋白的存在之前先清除所述样品中的一种或多种天然蛋白，以便使得所述样品中的所述融合蛋白的量相对于一种或多种“竞争性”天然蛋白是富集的，以增加用于检测样品中的融合蛋白的方法的敏感性。本发明提供了一种通过对包括一个氨基末端片段和一个羧基末端片段的融合蛋白进行检测而检测融合蛋白(例如染色体易位形成的融合蛋白)的方法，每个末端片段各自对应于一种不同的天然蛋白，所述方法包括(i)将所述样品与至少一种与该天然蛋白的一部分特异性反应的结合分子在容许所述的至少一种结合分子与该天然蛋白之间形成复合物的条件下相接触，所述的天然蛋白的一部分不存在于所述融合蛋白中；(ii)从所述样品中去除所述复合物，以基本上清除所述样品中的所述天然蛋白，但不清除所述融合蛋白；和(iii)用至少一种针对于所述融合蛋白的抗体检测所述样品中的所述融合蛋白。术语天然蛋白或相关天然蛋白在此指的是可以与感兴趣的融合蛋白竞争结合用于检测融合蛋白的探针或试剂(例如捕获抗体)的非融合的、野生型蛋白。本发明的天然蛋白可以采用天然构象(生理环境中的蛋白的三维结构)或变性构象。
根据本发明，融合蛋白来源于恶性细胞的融合基因或来源于人工生成的融合基因。在包括一个氨基末端片段和一个羧基末端片段的融合蛋白中，每个片段各自对应于一种天然蛋白，所述片段通常是经断点融合或融合区域而彼此直接地融合或连接，这样这些片段一起就代表整个融合蛋白。片段的长度或大小可以不同，无论是氨基末端或羧基末端的片段。如果融合区域定位于融合蛋白的近似中途，则融合蛋白包括一个相同大小的氨基(N)末端片段和羧基(C)末端片段。在其他情况中，融合区域定位于更接近于融合蛋白的C末端或N末端的位置，使得融合蛋白分别由大的N末端片段和小的C末端片段或者大的C末端片段和小的N末端片段构成。本发明的融合蛋白含有足够多的融合区域的上游氨基酸和下游氨基酸，使得容许与位于融合蛋白区域的相对侧上的融合蛋白的部分特异性反应的抗体探针或在功能上与其等价的结合片段的识别。
在本发明的方法中，相对于一种或多种“竞争性”天然蛋白，样品中的融合蛋白是富集的，造成了融合蛋白对针对所述融合蛋白的探针的结合的增加。所提供的方法特别适合于增加用于检测融合蛋白的捕获/检测抗体或三明治系统的敏感性。因此，本发明提供了对利用现有的检测方法所遇到的主要问题的解决方法，其中天然蛋白饱和或“消耗”了用于检测融合蛋白的探针例如捕获抗体，从而阻止了融合蛋白与所述探针的结合。显而易见的是，天然蛋白的探针饱和降低了检测相同样品中所存在的融合蛋白的敏感性。通过清除本发明的样品中的竞争性天然蛋白，极大地增加了融合蛋白/天然蛋白的比例，因此有利于检测探针的结合以及融合蛋白的检测。通过在此所提供的方法，现在以相对快速和简单的方式特异地检测融合蛋白的存在是可能的，甚至当样品中只存在有限量的所述融合蛋白时。例如，这容许应用捕获/检测抗体系统检测样品中的肿瘤特异性融合蛋白，这样的样品中只包括存在于大量正常细胞背景中的小群的融合蛋白阳性的恶性细胞，含有大量的竞争性天然蛋白。
此外，通过根据本发明的方法，现在还有可能计算出天然蛋白的量(如正常细胞数目的测定值)相对于融合蛋白的量(如恶性细胞数目的测定值)的比例。可以用所得到的正常蛋白对融合蛋白的份额(ration)确定出恶性细胞的相对频率，即MRD水平。
本发明提供了一种观点，即通过清除细胞中的至少一种相关天然蛋白可以增加检测细胞内存在融合蛋白的敏感性，例如恶性细胞内存在的嵌合的癌蛋白。当然，在检测融合蛋白之前先清除一种以上的天然蛋白是可能的。显而易见的是，当检测也含有显著量的能与用于捕获融合蛋白的探针竞争结合的天然蛋白的样品中的融合蛋白时，应用在此所提供的方法是极为有利的。在一个实例中，提供了一种通过确定样品中存在恶性细胞而检测MRD的方法，所述方法包括检测样品中的肿瘤特异性融合蛋白，所述融合蛋白包括至少两种天然的、非肿瘤特异性蛋白的部分，在所述的检测步骤之前进行的是“预清除”步骤，其中清除了所述样品中的至少一种所述的天然蛋白，否则它们将竞争融合蛋白的检测。
