一种测定苹果汁中棒曲霉素的方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：：一种测定苹果汁中棒曲霉素的方法
技术领域：
：本发明属于食品安全检测领域，具体涉及食品中有害毒素化合物的检测方法，特别是涉及一种快速检测苹果汁中棒曲霉素的方法领域。
背景技术：
：棒曲霉素(Patulin，PAT)，又称展青霉素。化学名称4-羟基-4H-呋喃(3，2_c)并吡喃_2(6H)酮(4-hydroxy-4H-Furo[3，2-c]Pyran-2(6H)-One)，是属于真菌毒素的一类有毒化合物，主要是青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)和丝衣霉(Byssochlamys)等多种真菌的次生代谢产物，有强烈的抗菌活性，对动物的细胞和组织有很强的毒性，具有潜在的致癌、致畸和致突变性，主要存在于苹果、梨和葡萄。欧盟规定果汁、特别是苹果汁及含苹果汁的酒精饮料中，棒曲霉素最大限量为50iig/L，固体苹果产品中，棒曲霉素最大限量为25iig/L，儿童用苹果汁和婴儿食品中，棒曲霉素最大限量为10iig/L。目前，测定棒曲霉素的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱一质谱法(HPLC-MS)。目前尚未出台国家标准方法，仅有行业标准，SN/T2008-2007《进出口果汁中棒曲霉毒素的检测方法高效液相色谱法》规定了棒曲霉毒素测定的HPLC法，SN/T1859-2007《饮料中棒曲霉素和5-羟甲基糠醛的测定方法液相色谱一质谱法和气相色谱一质谱法》规定了棒曲霉素测定的GC-MS法，HPLC-MS法。GC-MS法均采用N，0-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)为衍生剂，为了降低检测限，分别采用增加称样量，大体积溶剂提�。篲液分配净化，多个离子面积和来定量，存在过程冗长，操作步骤繁琐，费时，试剂用量大等不足，因此，亟需一种快速、简便、高灵敏、准确、专一、耐用的苹果汁中棒曲霉素检测方法。这对于维护食品安全，保护人民的身体健康和消费者的合法权益，促进食品行业的快速发展均具有重要意义。
发明内容针对现有测定苹果汁中棒曲霉素方法存在过程冗长，操作步骤繁琐，费时，试剂用量大等不足，也未见有关快速、简便、灵敏度高、准确、专一、耐用的测定苹果汁中棒曲霉素的方法的报道。本发明的目的在于提供了一种测定苹果汁中棒曲霉素的快速，简便、灵敏、准确、专一、耐用的确证和定量方法。本发明具体提供了一种测定苹果汁中棒曲霉素的确证和定量方法。本发明的技术方案通过采用乙酸乙酯-正己烷提取苹果汁中棒曲霉素，用Carb/C18混合型固相萃取柱净化，N-甲基N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)为衍生剂，DB-35MS为色谱柱，建立了GC-MS法测定苹果汁中棒曲霉素的高灵敏度方法，通过选择性离子监测(SIM)模式选择离子的优化，消除苹果汁基质影响，增强抗干扰能力，降低检测限和定量重现性。本发明具体提供了一种快速测定苹果汁中棒曲霉素的方法，苹果汁经提取、净化，3衍生，气相色谱_质谱测定，选择离子监测模式，外标法定量，具体测定方法步骤如下称取5.00克苹果汁于离心管中，振�。�5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振�。尤隣.3-0.7克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，4500r/min离心3min;移取3.2mL上清液至乙酸乙酯活化Carb/C18混合型固相萃取柱，用加有30iiL冰乙酸的试管接受洗脱液，4-8mL乙酸乙酯洗脱，在4(TC下通氮气缓缓吹干，加240iiL乙腈溶解，准确移取150iiL溶解液至1.5mL螺纹口高回收率样品瓶中，加50iiL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应l-5min，冷却，供气相色谱_质谱测定。该方法是一种快速，简便、灵敏、准确、专一、耐用的确证和定量方法，广泛应用于苹果汁中棒曲霉素检测领域。本发明优先选用衍生化试剂为N-甲基N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)+特丁基二甲基硅基氯硅烷(TBDMCS)(99+1，V/V)。本发明中隔垫密封优先采用PTFE/硅橡胶/PTFE隔垫密封。本领域所熟知，棒曲霉素易溶于水、乙酸乙酯、丙酮、乙醇及氯仿，微溶于乙醚和苯，不溶于石油醚，其水溶液易分解，在有机溶剂中相对稳定。