专利名称：三聚细胞因子的三聚结合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明提供了能结合三聚细胞因子的三聚结合蛋白。更具体地提供了能以某种方 式结合的三聚结合物(trimeric binder)，从而在结合以后，能基本上封闭所述三聚细胞因 子的全部受体结合位点，进而抑制三聚细胞因子的潜在生物活性。一方面，本发明涉及能结 合肿瘤坏死因子配体超家族的细胞因子、包括肿瘤坏死因子(TNF)的三聚结合物。
背景技术：
细胞因子是高等真核生物分泌的小多肽，其负责细胞间的信号转导，且影响其它 细胞的生长、分裂和功能。它们是有效的、多效的多肽，其例如通过相应的受体，发挥局部的 或系统的细胞间调节因子的作用，因此在许多生物过程中起关键作用，例如免疫、炎症和造 血作用(骨髓中的血细胞的形成和发育)。细胞因子由多种细胞类型生产，包括成纤维细 胞、内皮细胞、巨噬细胞/单核细胞、和淋巴细胞。迄今为止，已经鉴别出了大量的细胞因 子，包括干扰素、肿瘤坏死因子、白介素和淋巴因子。它们与经典的激素不同，因为它们由许 多组织或细胞类型生产，而不是由专门的腺体生产。细胞因子_受体相互作用的调控是治疗性地干涉多种疾病和病理的有用机理。可 以与细胞因子相互作用的可溶性的结合蛋白能潜在地把细胞因子与受体隔开，由此降低或 阻止特定受体途径的激活。某些细胞因子以多亚基复合物形式出现，其含有多拷贝的相同亚基。肿瘤坏死 因子配体超家族(TNFLSF)中的巨噬细胞移行抑制因子(MIF)和蛋白，例如肿瘤坏死因子 (TNF ；TNFLSF成员2)和淋巴毒素α (LT-α ；TNFLSF成员1)，以3个相同亚基形成的同型三 聚体的形式出现。已知许多这样的三聚细胞因子会参与信号转导并起调节因子的作用，还 参与许多不同类型的疾病和医学适应症。已知TNF配体超家族的三聚细胞因子能在不同水平控制和调节免疫和炎症反应。 还已知TNF配体超家族成员与几种疾病有关，例如急性的或慢性的炎性疾病。现在，TNF 配体超家族具有至少17种公认的配体，包括LTA(淋巴毒素α ；TNFLSF成员1)，TNF(肿 瘤坏死因子；TNFLSF成员2)，LTB (淋巴毒素β ；TNFLSF成员3)，0X-40L TNFLS成员4)； CD40L (TNFLS 成员 5) ；FasL (TNFLS 成员 6) ；CD27L (TNFLS 成员 7) ；CD30L (TNFLS 成员 8)； 4-lBB-L(TNFLS 成员 9) ；TRAIL (TNFLS 成员 10) ；RANKL (TNFLS 成员 11) ；TTOAK (TNFLS 成员 12) ；APRIL (TNFLS 成员 13) ；BAFF (TNFLS 成员 13B) ；LIGHT (TNFLS 成员 14) ；VEGI (TNFLS 成 员 15)；和 GITRL (TNFLS 成员 18)。有证据表明，TNF配体超家族的三聚细胞因子的信号单元和它们的对应受体是3 个受体和3个配体装配成六聚体复合物的形式，其中一个细胞因子三聚体结合3个受体分 子(Bodmer 等 2002，TRENDS inBiochemical Sciences 27(1)，pp. 19-26)。在成为该六聚体复合物的一部分之前，受体以单体形式存在。图1解释了该一般机理。TNF(TNFLSF成员2)是免疫和炎症反应的主要介导物之一，例如已知它在类风湿 性关节炎的发病机理中起重要作用，该病是常见的自身免疫炎症疾�。跋熳旁�0. 5-1% 的人口。另外，还已知TNF参与广泛的疾病状态的发病机理，包括内毒素休克、脑型疟和移 植物抗宿主反应。TNF由许多细胞类型生产，主要由活化的巨噬细胞生产。可溶形式的TNF 由3个相同的17kD蛋白亚基组成，而膜结合形式则由3个相同的26kD亚基组成。TNF以前 还称作〃 TNF-α “和〃恶液质素"。最近发现TWEAK(TNFLSF成员12)是血管生成(血管的形成和生长)的直接的 和强烈的诱导物，因为发现皮摩尔浓度的TWEAK就能促进正常内皮细胞的增殖，且TWEAK 能在体内大鼠角膜模型中诱导血管生成(Lynch等，1999，The Journal of Biological Chemistry, 274 (13) pp. 8455-8459)。更具体地，血管生成对于实体瘤的生长、维持和它们的 转移是必须的，还已知它参与其它的病理学疾病，例如糖尿病性视网膜病、银屑病、接触性 皮炎和再狭窄。US20020037852A1中指出三聚细胞因子BAFF(TNFLS成员13B)由T细胞和树突细 胞表达，以进行B细胞的共刺激，因此它可能在B细胞功能的控制中起重要作用。其中暗示 BAFF和它的受体可能具有抗癌和免疫调节用途、以及治疗免疫抑制病例如HIV的应用。APRIL(TNFLS成员13)是能结合受体TNFRSF13B和TNFRSF17的三聚细胞因子。近 来已经证实，向各种肿瘤细胞添加重组的APRIL会刺激它们的增殖，因而APRIL可能参与调 节肿瘤细胞生长(Hahne M.，等，1998 ;J. Exp. Med. 188 1185-1190)。还已经提出，APRIL 可 能参与单核细胞/巨噬细胞介导的免疫过程。而且，据称TNF超家族内的细胞因子会参与遗传性疾�。绯琁gM综合症、I型 自身免疫淋巴增殖综合症、TNF-Rl-相关的周期热综合症、少汗性外胚层发育不良和家族扩 张性骨质溶解症。