在本发明的方法中，用至少一种结合分子从样品中去除一种或多种天然蛋白。样品包括生物样品例如血液样品、血清样品、组织样品、骨髓、脑脊液样品、活检组织和其他可以含有一个或多个表达融合基因所编码的融合蛋白的细胞的样品。以使得结合分子充分地接近天然蛋白的方式处理样品。因为许多细胞蛋白位于细胞内，通常通过破坏细胞的膜完整性而实现这一点。例如，以这样的方式处理样品，使得产生了细胞裂解液或细胞匀浆，这些是例如通过细胞的机械破裂或通过将细胞暴露于含有去污剂的细胞裂解缓冲液中而得到的。合适的结合分子优选地包括一种蛋白或一种多肽，如一种抗体或抗体片段。但是，在实现在此所提供的方法时也可使用其他类型的结合分子。利用本领域已知的各种标准的方法可以得到特异抗体或其片段，包括在实验室动物中生成多克隆抗体的方法、利用传统的杂交瘤技术得到单克隆抗体的方法、和利用噬菌体展示选择过程的单链Fv抗体片段(scFv)。这样的抗体或抗体片段在此还被叫做“清除抗体”。
对于与天然蛋白而不是与包括所述天然蛋白的一部分的融合蛋白反应的结合分子(例如清除抗体)的设计或发展，知道所述天然蛋白的哪一部分或片段是融合蛋白的部分以及哪一部分不是当然是关键的。换句话说，确定所检测的融合蛋白的融合点或融合区域是优选的。本发明的方法被优先地用于检测为已知染色体畸变结果的融合蛋白。在这些情况中，已经详细地描述了所形成的融合基因和融合蛋白。熟知的实例是形成在＞95％的CML病例和在30％的成人ALL病例中所发现的BCR-ABL融合基因的易位，和形成在25-30％的儿童ALL病例中所发现的TEL-AML1融合基因的易位。但是，已知白血病包括更多种的融合基因和所编码的融合蛋白，例如E2A-PBX1、ETO-AML1和PML-RARα。
要明白本发明的应用并不限定于对白血病的检测，也可用于检测以融合基因和融合蛋白的存在为特征的一些其他的、非白血病的疾病。例如，在间变大细胞淋巴瘤(ALCL)中可以观察到下面的ALK融合基因融合基因NPM-ALK来源于染色体畸变t(2；5)(p23；q35)；融合基因TFG-ALK来源于t(2；3)(p23；q21)和融合基因ATIC-ALK来源于inv(2)(p23q35)。根据本发明利用与天然ALK反应而不与融合蛋白反应的清除抗体对样品中的天然ALK蛋白的清除将增加随后的捕获/检测测定法的敏感性。在另一个实施方式中，本发明被优先地应用于检测在Ewing肉瘤(EWS)中所观察到的染色体畸变，例如t(11；22)(q24；q12)形成了EWS-FLI1融合蛋白，t(21；22)(q22；q12)形成了EWS-ERG融合蛋白，和t(7；22)(p22；q12)生成了EWS-ETV1融合蛋白。骨的Ewing肉瘤(EWS)/周围原始神经外胚层瘤(PNET)是一类在儿童和青年人中常见的癌症。发病高峰在10岁和20岁年龄之间，在小于5岁的儿童或超过30岁的成人中少见。Ewing肉瘤可以出现在身体的任何骨骼中；最常见的部位是骨盆、大腿、小腿、上肢、和肋骨。根据本发明，在预清除步骤中对正常的细胞EWS蛋白的清除(和/或任意地清除融合的配体基因例如FLI1、ERG或ETV1)将增加检测与Ewing肉瘤相关的融合蛋白的敏感性。
因此，本发明容许本领域的熟练人员应用和实施本发明，且没有诊断或分类任何类型的疾病的过度负担，所述疾病与融合基因的存在有关，该融合基因被翻译成包括一个氨基末端片段和一个羧基末端片段的融合蛋白，每个片段各自对应于一种天然蛋白。
根据融合蛋白的结构，可以容易地确定出天然蛋白的哪个部分不存在于融合蛋白内。可以用与该部分或其伸展链(多肽)特异性反应的结合分子从样品中基本上去除天然蛋白，但不清除融合蛋白。本领域人员将认识到需要用哪些步骤得到与天然(野生型)蛋白特异性反应而不与融合蛋白反应的结合分子。在一个优选的实施方式中，这样的一种特异结合分子是一种抗体或在功能上与其等价的结合片段。
生产抗体的方法对于本领域人员是已知的。例如，为了得到一种多克隆抗体，用免疫原免疫接种实验动物。在本发明的方法中，所述的免疫原优选地是对应于天然蛋白的所选的伸展链或区域的一种重组蛋白片段或一种合成的肽。通过取测试血样和确定反应性的滴度监测动物的免疫应答。当得到合适的高滴度时，收集动物的血并制备抗血清。如果需要可进行对抗血清的进一步分级分离，以富集与天然蛋白反应的抗体。见例如，Harlow et al.Antibodies.A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPublications，New York(1988)。