现有技术报道的提取溶剂有乙酸乙酯、乙酸乙酯_正己烷溶液(60+40，V/V)、乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)。本发明综合考虑苹果汁的特性和对后续的净化有利，选择乙酸乙酯_正己烷溶液(95+5，V/V)为提取溶剂，同时加入碳酸氢钠，目的是为了除去酚类物质，提高棒曲霉素的萃取率。众所周知，现有技术报道的净化方法主要有三类，一类为液_液萃�。尤胩妓崮迫芤壕换灰焕辔禾逖分苯蛹拥紺18、OASISHLB、聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物等固相萃取小柱上提取净化；一类为固相萃取法，使用硅胶固相萃取小柱，氰基固相萃取小柱，硅胶+弗罗里硅土固相萃取小柱等。苹果汁中含有大量的酚类物质、色素和脂类物质，它们的存在将影响衍生化反应，对测定有干扰，降低灵敏度，必须除去。选择Carb/C18混合型固相萃取柱为净化柱，结果表明，去除干扰的效果最好，洗脱物比较干净，基质背景和基线噪音低，可获得稳定、满意的回收率和较好的重现性。本发明充分考虑到，棒曲霉素为极性化合物，挥发性低，为增加挥发性，提高分离的柱效，降低检出限，需要衍生后进行GC-MS分析。现有技术报道均采用N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)为衍生化试剂，试验发现，采用N-甲基-N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)为衍生剂，特丁基二甲基硅烷衍生物(TB匿S)较为稳定，不易变化分解，比棒曲霉素三甲基硅烷衍生物(TMS)有更高的灵敏度，专一性好。本发明最终选择N-甲基-N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)为衍生剂。本领域熟知，衍生化反应一般为8(TC下加热60min，本发明经过反复试验确定采用在微波高档800W条件下，衍生化3min，大大縮短了反应时间。本发明通过对选择离子监测模式(SIM)离子选择的优化，有效提高方法的选择性和抗干扰能力、降低检测限和测定低限；本发明对苹果汁空白样品的分析，样品基质中含有155、167、255离子碎片，对定性定量测定干扰大，并结合棒曲霉素TBDMS衍生物的裂解途径，最终选定定性离子为183、184、211、212，183为定量离子，采用上述离子组合来定性和确证，抗干扰能力强，专一性强，灵敏度高，能准确地对棒曲霉素进行定性和定量分析。通过实施本发明具体的
发明内容，可以达到以下有益效果。1.选择Carb/C18混合型固相萃取柱为净化柱，有效除去了色素及其他干扰物质，为本发明首创。2.高灵敏度棒曲霉素的检出限(L0D)为O.5iig/kg，测定低限(L0Q)为2yg/kg。3.高准确度在O.5100iig/kg的范围内线性良好(rX).98)，在250iig/kg的添加水平范围内，平均回收率为87%102%，相对标准偏差(RSD)为2.8%12.0%。4.净化效果好加入碳酸氢钠和选择Carb/C18混合型固相萃取柱为净化柱，不仅能有效的除去苹果汁中的色素，还能有效除去了酚类物质和脂类物质，洗脱物更加"干净"，基质背景和基线噪音低，获得高灵敏度及稳定、满意的回收率和重现性。5.样品前处理时间短，流程简单，操作性强，易于掌握，无需良好训练和较高技能便能很好完成。使用的试剂为实验室常用试剂，价格便宜，易于采购，用量少，成本低。6.与已有报道的果蔬酱中测定棒曲霉素的方法相比具有更高灵敏度，棒曲霉素的检出限(LOD)为0.5iig/kg，测定低限(LOQ)为2iig/kg，为已有报道的果蔬酱中测定棒曲霉素的方法的五分之一。图l所示为为添加10iig/kg棒曲霉素TBDMS衍生物苹果汁样品选择离子(SIM)质谱图，棒曲霉素TBDMS衍生物的保留时间为8.651min。具体实施例方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指V/V体积百分比。本发明中设备和材料有Agilent7890A/5975C气相色谱-质谱仪(美国Agilent公司)，配备7683自动进样器、增强型化学工作站；氮吹仪(美国Organomation公司)；微波炉(格兰仕公司，800W);小型离心机；1.5mL螺纹口高回收率样品瓶(美国Agilent公司，P/N5183-2030);PTFE/硅橡胶/PTFE隔垫(美国Agilent公司，P/N5182-0729)。棒曲霉素标准品纯度为99.5%，Chemservice公司提供；BESEPCarb固相萃取柱，500mg，6mL，北京振翔公司；衍生化试剂N-甲基N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)+特丁基二甲基硅基氯硅烷(TBDMCS)(99+1，V/V)，lmLX10，(美国塞分科技公司)；乙腈、乙酸乙酯、正己烷(色谱纯)；水为超纯水。