已经进行了许多尝试来发现和开发合适的三聚细胞因子的拮抗剂和结合物，其能 结合特定的三聚细胞因子，并由此阻止该三聚细胞因子结合到例如细胞膜结合型受体上， 从而抑制该特定受体途径的激活。一个实例是针对三聚细胞因子TNF(TNFLSF成员2)的拮抗剂。现在，市场上可以 得到2种类型的TNF拮抗剂，即英夫利昔单抗(Remicade)和Eternarc^pt(Enbrel)，美国 和欧洲的市场主管部门都批准了其用于治疗类风湿性关节炎。还已经证实，这2种产品对 于治疗银屑病和克罗恩氏病也是有效的。英夫利昔单抗是一种嵌合抗体，其含有鼠可变区 和人IgGl和κ恒定区，通过结合可溶的和跨膜形式的TNF来中和TNF的生物活性，并抑制 TNF与其受体的结合。英夫利昔单抗的结构类似于自然产生的抗体。Eternac印t是一种融 合蛋白，由P75 TNF受体的胞外域和人IgGl的铰链和Fc域组成。WO 00/42073中给出了三聚细胞因子的拮抗剂的另一个实例，其中公开了针对三 聚细胞因子TWEAK(TNFLS成员12)的单克隆抗体。其中提到，该抗体可以阻止移植物抗宿 主病的发展。但是，使用现在已知的三聚细胞因子的结合物和抑制剂产物会遇到的一个常见的 技术问题是，在形成三聚细胞因子和结合物或抑制剂产物的1 1复合物后，不能有效地封 闭三聚细胞因子的所有3个受体结合位点，因为3个受体结合位点中的至少1个或2个还是开放的。开放的细胞因子受体结合位点可能会与对应的细胞表面细胞因子受体结合，由 于该受体在细胞表面的高局部浓度，由此开始进一步募集细胞因子受体，并介导受体信号 传递。通过TNF结合物Eternac印t可以清楚地解释该问题。Eternacept是二价分子，能 与TNF三聚体形成1 1复合物。当Eternac^pt结合TNF时，Eternac^pt分子仅能占据3 个可能的受体结合位点中的2个，剩下的第3个受体结合位点仍是开放的。这暗示着开放 的TNF受体结合位点可能会与细胞表面TNF受体结合，由于该受体在细胞表面上的高局部 浓度，从而开始进一步募集TNF受体，并介导信号传递。图2解释了该问题。TNF结合物英夫利昔单抗也存在相同的问题。每个英夫利昔单抗分子仅能结合给 定的TNF分子的1个受体结合位点(亚基)，因而剩下2个开放的受体结合位点。这些开放 的受体结合位点可能随后与对应的游离受体结合，导致TNF受体的进一步募集和受体信号 传递。现在，本发明的发明人已经发现，通过提供一种融合蛋白(原聚体)可以克服上面 的技术问题，该融合蛋白被构建成三聚细胞因子的结合单元(结合物)与三聚化结构域的 融合体。本发明的融合蛋白作为三聚蛋白，能与三聚细胞因子形成1 1复合物，优选地同 时有效地结合三聚细胞因子的所有3个受体结合位点，由此没有受体结合位点是开放的， 因此能抑制细胞因子向细胞表面的积聚。本发明由此提供了一种融合蛋白，其具有下述优 点与目前已知的三聚细胞因子拮抗剂相比，能更有效地抑制和中和三聚细胞因子的生物 活性。根据本发明的融合蛋白的另一个优点是，当用作药物时，与目前已知的三聚细胞因子 的结合物相比，使用更少量的融合蛋白即可达到治疗效果。
发明内容
因此，本发明一方面涉及含有3个单体的三聚多肽，每个所述的单体含有能结合 三聚细胞因子的特异性结合构件，且每个所述的单体含有三聚化结构域。另一方面，提供了含有根据本发明的三聚多肽的药物组合物。另一方面，本发明涉及通过给具有三聚细胞因子(例如肿瘤坏死因子)介导的病 理学的对象施用有效量的根据本发明的三聚多肽来治疗该对象的方法。最后，提供了制备根据本发明的三聚多肽的方法、和检测样品中的三聚多肽细胞 因子的实验方法。发明详述一方面，本发明提供了能结合三聚细胞因子的三聚结合物，优选地其结合方式能 够使得在结合后，能基本上封闭和/或中和三聚细胞因子的所有受体结合位点，从而抑制 或中和三聚细胞因子的潜在生物活性。因此，提供了包含3个单体的三聚多肽，其中每个单 体含有能结合三聚细胞因子的特异性结合构件，且其中每个单体都含有三聚化结构域。在本文中，术语"三聚细胞因子"是指小蛋白和其片段，其由细胞生产和分泌，能 在具有针对该细胞因子的受体的细胞中引起特异性反应，例如影响细胞的生长、分裂和/ 或功能。术语"三聚的"在本文中指本发明的细胞因子以含有3个亚基、优选3个相同亚 基(同型三聚体)的多亚基复合物形式存在。这种三聚细胞因子的典型实例包括巨噬细胞移行抑制因子(MIF)和肿瘤坏死因
6子配体超家族(TNFLSF)中的细胞因子。现在，如上所述，TNF配体超家族具有至少17种 公认的配体，它们共享有称作〃 TNF同源域〃(TNF homology domain，THD)的保守的三 聚C-末端域，其负责受体结合。该三聚化结构域的序列相同性在TNF家族成员之间约为 20-30%。THD是长为150个氨基酸的序列，其含有芳族和疏水残基的保守框架，如Bodmer 等 2002，TRENDS in Biochemical Sciences 27 (1)，第 19-26 页的图 2 所示。因此，在本文 中，“肿瘤坏死因子配体超家族的成员"是指含有该TNF同源域THD的三聚蛋白。目前已 知的TNF配体超家族中的三聚细胞因子如下面的表1所示，还列出了别名和相应的Genbank ID (GenBank, National Center for Biotecnology Information ；http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Genbank)。