通过各种本领域已知的方法可以得到多克隆抗体，例如通过经加入聚乙二醇(PEG)的被接种小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞株的融合。将融合的细胞培养在选择培养基中，例如含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷混和物的培养基。测试在该选择培养基中存活的融合细胞是否生产所需的抗体(例如通过固相免疫测试法例如ELISA)，如果阳性，将培养物克隆使得在每个培养孔中只含有一个细胞。这就生成了来自单个祖先的细胞克�。怯谰玫暮偷タ寺】固宓纳�。利用传统的免疫诊断技术描绘所得到的抗体，例如通过利用表达(重组)天然蛋白或(重组)融合蛋白的细胞的裂解液的Western印迹法。仅仅那些与天然蛋白A反应而不与融合蛋白A-B反应的抗体适合于用作为本发明的方法中的清除抗体。
根据本发明，在检测融合蛋白之前，先从样品中去除清除抗体和天然蛋白之间的复合物。在一个实施方式中，提供了一种通过例如抗体/抗原复合物的形成使得能从细胞裂解液或匀浆中快速地和选择性地去除或沉淀出天然蛋白的方法。为此，将样品与至少一种与天然蛋白特异性反应的结合分子在容许在所述结合分子和所述天然蛋白之间形成复合物的条件下相接触。在本发明的方法中，可以使用各种分离技术从样品中去除复合物。常使用的从粗制混和物中沉淀出抗体/抗原复合物的方法包括固相免疫沉淀。在一个实施方式中，通过添加能结合所述复合物的固体珠或微球以形成在基本液体样品中的珠的悬浮液，可以将所述复合物从所述样品中去除。根据本发明，合适的珠包括琼脂糖珠、或聚苯乙烯珠、或任何种类的容许从样品中简便地去除珠结合的复合物的固体颗粒。固体珠的优点是它们可以被简便地从样品中分离沉淀出来，通常通过离心悬浮液的方法。或者，通过过滤悬浮液得到了预清除的样品。在本发明的一个实施方式中，将样品与清除抗体接触以形成天然蛋白和固定在珠上的免疫球蛋白结合蛋白之间的复合物，结合蛋白被用于从所述样品中去除所述复合物。存在各种类型的可适合使用的免疫球蛋白结合蛋白(Antibodies，a Laboratory Manual，E.Harlow & D.Lane，(1988))。这些蛋白包括蛋白A、蛋白G和金黄色葡萄球菌的细菌的细胞外壳(ghost)。金黄色葡萄糖球菌在其表面上具有被称为蛋白A的特殊蛋白，它是多能的、广谱的IgG结合剂。蛋白A与抗体(IgG型)的Fc部分结合，但不干扰它们与抗原的结合。多种哺乳动物物种的抗体一般都与蛋白A反应。在另一个实施方式中，用2型GammaBind G或蛋白G去除样品中的清除抗体和天然蛋白的复合物。2型GammaBind G和蛋白G是链球菌蛋白G的基因工程加工成的形式。两种蛋白都在大肠杆菌中生成。它们与多种类型的免疫球蛋白G的恒定区结合，并被广泛地用于检测、定量和纯化IgG抗体和抗原/抗体复合物。2型GammaBind G和蛋白G是可得到的最普遍适用的抗体结合蛋白。与蛋白A比较，它们与多种不同物种的抗体紧密地及特异地结合。例如，2型GammaBind G与小鼠和大鼠的IgG结合得更好，2型GammaBind G和蛋白G与来自人IgG的所有亚型都选择性地结合。可以从不同的供应商中可商品化地得到细菌外壳、免疫球蛋白结合蛋白和免疫球蛋白结合蛋白所包被的珠，例如Pharmacia Biotech AB、Sigma Aldrich或Pierce。在此所提供的方法中，在形成天然蛋白和清除抗体之间的复合物之后，细菌外壳或包被珠与细胞样品或细胞匀浆混和，在此期间免疫球蛋白结合蛋白附着到清除抗体上。简易的和简单的沉淀或过滤步骤可以从样品中分离出具有附着了清除抗体/天然蛋白复合物的细菌外壳或珠。