标准工作液的配制将棒曲霉素用乙腈配制成质量浓度为200mg/L的标准储备液，并根据需要稀释成适当质量浓度的标准工作液，于棕色储存瓶4t:下保存备用。本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。实施例一称取5.00克苹果汁于离心管中，振�。�5mL乙酸乙酯_正己烷溶液(95+5，V/V)，振�。尤�0.3克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，4500r/min离心3min;移取3.2mL上清液至乙酸乙酯活化Carb/C18混合型固相萃取柱，用加有30yL冰乙酸的试管接受洗脱液，4mL乙酸乙酯洗脱，在4(TC下通氮气缓缓吹干，加240iiL乙腈溶解，准确移取150iiL溶解液至1.5mL螺纹口高回收率样品瓶中，加50iiL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应lmin，冷却，供气相色谱_质谱测定。实施例二称取5.00克苹果汁于离心管中，振�。�5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振�。尤�0.4克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，4500r/min离心3min;移取3.2mL上清液至乙酸乙酯活化Carb/C18混合型固相萃取柱，用加有30iiL冰乙酸的试管接受洗脱液，6mL乙酸乙酯洗脱，在4(TC下通氮气缓缓吹干，加240iiL乙腈溶解，准确移取150iiL溶解液至1.5mL螺纹口高回收率样品瓶中，加50iiL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应3min，冷却，供气相色谱_质谱实施例三称取5.00克苹果汁于离心管中，振�。�5mL乙酸乙酯_正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，加入0.7克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，4500r/min离心3min;移取3.2mL上清液至乙酸乙酯活化Carb/C18混合型固相萃取柱，用加有30iiL冰乙酸的试管接受洗脱液，8mL乙酸乙酯洗脱，在4(TC下通氮气缓缓吹干，加240iiL乙腈溶解，准确移取150iiL溶解液至1.5mL螺纹口高回收率样品瓶中，加50iiL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应5min，冷却，供气相色谱_质谱测定。实施例四称取5.00克苹果汁于离心管中，振�。�5mL乙酸乙酯_正己烷溶液(95+5，V/V)，振�。尤�0.5克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，4500r/min离心3min;移取3.2mL上清液至乙酸乙酯活化Carb/C18混合型固相萃取柱，用加有30iiL冰乙酸的试管接受洗脱液，7mL乙酸乙酯洗脱，在4(TC下通氮气缓缓吹干，加240iiL乙腈溶解，准确移取150iiL溶解液至1.5mL螺纹口高回收率样品瓶中，加50iiL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应4min，冷却，供气相色谱_质谱测定。实施例五本发明比较了棒曲霉素特丁基二甲基硅烷(TB匿S)衍生物在DB-l、DB-5、DB-1701P、DB-35MS四种色谱柱的分离效果，发现棒曲霉素TBDMS衍生物在DB-1、DB-5、DB-1701P色谱柱上出现拖尾，灵敏度低，在DB-35MS色谱柱峰形尖锐、对称，灵敏度最高，最终选定DB-35MS色谱柱。参见附图1为添加50yg/kg棒曲霉素TBDMS衍生物番茄酱样品选择离子(SIM)质谱图，棒曲霉素TBDMS衍生物的保留时间为8.655min。从质谱图可以看出使用本发明的样品提取和净化方法及DB-35MS色谱柱，在棒曲霉素TBDMS衍生物出峰的时间窗口无干扰，半峰宽为0.025min，这对确证和定量测定有利。实施例六棒曲霉素易溶于水、乙酸乙酯、丙酮、乙醇及氯仿，微溶于乙醚和苯，不溶于石油醚。棒曲霉素的水溶液易分解，在有机溶剂中相对稳定。现有技术报道的提取溶剂有乙酸乙酉旨、乙酸乙酯-正己烷溶液(60+40，V/V)、乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)。