本文所使用的TNF配体超家族的命名法遵循官方TNF超家族(TNFSF) 命名法，可以参见 http://www. gene. ucl. ac. uk/nomenclature/genefamily/tnftop. html。表1 :TNF配体超家族 因此，在本发明的一个有用的实施方案中，根据本发明的三聚多肽能结合选自 下列的肿瘤坏死因子配体超家族成员的三聚细胞因子LTA ；TNF ；LTB ；TNFSF4 ；TNFSF5 ； TNFSF6 ；TNFSF7 ；TNFSF8 ；TNFSF9 ；TNFSF10 ；TNFSF11 ；TNFSF12 ；TNFSF13 ；TNFSF13B ； TNFSF14 ； TNFRSF Fn 14 ； TNFSF15 ；禾口 TNFSF18。如本文所使用的，术语"特异性结合构件"是指彼此具有结合特异性的一对分子 中的成员。特异性结合对中的成员可以是自然产生的，或全部地或部分地合成生产的。分子 对中的一个成员在其表面上有区域或者有腔，能特异性地结合分子对中的另一成员的特定 空间和极性结构，因此与其呈互补性。因而，该对中的成员具有彼此特异性地结合的性质。 特异性结合对类型的实例是抗原-抗体、生物素-链霉抗生物素蛋白、激素-激素受体、配 体-配体受体、酶-底物。特异性结合对的其它实例包括碳水化合物和凝集素，互补的核 苷酸序列(包括在DNA杂交实验中用于检测目标核酸序列的探针和捕获核酸序列)，互补的 肽序列，包括通过重组方法形成的那些，效应物和受体分子，酶辅因子和酶，酶抑制剂和酶 等。而且，特异性结合对可以包括作为原始特异性结合构件的类似物或片段的成员。在有用的实施方案中，能结合三聚细胞因子的特异性结合构件为本发明的三聚多 肽提供了对三聚细胞因子的结合亲合力(Kd)，由表面等离子体共振测得该结合亲合力优 选地为1x10、或更低。在其它有用的实施方案中，Kd值低于1x10_9M，IXIO-iqM, IxlO-11M, 1χ1(Γ12Μ，1Χ1(Γ13Μ，1Χ1(Γ14Μ，或甚至低于lxl(T15M。在其它有用的实施方案中，由表面等离子 体共振测得根据本发明的三聚多肽的K-off速度小于IxlO-3S-1,例如小于lxlO、—1、包括小 于IxlO-5S-1和甚至小于IxlO-6S-1。如本文所使用的，术语〃 K-off"是指特异性结合构件 从特异性结合构件/三聚细胞因子复合物中解离出来的解离速度常数。如本文所使用的， 术语"表面等离子体共振"是指一种光学现象，通过检测生物生物传感器基质内的蛋白浓 度的变化，例如使用 BIAcore 系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala, Sweden)检测，可以 分析实时的生物特异性的相互作用。关于进一步的描述，见实施例10。如上所述，根据本发明的三聚细胞因子结合物优选地能至少部分地或完全地封 闭、抑制或中和三聚细胞因子的生物活性。如本文所使用的，表述“中和”是指抑制或降低 体内或体外测得的三聚细胞因子的生物活性。在有用的实施方案中，特异性结合构件是源自肿瘤坏死因子受体超家族成员的多 肽。现在，已经知晓肿瘤坏死因子超家族中的至少29种受体，列在下面的表2中，同时列 出了它们的别名以及相应的 Genbank ID(GenBank, National Center for Biotecnology 因而，在有用的实施方案中，源自肿瘤坏死因子超家族中的受体的特异性结合构 件选自受体 TNFRSF1A，TNFRSF1B, LTBR, TNFRSF4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFRSF6B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF1 OA, TNFRSF1 OB, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF12, TNFRSF12L, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, NGFR, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF19L, TNFRSF21, TNFRSF22 和 TNFRSF23。但是，预期可以鉴别出该蛋白家 族的其它有用受体，并由此可以鉴别出其它的功能特异性结合构件。在有用的实施方案中，特异性结合元件源自TNF受体TNFRSF1A (TNFrI，p55受体) 和/或TNFRSF1B (TNFrII，p75 TNF受体)。更具体地，已经证实了 TNFRSF1B受体和其亚基 能有效地特异性地结合和中和TNF。作为实例，TNF结合蛋白Eternac^pt是由TNFRSF1B受 体的胞外域(即TNFRSF1B受体的亚基)组成的融合蛋白。因此，在具体的实施方案中，根 据本发明的三聚多肽包括特异性结合元件，其是TNFRSF1B受体(TNFrII)的亚基或片段，例 如US 5，712，155公开的1顺1 18受体片段。因此，在有用的实施方案中，所述特异性结 合元件是含有选自下述的氨基酸序列的多肽TNFRSF1B 1-235 (SEQ ID NO 76), TNFRSF1B 1-185 (SEQID NO 77),TNFRSF1B 1-163(SEQ ID NO 78)和TNFRSFIB 1-142(SEQ IDNO 79).