但是，在一个优选的实施方式中，结合分子(优选地是一种清除抗体)被直接地结合到或固定到珠上或另一种固体颗粒上。在合成的微珠上展示生化试剂是生物分析测试法发展中的流行趋势。基于珠的展示系统(例如，共价结合、生物素-抗生物素蛋白链菌素、His-tag)的商业化来源(例如Spherotech，IL；Bangs，IN；Polysciences；PA)；Molecular Probes，OR)目前是可获得的。直接与珠缀合的清除抗体的应用不需要间断使用免疫球蛋白结合蛋白，并通常将造成特异性的增高。在孵育足够长的时间之后，可以从样品(例如裂解液或匀浆)中去除附着有与天然蛋白复合的清除抗体的珠。例如通过离心容易并快速地实现从样品中去除珠，形成了基本上清除了天然蛋白的样品，这些天然蛋白否则将与融合蛋白竞争与针对于所述融合蛋白的探针的结合。因为这个清除步骤形成了富集了融合蛋白相对于“竞争性”天然、非融合蛋白的量的样品，因此显著地增加了融合蛋白与这样的探针例如捕获抗体结合的可能性。例如，现在提供了一种容许用敏感性增加的捕获/检测系统检测融合蛋白的方法。
在本发明的另一个实施方式中，将清除抗体或任何其他类型的合适的结合分子与磁珠缀合。这就容许利用免疫磁性分离法(IMS)从样品中清除珠结合的复合物。IMS是一种技术，它包括往细胞裂解液中添加与相关抗原特异性反应的结合分子所包被的磁珠。混和珠及裂解液以形成一个(抗原/抗体)复合物，在此期间形成了清除抗体或其他结合分子和天然蛋白之间的复合物。在特定的孵育时间之后，应用磁场将附着有复合物的磁珠或磁性颗粒与其他物质分离，留下了已被清除的或“预清除的”样品。合适的磁珠是例如Spherotec Inc.(www.spherotech.Com)上市的商标名为SPHERO磁性颗粒的磁珠。通过给单分散的(即统一大小的)聚苯乙烯的核心颗粒包被上一层磁石和聚苯乙烯而制备出磁珠(见美国专利5,091,206)。因此，颗粒在形态上是球形的以及在性能上是顺磁性的。它们在大小上也是非常统一的。可以调整这些磁性颗粒的磁石含量，但其含量通常为约10％到15％。可以容易地从悬浮液中磁性地分离出磁性颗粒。当这些颗粒从磁铁中取出时，它们成为非磁性的，并且不保留任何可检测到的磁性，即使在重新暴露于磁场之后。可以将磁性颗粒用于细胞分离、亲和纯化、DNA探针检测、磁性颗粒EIA等。各种大小的珠例如琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、乳胶珠、磁珠等等都是可商品化得到的。在一个优选的实施方式中，使用了具有相当小直径的珠，因为对于特定体积的珠，小珠比大珠具有更大的表面积。珠的表面积越大，固定到珠上的结合分子就越多，以及每体积珠从样品中去除天然蛋白就更有效。当从小样品量的样品中去除天然蛋白时，这是特别有用的。
综上，本发明解决了捕获/检测抗体系统对于检测样品中存在的少量融合蛋白常常不够敏感的问题，尽管该系统可被快速和容易地实施。提供了一种以已增加了的敏感性检测包括两种不同的天然蛋白的部分的融合蛋白的方法，通过引入预处理步骤而得到样品，所述样品中相对于所述一种或两种天然蛋白的量而言，感兴趣的融合蛋白被富集了。进一步处理这个富集了的、或预清除了的样品，以检测融合蛋白的存在。理论上，利用针对于A-B融合蛋白的A部分的单个抗体(或其功能等价物)可以检测用所提供的方法完全清除了其中的天然蛋白A的样品中存在的融合蛋白A-B。但是，在实践中很难得到不含有任何天然蛋白A的预清除的样品，单个的A特异性抗体不可能一直都给出所需的检测特异性。因此，为了只对A-B融合蛋白进行检测，优选地使用至少一种针对于融合蛋白的B部分的附加抗体。例如，用一组至少第一和第二抗体检测融合蛋白，每种抗体各自能识别位于所述融合蛋白的融合区域的相对侧上的一个结合位点。在本发明的一个优选的实施方式中，本发明提供了一种方法，其中通过流式细胞术检测或通过任何其他的便利方法利用至少两种抗体探针测定珠相关的荧光而检测来源于融合基因的融合蛋白，其中至少一种抗体针对于包括融合蛋白的氨基末端的蛋白片段，以及至少另一种抗体针对于包括融合蛋白的羧基末端的蛋白片段。
为了检测样品中的抗原或抗体，当与流式细胞术联合时，使用微球、珠或其他颗粒作为抗原-抗体反应的固体支持物是特别吸引人的(见例如，美国专利6,159,748)。在一个优选的实施方式中，抗体探针与珠结合，这就容许经流式细胞术检测融合蛋白。流式细胞术具有检测颗粒大小差异的能力，并且它是高度敏感的荧光检测仪。通过前向角光散射(FALS)或电子体积可以确定出微球的大小。与直角光散射(RALS)联合使用时，流式细胞术可以区分出单一的和聚集的颗粒。