综合考虑苹果汁的特性和对后续的净化有利，本发明经过比较和选择，最终选择乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)为提取溶剂。实施例七现有技术报道的净化方法主要有三类，一类为液-液萃�。尤胩妓崮迫芤壕换�6一类为液体样品直接加到C18、0ASISHLB、聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物等固相萃取小柱上提取净化；一类为固相萃取法，使用硅胶固相萃取小柱，氰基固相萃取小柱，硅胶+弗罗里硅土固相萃取小柱等。苹果汁中含有大量的酚类物质、色素和脂类物质，它们的存在将影响衍生化反应，对测定有干扰，降低灵敏度，必须除去。加入碳酸氢钠有效除去了酚类物质，活性炭对色素的吸附作用很强，C18可除去脂类物质。选择Carb/C18混合型固相萃取柱为净化柱，结果表明Carb/C18混合型固相萃取柱去除干扰的效果最好，洗脱物比较干净，基质背景和基线噪音低，在棒曲霉素TBDMS衍生物出峰的时间窗口无干扰，可获得稳定、满意的回收率和较好的重现性。选择乙酸乙酯为洗脱溶剂，实验比较了1、2、3、4、5、6、7mL乙酸乙酯洗脱效果。实验结果表明，5mL乙酸乙酯可将棒曲霉素完全洗脱，回收率95%以上。故最终选择5mL乙酸乙酯为洗脱液。实施例八棒曲霉素为极性化合物，挥发性低，为增加挥发性，提高分离的柱效，降低检出限，需要衍生后进行GC-MS分析。现有技术报道均采用N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)为衍生化试剂，试验发现，采用N-甲基N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)为衍生剂，特丁基二甲基硅烷衍生物(TB匿S)较为稳定，不易变化分解，比棒曲霉素三甲基硅烷衍生物(TMS)有更高的灵敏度，专一性好。最终选择N-甲基N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)为衍生剂。采用N-甲基N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)为衍生剂时，衍生化反应一般为8(TC下加热60min。本发明试验了微波加热衍生化反应，固定其它条件不变，改变微波加热时间，分别衍生1、2、3、4、5、6、7min，结果表明，微波加热时间对衍生化反应影响不大，最终选定衍生时间3min。实施例九通过上述实施例，参见现有文献报道的棒曲霉素TBDMS衍生物的质谱图，棒曲霉素TBDMS衍生物的特征离子为155、167、183、184、211、212、255，未出现分子离子峰m/z268，说明该分子结构并不稳定。m/z212是由分子离子峰失去丁烯分子后的碎片，m/z211是由分子离子峰失去特丁基自由基后的正离子碎片，继而失去CO分子关环得到m/z183的正离子碎片，m/z184的碎片可能为m/z183的正离子接受一个氢自由基而生成的自由基正离子，棒曲霉素TBDMS衍生物的裂解途径参见现有技术文献报道。选择离子监测(SM)经常被用于降低检测限和提高定量重现性。SIM的离子选择应能有效消除复杂基体干扰，经对苹果汁空白样品的分析，样品基质中含有155、167、255离子碎片，对定性定量测定干扰大，并结合棒曲霉素TBDMS衍生物的裂解途径，最终选定定性离子为183、184、211、212，183为定量离子，采用上述离子组合来定性和确证，抗干扰能力强，专一性强，灵敏度高，能准确地对棒曲霉素进行定性和定量分析。实施例十棒曲霉素的定量离子、定性离子及标准相对离子丰度见表1。定性依据进行苹果汁样品测定时，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致(变化范围在±0.5%之内)；并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离子相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度相差符合表1的有关规定，则可判断样品中存在棒曲霉素。本发明采用外标法定量。表1:定性确证时棒曲霉素的定量离子、定性离子和标准相对离子丰度及最大容许相对偏差<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*定量离子(Quantitativeions)定量方法外标法定量，采用本领域常规技术可知。实施例i^一配制棒曲霉素系列工作溶液，按上述实施例进行处理，衍生后上机测试。以棒曲霉素的质量浓度X(iig/mL)为横坐标，定量离子(m/z183)的质谱峰面积Y为纵坐标进行线性回归。