在其它有用的实施方案中，如下面的实施例所公开的，所述特异性结合元件可以 是TNFRSF1B受体(TNFrII)的一个或多个片段、和这种片段的组合，例如含有选自下述 的DNA序列编码的氨基酸序列的多肽TNFRSF1B D1D2(SEQ ID NO 13), TNFRSF1B D1D2, 1/6 (SEQ ID NO 15), TNFRSF1B D1D21/4(SEQ ID NO 17), TNFrII D1D2,1/3 (SEQ ID NO: 19), TNFRSF1B D1D2,1/2(SEQ ID NO 21), TNFRSF1B D1D4(SEQ ID NO 23)，TNFRSFIB D2 (SEQ ID NO 25),TNFRSF1B D2,1/6 (SEQ ID NO :26)，TNFRSF1B D2,1/4(SEQ ID NO :27)， TNFRSF1B D2,1/3(SEQ ID NO 28),TNFRSF1B D2，1/2(SEQ ID NO :29)和TNFRSF1B D2D4(SEQ ID NO 30)。根据本发明，能结合三聚细胞因子的特异性结合元件还可以是抗体或抗体片段。 在本文中，术语“抗体，，用于描述天然的、或者部分地或全部地合成的免疫球蛋白。由于可 以以多种方式修饰抗体，术语“抗体”应当理解为包括了具有所需三聚细胞因子特异性的结 合域的任何特异性结合元件或物质。因此，该术语涵盖了抗体片段、抗体的衍生物、功能等 同物和同系物，包括含有免疫球蛋白结合域的任何多肽，无论是天然的，还是全部地或部分 地合成的。因此，也包括含有免疫球蛋白结合域与另一多肽相融合的嵌合分子、或等同物。 该术语还包括具有结合域的任何多肽或蛋白，所述结合域是抗体结合域或与其同源，例如 抗体模拟物。它们可以源自天然来源，或者它们是部分地或全部地合成的。抗体的实例是 免疫球蛋白同种型和它们的同种型亚类；含有抗原结合域的片段，例如Fab，scFv, Fv, dAb， Fd ；和二体(diabodies)。US 6，451，983 B2描述了人肿瘤坏死因子的抗体，其能i. a.中和TNF的生物学活 性。更具体地，US 6,451,983 B2提供了能结合某些特定拓扑学区域内的成熟人TNF(SEQ ID NO 80)的抗体或其片段。因此，在本发明的有用的实施方案中，该特异性结合元件是能 在选自由下列氨基酸残基组成的区域内的至少一个区域结合成熟的人TNF(SEQ ID NO 80) 的抗体或其片段氨基酸残基 1-18，1-20，1-26，1-30，12-22，22-31，22-40，36-45,49-97, 49-98,56-79,58-65,69-97,70-87,76-90,96-105,105-128，108-128，110-127，115-125， 117-128，132-157，135-155，136-153，138-149，141-153 或 146-157。US 6，451，983 B2还提供了可以用于本发明的特异性单克隆抗体。因此，能结合人 TNF的特异性结合元件可以是选自下述的抗体或抗体片段MAb 1 (ECACC 89080301)，MAb 21(ECACC 90012432)， MAb 25(ECACC89121401)， MAb 32(ECACC 89080302)， MAb 37(ECACC 89080303)，MAb42 (ECACC 89080304)，MAb 47 (ECACC 89121402)，MAb 53 (ECACC90012433) 和MAb 54 (ECACC 89083103)，其中ECACC是指欧洲动物细胞培养物中心(European Collection of Animal Cell Cultures)。有用的抗体的其它实例包括US 6，090，382中公开的人化抗体D2E7和 W0/00194585中公开的人化抗体片段CDP 870。在具体的实施方案中，本发明的特异性结合元件可以含有抗体类似物或人工抗 体，例如W0/0248189中公开的具有C-型凝集素样结构域(C-type lectin-like domains, CTLD)的支架结构的蛋白。正如将从下面的实施例中明白的，基于能结合TNF的CTLD抗体类 似物的有用人 tetranectin 可以选自 TN3-2-B (SEQ ID NO :103)、TN3_2_C(SEQ IDNO 104) 和 TN3-2-D(SEQ ID NO: 105)。本发明的一个重要的方面是，除了特异性结合元件外，三聚多肽的单体还含有三聚化结构域。在本文中，术语"三聚化结构域"是能与其它类似的或相同的三聚化结构域 相互作用的肽、蛋白或蛋白的部分。这种相互作用是能生成三聚蛋白或多肽的类型。这样 的相互作用可以是由三聚化结构域的组分之间的共价键造成，以及由氢键力、疏水力、范德 华力和盐桥造成。三聚化结构域的一个实例公开在WO 95/31540中，其中公开了含有胶凝素 (collectin)颈区的多肽。构成胶凝素颈区的氨基酸序列可以附着到选择的任何多肽上。 然后可以在合适的条件下，用含有胶凝素颈区氨基酸序列的3个多肽制备三聚体。在目前优选的实施方案中，三聚化结构域源自tetranectin，更具体地包含 tetranectin三聚化结构单元(此后称作TTSE)，其在W098/56906中详细公开。TTSE的氨 基酸序列如SEQ ID NO :81所示。TTSE的三聚化作用由卷曲螺旋结构造成，该结构与2个其 它的TTSE的卷曲螺旋结构相互作用，形成3个α螺旋卷曲螺旋三聚体，其即使在相对较高 的温度下也是特别稳定的。术语TTSE也意在包括天然产生的tetranectin蛋白家族成员的 TTSE的变体、已经对其氨基酸序列进行了修饰而未在任何实质程度上负面影响TTSE形成 α螺旋卷曲螺旋三聚体的能力的变体。因此，根据本发明的三聚多肽可以包含作为三聚化 结构域的TTSE，其含有与SEQ ID NO SEQ ID NO :81的序列具有至少68%、例如至少75%、 包括至少87%、例如至少92%的氨基酸序列相同性的序列。与此相一致，TTSE (SEQ ID NO 81)的半胱氨酸残基No. 50可以有利地诱变成丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或任何其它的氨基 酸残基，以防止形成不希望的链间二硫键，后者会导致不希望的多聚化作用。在另一个实施方案中，可以如下修饰TTSE三聚化结构域(SEQ IDNO 81) (i)插入 多组氨酸序列和/或血液凝固因子Xa的切割位点，( )用Ser替换Cys 50，和(iii)包含 C-末端KGS序列。下面的实施例中提供了根据本发明的不同三聚多肽的几个实例，其中已经应用 了上面的TTSE三聚化结构域。它们包括基于CTLD的TNF结合单元TN-2-B (SEQ ID NO: 106)、TN-2-C(SEQ ID NO 108)和 TN-2-D(SEQID NO 107)、和三聚体化的人 TNFRII 片段 AD1D4-GSS-I10(SEQ ID NO: 109)。根据本发明，所述特异性结合元件可以连接到三聚化结构域的N-或C-末端氨基 酸残基。但是也预见到，在某些实施方案中，可以将特异性结合元件有利地连接到单体的三 聚化结构域N-末端和C-末端，由此提供含有6个能结合三聚细胞因子的特异性结合元件 的三聚多肽。可以明白，有弹性的分子连接物可以任选地置于特异性结合元件和三聚化结构域 之间，并共价地连接它们。在某些实施方案中，连接物是约1-20个氨基酸残基的多肽序列。 连接物可以小于10个氨基酸，最优选地，为5，4，3，2，或1个。在某些情况下，9、8、7或6个 氨基酸是合适的。在有用的实施方案中，连接物基本上是无免疫原性的，不易于蛋白水解切 割，且不含有已知能与其它残基相互作用的氨基酸残基(例如半胱氨酸残基)。通过在能表达三聚多肽的条件下、培养用编码三聚多肽的载体转化的宿主，可以 在任何合适的标准蛋白表达系统中表达本发明的三聚多肽。优选地，表达系统是这样的系 统，其中所需蛋白可以容易地分离和进行体外再折叠。作为一般规律，原核表达系统是优选 的，因为可以得到高产量的蛋白，并且有有效的纯化和再折叠方法可供利用。因而，本领域 的技术人员无需过多实验、凭借自身的能力和判断即可选择合适的或中意的表达系统。类
12似地，一旦选定了本发明的三聚多肽的一级氨基酸序列，结合所选宿主中的密码子偏好、宿 主中的分泌信号序列的必要性、信号序列中的蛋白酶切割位点的导入等因素，本领域的普 通技术人员即可容易地设计合适的能编码目标蛋白的重组DNA构建体。这些重组DNA构建 体可以框架内地插入适用于选定宿主的许多表达载体中的任意一个中。合适的或中意的表 达载体的选择也是在本领域技术人员的能力和判断力之内。优选地，表达载体包含能驱动 重组构建体的表达的强启动子。最后，使用本领域熟知的合适的标准方法，可以分离出三聚 多肽，并任选地进行其它的操作，例如冻干。通过本领域熟知的任何合适的方法，可以用根据本发明的三聚多肽制备药物组合 物。该组合物可以含有与三聚多肽在一起的一种或多种可接受的载体、和任选的其它治疗 成分。该载体必须是在与其它成分相容且对其受体无毒害的意义上为可接受的。通常，制 备药物组合物的方法包括将活性成分和载体相结合的步骤。本发明的治疗应用包括通过给需要治疗的动物施用治疗有效量的根据本发明的 三聚多肽来治疗该动物的疾病或障碍。如上所述，已知三聚细胞因子、特别是TNF配体超家 族的三聚细胞因子，是能充当胞间信号转导分子的多效多肽，其能控制和调节免疫和炎症 反应。因而应当指出，本发明的三聚多肽可以用于治疗三聚细胞因子介导的广范围的障碍 和疾�。ㄑ字⒓膊�、自身免疫病、免疫障碍、感染、恶性瘤和神经变性病。在一个有用的 实施方案中，疾病是肿瘤坏死因子介导的病理学，例如类风湿性关节炎、银屑病和克罗恩氏 病。通过任何合适的技术，包括肠胃外地，可以将本发明的三聚多肽直接施用给动物， 也可以局部地或全身地施用。具体的给药途径依赖于，例如，动物的病史。肠胃外给药的实 例包括皮下、肌肉内、静脉内、动脉内和腹膜内给药。本文中可由三聚融合蛋白潜在地治疗的动物包括哺乳动物，例如人。最后，本发明提供了检测样品中的三聚多肽细胞因子的实验方法，其包括(i)使 样品与根据本发明的三聚多肽接触，和(ii)检测三聚多肽向三聚细胞因子的结合。现在，通过下面的非限制性实施例和附图来进一步描述本发明。