本发明的方法对于肿瘤特异性蛋白的检测是非常吸引人的，肿瘤特异性蛋白包括氨基末端片段和羧基末端片段，它们分别对应于不同的非肿瘤特异性蛋白。所述肿瘤特异性融合蛋白是例如费城染色体畸变所生成的异常BCR-ABL蛋白。在检测之前，通过利用至少一种与ABL或BCR蛋白(的片段)特异性反应，但不与BCR-ABL融合蛋白特异性反应的结合分子从所分析的样品中清除天然蛋白BCR和ABL中的一种或两种。在去除了包括BCR和/或ABL的复合物之后，优选地用一组至少第一和第二抗体检测BCR-ABL融合蛋白，其中每个抗体识别位于融合蛋白的融合区域的相对侧上的结合位点。利用捕获/检测系统可以检测融合蛋白，例如利用流式细胞术、ELISA、或测试条法(也见下面的实施例)。
本发明的方法特别适合于检测非常少量的表达融合蛋白的细胞(例如在MRD中所见到的＜1％)。但是，它当然也能被优先地用于增加不需要专门的低检测限度的检测方法的敏感性，例如那些用于与融合蛋白的存在相关的疾病的最初诊断的检测方法。也在这些情况中，在检测融合蛋白之前去除一种或多种天然蛋白将造成敏感性的增加。在诊断阶段，常常需要研究在同一试管内所存在的不同的融合基因蛋白，优选地是同时研究。这不是因为特殊的恶性肿瘤会具有超过一种的融合基因蛋白，而是因为在单一试管内检测同一疾病类型中的一些熟知的融合基因蛋白是便利的，例如急性髓性白血病(AML)或前体B-ALL(表1)。
表1.单一试管内的一些融合蛋白的联合检测的实例
在一个优选的实施方式中，在此所提供的方法包括通过利用不同的针对不同的融合蛋白的一部分的珠结合的捕获抗体以及针对融合蛋白的其他部分的相关对应的检测抗体，优选地在单一试管检测中，进行对不同类型的融合蛋白的流式细胞术的检测。对于对多种融合蛋白的同步检测而言，通过联合FALS和荧光，使用不同大小的珠是可行的，每种珠都被包被了不同的捕获抗体。依赖于微球的化学组成，用蛋白被动地或共价地包被微球。根据珠的不同的流式细胞术的特点(例如大小、荧光染料颜色、荧光染料染色的强度、或侧向角特征)，可以在同一检测法中特异地检测出多种融合蛋白。这也包括对来自同一靶基因的各种不同的易位的融合蛋白以及来自具有不同的断点的易位的融合蛋白的检测。本发明的用于检测一种或多种融合蛋白的方法，无论其利用的是一种捕获/检测系统还是任何其他类型的检测方法，其关键部分均为在检测融合蛋白之前先清除一种或多种相关的天然的、非融合的蛋白这一点。利用一种或多种结合分子例如清除抗体可以实现这一目的，结合分子可以特异地识别并与天然蛋白结合形成复合物。不同类型的蛋白可以被附着于不同的单个的如珠的固体表面上。或者，与不同的天然蛋白特异性反应的多个结合配体与相同的珠结合，这样就可以只用单一的珠同时清除样品中的多个天然蛋白。这是特别令人感兴趣的，当本发明的方法被用于研究在同一试管内同时存在不同的融合蛋白时，例如对于在同一疾病类型内的恶性肿瘤的诊断，特别是当在诊断时使用了具有低肿瘤负荷(例如，小于5％)的患者样品时。
因此，当与现有的检测方法比较时，本发明的方法容许在同一试管检测中以高特异性和提高了的敏感性同时检测第一融合蛋白A-B，它包括天然蛋白A的N末端片段和天然蛋白B的C末端片段，和第二融合蛋白C-D，它包括天然蛋白C的N末端片段和天然蛋白D的C末端片段。在这个具体的实例中，利用将具有低肿瘤负荷的患者样品与一种与蛋白A的C末端片段特异性反应的清除抗体(抗A)以及一种与蛋白D的N末端片段特异性反应的清除抗体(抗D)接触，以相应地从样品中清除天然蛋白A和D。优选地将抗A和抗D清除抗体固定到(小)珠上，基于使用效率和简便的原因，甚至更优选地将抗体固定到相同的珠上。在这个由珠/抗A/蛋白A/抗D/蛋白D构成的特殊实例中，简单的离心步骤一般足以从样品中分离出复合物。因此，得到了基本上清除了天然蛋白A和D的样品。这将提高融合蛋白A-B和C-D被它们的特异探针所识别的可能性，探针例如是与融合蛋白A-B的N末端片段和融合蛋白C-D的C末端片段特异性反应的捕获抗体。
除了有限的敏感性之外，现有的用于检测样品中的融合蛋白的方法面临着一个常见的问题，就是限制了定量所检测的融合蛋白的量的可能性。特别的，当将这些方法应用为诊断工具时，非常希望能定量或至少半定量融合蛋白。如果有任何可能，可以将提示融合蛋白存在的检测信号例如荧光强度表示为相对于一种无论是否存在融合蛋白都被假定为恒定的内在对照因子的量。这样的因子可以是例如所分析的细胞的数目或样品的总的蛋白含量。可以将这个相对数值用于比较不同样品的目的，例如比较阳性和阴性对照样品。显而易见的，还需要更多的关于直接地描述包括两种天然蛋白的部分的融合蛋白相对于一种或甚至两种非融合的天然蛋白的存在情况。