棒曲霉素在0.01-1g/mL范围内线性良好，线性方程为Y=1.030X106X-1.288X104，r=0.9946。检出限(LOD)是指信噪比(S/N)大于3时的最低检测浓度，测定低限(L0Q)指信噪比(S/N)大于10时的最低检测浓度。本发明的检出限(LOD)和测定低限(LOQ)分别为0.5lig/kg禾口2lig/kg。实施例十二采用100%苹果汁为样品，做五个水平的添加试验，分别为2iig/kg、5iig/kg、10iig/kg、25iig/kg、50iig/kg，每个添加水平重复6次，按上述实施例进行回收试验，方法回收率和相对标准偏差符合国内外有关标准和法规的要求，参见表2。表2:苹果汁样品棒曲霉素添加回收率测定结果(n=6)添加水平(g/kg)棒曲霉素平均回收率(%)棒曲霉素相对标准偏差(%)29911.75989.510879.025892.88<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例十三本发明采用色谱条件为常规技术报道，在本发明中，DB-35MS毛细管色谱柱，30mX0.25mmX0.25ym，分流/不分流进样口，进样口温度250°C，脉冲不分流进样；脉冲压力2.758X105Pa;载气高纯氦气(纯度99.999%)，流速lmL/min;程序升温IO(TC保留2min，以25°C/min升至200。C，再以20°C/min升至270。C，全部程序时间15min，后运行温度280°C，时间5min，流速0.5mL/min;自动进样，进样量1PL。实施例十四本发明采用质谱条件为常规技术报道，在本发明中，离子源EI，电子倍增器电压为自动调谐值+200V;电离能量70eV;离子源温度230°C;四极杆温度150°C;接口温度280°C;采集模式SIM模式，扫描质量(m/z)范围40-350;溶剂延迟时间为5min。定量离子m/zl83，定性离子m/zl83、m/zl84、m/z211，m/z212，住留时间75ms。实施例十五参见上述实施例，结合现有技术报道果蔬酱中棒曲霉毒素测定方法，采用碳黑(Carb)固相萃取柱为净化柱，主要除去果蔬酱中的色素。本发明苹果汁中棒曲霉毒素测定方法中，采用Carb/C18混合型固相萃取柱为净化柱，不仅能有效的除去苹果汁中的色素，还能有效除去了酚类物质和脂类物质，洗脱物更加"干净"，基质背景和基线噪音低，获得高灵敏度，棒曲霉素的检出限(LOD)为O.5iig/kg，测定低限(LOQ)为2iig/kg，为现有技术报道果蔬酱中棒曲霉毒素测定方法的五分之一。权利要求一种快速测定苹果汁中棒曲霉素的方法，果蔬酱经提取、净化，衍生，气相色谱-质谱测定，选择离子监测模式，外标法定量，具体测定方法步骤如下称取5.00克苹果汁于离心管中，振�。�5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振�。尤�0.3-0.7克碳酸氢钠，剧烈振摇、离心；移取3.2mL上清液至乙酸乙酯活化Carb/C18混合型固相萃取柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，乙酸乙酯4-8mL洗脱，在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应1-5min，冷却，供气相色谱-质谱测定。全文摘要本发明公开了一种快速测定苹果汁中棒曲霉素的方法。通过称取5.00克苹果汁于离心管中，振�。�5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振�。尤�0.3-0.7克碳酸氢钠，剧烈振摇、离心后，移取3.2mL上清液至乙酸乙酯活化Carb/C18混合型固相萃取柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，4-8mL乙酸乙酯洗脱，通氮气吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波加热1-5min，冷却，供气相色谱-质谱测定。该方法是一种快速，简便、灵敏、准确、专一、耐用的确证和定量方法，广泛应用于苹果汁中棒曲霉素检测领域。文档编号G01N30/72GK101782560SQ201010120950公开日2010年7月21日申请日期2010年3月10日优先权日2010年3月10日发明者刘思聪,姚伟琴,李欣,李炎,李锋格,沈梦园,窦辉,胡建民,苏敏申请人:新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

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一种测定苹果汁中棒曲霉素的方法