图1显示了肿瘤坏死因子超家族内的三聚细胞因子与相应的细胞结合型单体受 体的结合，其启动2个细胞因子受体的进一步募集，导致六聚细胞因子_受体信号单元的形 成。图2显示了二价结合物与肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)内的三聚细胞因子的结 合，该二价结合物与三聚细胞因子形成1 1复合物。当所述二价结合物结合三聚TNFSF 细胞因子时，二价结合物分子仅仅占据3个可能的受体结合位点中的2个，第3个受体结合 位点仍是开放的。这暗示着，开放的细胞因子受体结合位点可以结合细胞表面三聚细胞因 子受体，并且，由于该受体在细胞表面的高局部浓度，从而开始进一步募集三聚受体，并介 导信号传递。图3显示了三聚细胞因子的结合物，其能与三聚细胞因子形成1 1复合物，并 同时有效地结合三聚细胞因子的所有3个受体结合位点，由此没有受体结合位点仍是开放 的。细胞因子向细胞表面的积聚受到阻断，地就不会发生信号转导。
图4显示了 10倍稀释的三聚体化受体片段DlD4GSSI10Trip在鼠成纤维细胞细胞 系L929实验中在固定的两种不同TNFa浓度(1. Ong/ml和0. lng/ml)下对TNFa介导的 细胞毒性的抑制。实施例实施例1用于生产三聚细胞因子结合物的trip大肠杆菌表达质�：褪删５纳杓坪凸菇ㄊ删Ｊ褂帽曜挤椒ǎü霉押塑账嵋顲-sfikpn-TRI (SEQ ID NO 1)和 N-sfikpn-TRI (SEQ ID NO 2)由表达质粒pTtripb扩增的经Sfi I和Not I限制性消化的 DNA 片段 sktripB 连接到 Amersham PharmaciaBiotech (编号 27-9401-01)提供的经 Sfi I 和Not I预切割的载体pCANTAB 5E中，构建了噬菌粒psktripB。sktripB插入片段的核苷 酸序列如SEQ ID NO :3所示。使用标准方法，通过将用寡核苷酸引物C-sfikpn-TRI (SEQ ID NO 1)和 N-sfikpn-IlOTRI (SEQ ID NO :4)从表达质粒pTtripb扩增的、经SfΠ和Not I限制性消 化的 DNA 片段 skiIOtripB 连接到 Amersham PharmaciaBiotech (编号 27-9401-01)提供的 经Sfi I和Not I预切割的载体pCANTAB 5E中，构建了噬菌粒pskllOtripB。skllOtripB 插入片段的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。表汰质粒 使用标准方法，通过将用寡核苷酸引物C-bamkpn-TRI (SEQ ID NO 6)和 N-bamkpn-TRI (SEQ ID NO 7)从表达质粒pTtripb扩增的、经BamH I和Hind I性消化限 制的DNA片段bktripB连接到经BamH I和Hind I限制性消化的表达质粒pT7H6中，构建 了表达质粒pT7H6-bktripB。bktripB的核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示。使用标准方法，通过将用寡核苷酸引物C-bamkpn-TRI (SEQ ID NO 6)和 N-bamkpn-110TRI (SEQ ID NO 9)从表达质粒 pTtripb 扩增的、经 BamH I 和 Hind I 限制性 消化的DNA片段bkl IOtripB连接到经BamH I和Hind I限制性消化的表达质粒pT7H6中， 构建了表达质粒pT7H6-bkI10tripB。bkltripB的核苷酸序列如SEQ ID N0:10所示。实施例2使用TNFRII片段的三聚TNF结合物的设计和构建TNF受体TNFRSF1B (TNFRII)的片段和亚基用于构建基于源自tetranectin的三聚 化结构域TripB的三聚TNF结合物。如下进行设计和克隆将TNFRSF1B片段克隆进噬菌粒载体使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物Dl-rev (SEQ ID NO 11) 和 D2kpn-fo (SEQ ID NO 12))、Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 D1D2 连接到 Sfi I 和Kpn I切割载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pDlD2tripB。得到的D1D2的核苷酸序 列如SEQ ID NO 13所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: ll)Dl/6kpn-fo(SEQ IDNO 14))、经 Sfi I 和 Kpn I 切割的 DNA 片段 D1D1/6 连接到经 Sfi
14I和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pDlD2，l/6tripB。得到的D1D2，1/6 的核苷酸序列如SEQ ID NO 15所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和 Dl/4kpn-fo(SEQ IDNO 16))、经 Sfi I 和 Kpn I 限制性切割的 DNA 片段 D1D1/4 连接 到经Sfi I和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pDlD2，l/4tripB。得到的 D1D2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO 17所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和 Dl/3kpn-fo(SEQ IDNO 18))、经 Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 D1D1/3 连接 到经Sfi I和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pDlD2，l/3tripB。得到的 D1D2，1/3的核苷酸序列如SEQ ID NO 19所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和 Dl/2kpn-fo(SEQ IDNO 20))、经 Sfi I 和 Kpn I 限制性切割的 DNA 片段 D1D1/2 连接 到经Sfi I和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pDlD2，l/2tripB。得到的 D1D2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO 21所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和D4kpn-fo (SEQ ID NO 22))、经Sfi I和Kpn I限制性切割的DNA片段D1D4连接到 经Sfi I和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pDlD4tripB。得到的D1D4 的核苷酸序列如SEQ ID NO 23所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和D2kpn-fo (SEQ ID NO 12))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1D2连接到 经Sfi I和Kpn I切割的载体pskllOtripB中，构建了噬菌粒载体pDlD2I10tripB。得到的 D1D2的核苷酸序列如SEQ ID NO 13所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和 Dl/6kpn-fo(SEQ IDNO 14))、经 Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 D1D1/6 连接 到经Sfi I和Kpn I切割的载体pskllOtripB中，构建了噬菌粒载体pDlD2，l/6I10tripB。 得到的D1D2，1/6的核苷酸序列如SEQ ID NO 15所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和 Dl/4kpn-fo(SEQ IDNO 16))、经 Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 D1D1/4 连接 到经Sfi I和Kpn I切割的载体pskllOtripB中，构建了噬菌粒载体pDlD2，l/4I10tripB。 