至今为止，没有一种现有的检测方法容许进行定量检测。重要的是，本发明现在提供了一种针对这个问题的简单的和直接的解决方法。进一步优选地分析在本发明的方法中从样品中所去除的含有一种或多种清除的天然蛋白的复合物，以提示从所述样品中所清除的天然蛋白的量。在一个优选的实施方式中，这个分析包括至少一种能特异地结合所清除的或分离的复合物的一种或多种成分的试剂的应用，随后确定所述试剂与所述复合物的结合以作为从所述样品中清除的天然蛋白的量的指征。试剂优选地包括一种结合配体，如抗体或其功能等价物片段，它能结合清除的天然蛋白。在一个优选的实施方式中，用针对于清除的天然蛋白上的远离天然蛋白和清除抗体之间相互作用的位点的区域的试剂检测清除的复合物。更优选地，用于检测清除的天然蛋白的试剂与同样存在于融合蛋白内的天然蛋白的部分反应。例如，将用于检测A-B融合蛋白的“捕获抗体”用作试剂优先地检测清除的蛋白A。试剂优选地具有一个报告分子或标记，如荧光染料，以容许通过标记的试剂与清除的蛋白的结合检测复合物。
利用流式细胞术优先地实施对复合物的检测，以确定从样品中清除的天然蛋白的量。在一个实施方式中，将清除抗体与珠缀合。合适的珠包括那些上述讨论的用于检测融合蛋白的珠，包括与流式细胞术兼容的磁珠。
当已知了清除的天然蛋白的量时，可以将这个信息作为细胞物质的量或总蛋白含量的指征。换句话说，清除的蛋白可以用作为诊断测试中的一种“内对照”。当描述在分离的复合物中的蛋白相对于细胞物质的量或细胞数目的存在情况(表达)时，当然优选地是所分离的复合物含有试剂所检测的足够多的所述天然蛋白。因此，进一步作为对细胞物质的量的测定的被清除并被分析的天然蛋白优选地包括在所述的细胞内是相当普遍存在的蛋白。另外，重要的是所述的天然蛋白的表达没有大的变异，例如在个体细胞之间或在不同的细胞条件下。在一个优选的实施方式中，被清除并分析的所述的天然蛋白还是一种具有稳定表达的高丰度蛋白，例如管家蛋白。例如，当检测样品中的BCR-ABL融合蛋白时，优先清除并随后检测天然ABL蛋白，因为ABL是一种高丰度蛋白。
但是融合蛋白并不一直都包括一种高丰度天然蛋白的片段。例如，在E2A-PBX1融合蛋白中，碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子E2A的N末端激活结构域被连接到前B细胞白血病转录因子1(PBX1)的大部分上。转录因子的表达通常是低水平的并是细胞类型特异的方式。因此，在这些情况中，用任何清除的天然蛋白作为一种内对照并不是优选的。取而代之的是，优先使用一种附加的(抗体)探针，它能同时清除样品中的高丰度蛋白。为了进一步说明这一点，在上面所述的情形中，将样品例如细胞裂解液与用两种抗体包被的珠接触一种抗体与天然E2A反应，但不与E2A-PBX1融合蛋白反应，以清除样品中的竞争性的E2A蛋白，以及一种抗体与管家蛋白(例如ABL)反应以同时清除样品中的能作用为内对照的管家蛋白。
根据本发明，通过构建描述天然蛋白的测定量(例如荧光)对“已知”量的相对值的曲线，可以进行对清除的天然蛋白的(半)定量分析。优选地，“已知的”样品含有所选量的天然蛋白，所选的量跨越了在“未知”样品所预期存在的天然蛋白的浓度范围(例如，用正常细胞的(系列)稀释物)。然后可以用这样的标准曲线确定出在含有清除的复合物的“未知”样品(或其稀释物)中的清除的天然蛋白物质的浓度。
本发明提供了在上面所讨论的方法，它使用了报告分子所标记的或缀合的探针，报告分子例如是生物素、洋地黄毒苷、酶例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、或其他的本领域已知的报告分子或报告颗粒，例如珠。本发明还提供了一种诊断试剂盒，它包括实施本发明的方法所必需的所有工具，例如结合分子、(缀合的)珠、(标记的)探针或试剂或底物或说明书。优选地用本发明所提供的方法或诊断试剂盒检测在特定类型的癌症中所发现的染色体畸变，例如白血�。约梁锌杀挥糜诩觳饣颊咧械�(残留)癌症或整体地筛选大规模人群中的癌症。
本发明的方法的优点是(1)同时且分开地分析多个融合蛋白(最适切的是在诊断的时候)的能力；(2)结合蛋白对微球的简便性；(3)流式细胞术检测小颗粒大小差异的能力；和(4)流式细胞术作为一种同时检测不同波长的检测仪的敏锐的敏感性。可得到的自动取样系统使得它在这个方面是更为吸引人的。
本发明的方法被优先地用于对生物样品例如血液样品、血清样品、细胞样品、组织样品、脑脊液、骨髓、活检组织的染色体畸变的诊断性测试。本发明提供了一种在诊断性测试中所用的方法，其中该测试需要高敏感性和高特异性。所提供的方法现在容许诊断恶性肿瘤和在患有各种类型癌症的患者的随诊过程中严密地监测MRD，这些癌症包括生成融合基因的染色体畸变、倒位或缺失。在疾病的治疗之前、期间和之后，提供了本发明的方法的应用以评价所述治疗的有效性。
实施例对预清除的细胞裂解液中的BCR-ABL融合蛋白的检测这个实施例说明了在捕获/检测抗体测定法检测之前如何从样品中去除正常的(即天然的)ABL，以提高在MRD测定中检测BCR-ABL融合蛋白的敏感性。可以用抗ABL的N末端部分的抗ABL抗体进行这样的“预清除”步骤。将清除所有在细胞内所表达的正常的ABL，仅仅存在于BCR-ABL融合蛋白内的ABL片段将与带有抗ABL的C末端部分的抗ABL捕获抗体的检测珠结合。然后用与荧光标记缀合的抗BCR检测抗体检测与珠结合的BCR-ABL。
材料1)将取自MRD患者的白血病细胞培养在培养基中。
2)磷酸缓冲液(PBS)/2％胎牛血清(FCS)将2ml FCS(热灭活)加入到100ml PBS(pH 7.8)中；储存在4℃。
3)放射免疫沉淀(RIPA)缓冲液(没有脱氧胆酸盐)50ml RIPA-缓冲液的制备50mM Tris-HCl使用2.5ml 1M Tris-HCl储存液150mM NaCl使用1.5ml 5M NaCl储存液1％NP40使用0.5ml未稀释的Nonidet P40(BDH，#56009 2L)0.1％SDS使用0.5ml 10％SDS储存液加入45ml milliQ储存在4℃。
4)蛋白酶抑制剂鸡尾酒，Sigma，#P2714将粉末溶解在2ml milli Q中，以制备50x浓缩溶液，储存在4℃。
5)预清除珠用针对ABL的N末端的清除抗体包被聚苯乙烯珠(＞10μM)。
6)检测珠用针对ABL的C末端的捕获抗体包被Luminex、PolyScience、或Molecular Probe珠。
7)检测抗体针对于BCR的末端的FITC或生物素缀合的抗体。
8)抗生物素蛋白链菌素(SA)-PE，实验室编号#SA1004-1。
方法制备细胞裂解液1)将所需要的和精确计算过的数目的细胞转移到干净的试管内，并用PBS冲洗细胞两次。对于融合蛋白的分析通常需要最少1×106个细胞。但是，如果预计MRD水平(异常融合蛋白水平)是非常低时，可能需要最多到50×106个细胞。
2)在期间，计算出制备细胞裂解液所需的RIPA-缓冲液的体积每500,000个细胞需要50μl RIPA-缓冲液。将RIPA-缓冲液转移到15ml试管内并加入50x浓缩的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(每1ml RIPA-缓冲液加入20μl蛋白酶抑制剂鸡尾酒)。
3)将细胞碎片重悬在含有蛋白酶抑制剂的足够多量的RIPA-缓冲液中(5×106/ml)，并将溶液转移到干净的eppendorf管中。
4)在冰上孵育30分钟。
5)在10,000xg，4℃下离心10分钟。
6)将上清液(细胞裂解物)转移到干净的eppendorf管中。
细胞裂解液的预清除7)往100μl细胞裂解液样品中加入1×106个预清除珠；8)在冰上孵育30分钟。
9)在10,000xg下旋转3分钟，并将上清液转移到新的eppendorf管中。
10)重复步骤9。
融合蛋白的检测11)往一个试管内加入●100μl预清除了的细胞裂解液样品●10μl PBS+2％FCS中的10,000个捕获珠●25μl PBS+2％FCS中的1-2μg缀合的检测抗体12)在冰上孵育30分钟13)用500μl PBS/2％FCS洗涤珠，并在14,000xg下旋转1分钟。去除上清液并重复该步骤。