得到的D1D2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO 17所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物Dl-rev (SEQ ID N0:11)和 Dl/3kpn-fo(SEQ IDNO 18))、经 Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 D1D1/3 连接 到经Sfi I和Kpn I切割的载体pskllOtripB中，构建了噬菌粒载体pDlD2，l/3I10tripB。 得到的D1D2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO 19所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories, Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和 Dl/2kpn-fo(SEQ IDNO 20))、经 Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 D1D1/2 连接 到经Sfi I和Kpn I切割的载体pskllOtripB中，构建了噬菌粒载体pDlD2，l/2I10tripB。 得到的D1D2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO 21所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物Dl_rev (SEQ ID NO: 11)和D4kpn-fo (SEQ ID NO 22))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1D4连接到 经Sfi I和Kpn I切割的载体pskllOtripB中，构建了噬菌粒载体pDlD4I10tripB。得到的 D1D4的核苷酸序列如SEQ ID NO 23所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和D2kpn-fo (SEQ IDNO 12))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D2连接到经 Sfi I和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD2tripB。得到的D2的核苷 酸序列如SEQ ID NO 25所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和Dl/6kpn-fo (SEQ IDNO 14))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/6连接到 经SfiI和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD2，l/6tripB。得到的D2， 1/6的核苷酸序列如SEQ ID NO 26所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和Dl/4kpn-fo (SEQ IDNO 16))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/4连接到 经SfiI和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD2，l/4tripB。得到的D2， 1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO 27所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和Dl/3kpn-fo (SEQ IDNO 18))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/3连接到 经SfiI和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD2，l/3tripB。得到的D2， 1/3的核苷酸序列如SEQ ID NO 28所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和 Dl/2kpn-fo (SEQ IDNO 20))、经 Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 D1/2 连接 到经SfiI和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD21/2tripB。得到的D2， 1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO 29所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和D4kpn-fo (SEQ ID NO 22))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D2D4连接到 经Sfi I和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD2D4tripB。得到的D2D4 的核苷酸序列如SEQ ID NO 30所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和D2kpn-fo (SEQ IDNO 12))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D2连接到经 Sfi I和Kpn I切割的载体pskllOtripB中，构建了噬菌粒载体pD2I10tripB。得到的D2 的核苷酸序列如SEQ ID NO 25所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和Dl/6kpn-fo (SEQ IDNO 14))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/6连接到 经SfiI和Kpn I切割的载体pskllOtripB中，构建了噬菌粒载体pD2，l/6I10tripB。得到 的D2，1/6的核苷酸序列如SEQ ID NO 26所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和Dl/4kpn-fo (SEQ IDNO 16))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/4连接到 经SfiI和Kpn I切割的载体pskllOtripB中，构建了噬菌粒载体pD2，l/4I10tripB。得到 的D2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO 27所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和Dl/3kpn-fo (SEQ IDNO 18))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/3连接到 经SfiI和Kpn I切割的载体pskllOtripB中，构建了噬菌粒载体pD2，l/3I10tripB。得到 的D2，1/3的核苷酸序列如SEQ ID NO 28所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和Dl/2kpn-fo (SEQ IDNO 20))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/2连接到 经SfiI和Kpn I切割的载体pskllOtripB中，构建了噬菌粒载体pD2，l/2I10tripB。得到 的D2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO 29所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2_rev (SEQ ID NO: 24)和D4kpn-fo (SEQ ID NO 22))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D2D4连接到 经Sfi I和Kpn I切割的载体pskllOtripB中，构建了噬菌粒载体pD2D4IIOtripB。得到的 D2D4的核苷酸序列如SEQ ID NO 30所示。将TNFRSF1B(TNFRII)受体片段克隆至表达载体中使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO 31)和 D2kpn-fo (SEQ IDNO 12))、经 BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1D2 连 接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6_bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXDlD2tripB。得到的FXD1D2的核苷酸序列如SEQ ID NO 32所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO :31)和Dl/6kpn-fo(SEQID NO :14))、经BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/6 连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6_bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXDlD2， l/6tripB。