当使用生物素标记的检测抗体时，继续步骤14-18。
当使用FITC标记的检测抗体时，继续步骤17和18。
14)将SA-PE在PBS/2％FCS中稀释200倍，并珠重悬在每管20μl稀释的SA-PE中。
15)在室温下孵育10分钟。
16)用500μl PBS/2％FCS洗涤珠，并在14,000xg下旋转1分钟。去除上清液并重复该步骤。
17)在第二次洗涤之后，将珠重悬在每管150μl PBS/2％FCS中，并将其转移到FACS管中。
18)用流式细胞术测定珠上的标记的量。标记的量与细胞的最初数目的比率是MRD水平的测定值。
权利要求
1.一种用于测定样品中的融合蛋白的方法，所述融合蛋白包括一个氨基末端片段和一个羧基末端片段，每个片段各自对应于一种天然蛋白，所述方法包括-将所述样品与至少一种与所述天然蛋白的一部分特异性反应的结合分子在容许所述的至少一种结合分子与所述天然蛋白之间形成复合物的条件下相接触，所述的天然蛋白的一部分不存在于所述融合蛋白中；-从所述的样品中去除所述复合物，以清除所述样品中的所述天然蛋白；和-利用至少一种针对所述融合蛋白的抗体检测所述样品中的所述融合蛋白。
2.权利要求1的方法，其中所述的至少一种结合分子是一种抗体或在功能上与其等价的结合片段。
3.权利要求1或2的方法，其中所述的至少一种结合分子与一种固体颗粒缀合，所述固体颗粒优选地是一种珠。
4.权利要求3的方法，其中通过离心或通过磁性分离从所述样品中去除所述复合物。
5.权利要求1到4中任一项的方法，其中利用一组至少第一和第二抗体检测所述融合蛋白，每种抗体各自能够识别位于所述融合蛋白的融合区域的相对侧上的一个结合位点。
6.权利要求1到5中任一项的方法，其中至少一种抗体标记了荧光染料。
7.权利要求1到6中任一项的方法，其中至少一种抗体与珠结合。
8.权利要求1到7中任一项的方法，其中通过流式细胞术检测所述融合蛋白。
9.前述的权利要求中任一项的方法，还包括在从所述样品中去除所述复合物的步骤之后，利用至少一种能与所述复合物特异性结合的试剂检测所述复合物，以及确定所述的至少一种试剂与所述复合物的结合以作为从所述样品中清除的天然蛋白的量的指征。
10.权利要求9的方法，其中所述天然蛋白是一种高丰度蛋白或管家蛋白。
11.权利要求1到10中任一项的方法，其中所述融合蛋白包括一个氨基末端片段和一个羧基末端片段，每个片段各自对应于一种不同的非肿瘤特异性蛋白。
12.权利要求11的方法，其中所述融合蛋白是费城染色体畸变的结果。
13.权利要求12的方法，其中所述融合蛋白的氨基末端片段对应于ABL或BCR蛋白，而所述融合蛋白的羧基末端片段对应于BCR或ABL蛋白。
14.权利要求13的方法，其中所述的至少一种结合分子与ABL或BCR蛋白的一个片段特异性反应，但不与所述融合蛋白特异性反应，所述的至少一种结合分子优选地是一种抗体。
15.一种诊断试剂盒，其包括用于实施权利要求1到14中任一项的方法的一种结合分子和至少一种探针。
16.权利要求1到14中任一项的方法或权利要求15的诊断试剂盒在疾病的诊断和/或分类中的用途。
全文摘要
本发明涉及对肿瘤特异性融合蛋白等的检测。提供了一种用于检测样品中的融合蛋白的方法，所述融合蛋白包括一个氨基末端片段和一个羧基末端片段，每个片段各自对应于一种天然蛋白，所述方法包括将所述样品与至少一种与该天然蛋白的一部分特异性反应的结合分子在容许所述的至少一种结合分子与该天然蛋白之间形成复合物的条件下相接触，所述的天然蛋白的一部分不存在于所述融合蛋白中；从所述的样品中去除所述复合物，以清除所述样品中的所述天然蛋白，但不清除所述融合蛋白；和利用至少一种针对所述融合蛋白的抗体探针检测所述样品中的所述融合蛋白。也提供了用于实施本发明的方法的诊断试剂盒。
文档编号G01N33/68GK1836165SQ200480023036
公开日2006年9月20日 申请日期2004年8月11日 优先权日2003年8月12日
发明者弗兰克·雅各布·特奥多尔·施塔尔, 雅各布斯·约翰内斯·马里亚·范东恩 申请人:鹿特丹伊拉斯姆斯大学医疗中心
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