得到的FXD1D2，1/6的核苷酸序列如SEQ IDNO 33所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO :31)和Dl/4kpn-fo(SEQID NO :16))、经BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/4 连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6_bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXDlD2， l/4tripB。得到的FXD1D2，1/4的核苷酸序列如SEQ IDNO 34所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev (SEQ ID NO :31)和Dl/3kpn-fo(SEQID NO :18))、经BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/3 连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6_bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXDlD2， l/3tripB。得到的FXD1D2，1/3的核苷酸序列如SEQ IDNO 35所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev (SEQ ID NO :31)和Dl/2kpn-fo(SEQID NO :20)) ^BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/2 连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6_bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXDlD2， l/2tripB。得到的FXD1D2，1/2的核苷酸序列如SEQ IDNO 36所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录 号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO 31)和 D4kpn-fo (SEQ IDNO :22))、经 Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1D4连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6_bkI10tripB中，构建了表达载体 pT7H6FXDlD4tripB。得到的FXD1D4的核苷酸序列如SEQ ID NO :37所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO 38)和 D2kpn-fo (SEQ IDNO 12))、经 BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD2 连接 到经BamHI和Kpn I切割的载体PT7H6_bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2tripB。得 到的FXD2的核苷酸序列如SEQ ID NO 39所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO :38)bamD2-rev(SEQ IDNO :38)和 Dl/6kpn_fo (SEQ ID NO 14)) J^BamH I 和 Kpn I 限制 性消化的DNA片段FXD1/6连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6_bktripB中，构建 了表达载体PT7H6FXD2，l/6tripB。得到的FXD2，1/6的核苷酸序列如SEQ ID NO 40所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO :38)和Dl/4kpn-fo(SEQID NO :16))、经BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/4
18连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6_bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2， l/4tripB。得到的FXD2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO 41所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO :38)和Dl/3kpn-fo(SEQID NO :18))、经BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/3 连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6_bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2， l/3tripB。得到的FXD2，1/3的核苷酸序列如SEQ ID NO 42所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO 38)和 Dl/2kpn-fo (SEQID NO 20))、经 BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1/2 连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6_bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2， l/2tripB。得到的FXD2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO 43所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO 38)和 D4kpn-fo (SEQ IDNO 22))、经 Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA片段FXD2D4连接 到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6_bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2D4tripB。 得到的FXD2D4的核苷酸序列如SEQ ID NO 44所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录 号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO 31)和 D2kpn-fo (SEQ IDNO 12))、经 BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1D2连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6_bkI10tripB中，构建了表达载体 PT7H6FXD1D2IIOtripB0 得到的 FXD1D2 的核苷酸序列如 SEQ ID NO :32 所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO :31)和Dl/6kpn-fo(SEQID NO :14))，经BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/6 连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6_bkI IOtripB中，构建了表达载体pT7H6FXDlD2， l/6I10tripB。得到的FXD1D2，1/6的核苷酸序列如SEQID NO 33所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录 号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO 31)和 Dl/4kpn-fo(SEQID NO 16))、经 BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1D1/4连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6_bkIIOtripB中，构建了表达载体 PT7H6FXD1D2. l/4I10tripB。得到的 FXD1D2，1/4 的核苷酸序列如 SEQID NO 34 所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO :31)和Dl/3kpn-fo(SEQID NO :18))、经BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/3 连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6_bkI IOtripB中，构建了表达载体pT7H6FXDlD2， l/3I10tripB。得到的FXD1D2，1/3的核苷酸序列如SEQID NO 35所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ IDNO :31)和Dl/2kpn-fo(SEQID NO :20)) ^BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/2 连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6_bkI IOtripB中，构建了表达载体pT7H6FXDlD2， l/2I10tripB。得到的FXD1D2，1/2的核苷酸序列如SEQID NO :36所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录 号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamDl-rev(SEQ ID NO 31)和 D4kpn-fo (SEQ IDNO 22))、经 Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1D4连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6_bkI10tripB中，构建了表达载体 PT7H6FXD1D4IIOtripB0 得到的 FXD1D4 的核苷酸序列如 SEQ ID NO 37 所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO 38)和D2kpn-fo(SEQ IDNO :12))、经BamH I和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD2连接到 经BamHI 和 Kpn I 切割的载体PT7H6_bkI10tripB 中，构建了表达载体pT7H6FXD2I10tripB。 得到的FXD2的核苷酸序列如SEQ ID NO 39所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO 38)和 Dl/6kpn-fo (SEQID NO 14))、经 BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1/6 连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6_bkI IOtripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2， l/6I10tripB。得到的FXD2，1/6的核苷酸序列如SEQ ID NO 40所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO :38)和Dl/4kpn-fo(SEQID NO :16))、经BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/4 连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6_bkI IOtripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2， l/4I10tripB。得到的FXD2，1/4的核苷酸序列如SEQ IDNO 41所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV (SEQ ID NO :38)和Dl/3kpn-fo(SEQID NO :18))、经BamH I 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FXD1D1/3 连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6_bkI IOtripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2， l/3I10tripB。得到的FXD2，1/3的核苷酸序列如SEQ IDNO :42所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO 38)和 Dl/2kpn-fo (SEQID NO 20))、经 BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD1/2 连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6_bkI IOtripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2， l/2I10tripB。得到的FXD2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO 43所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录 号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-reV(SEQ ID NO 38)和 D4kpn-fo (SEQ IDNO :22))、经 Sfi I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 FXD2D4连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6_bkI10tripB中，构建了表达载体 pT7H6FXD2D4I10tripB。得到的 FXD2D4 的核苷酸序列如 SEQ ID NO :44 所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5 (SEQ ID NO 82)和 pKpnI-1162 (SEQID NO 83))、经 BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片 段AD1D4-I162连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7_bktripB中，构建了表达载体 pT7ADlD4-I162-tripB。得到的 ADlD4_I162_tripB 的核苷酸序列如 SEQ IDNO 84 所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录 号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5 (SEQ ID NO 82)禾口 pKpnI-GSS(SEQ IDNO :85))、经 BamH I 禾口 Kpn I 限制性消化的 DNA 片 段AD1D4-GSS连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7_bktripB中，构建了表达载体 pT7ADlD4-GSS-tripB。得到的 ADlD4_GSS_tripB 的核苷酸序列如 SEQ IDNO 86 所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录 号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5 (SEQ ID NO 82)和 pKpnI-D235 (SEQID NO 87))、经 BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片 段AD1D4-D235连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7_bktripB中，构建了表达载体 pT7ADlD4-D235-tripB。得到的 ADlD4_D235_tripB 的核苷酸序列如 SEQ IDNO 88 所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录 号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5 (SEQ ID NO 82)和 pKpnI-I162(SEQID NO :83))、经 BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 AD1D4-I162连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7_bkIIOtripB中，构建了表达载体 PT7AD1D4-1162-110-tripB。得到的 ADlD4_I162-I10_tripB 的核苷酸序列如 SEQ ID N0: 89所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录 号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5 (SEQ ID NO 83)和 pKpnI-GSS(SEQ IDNO 85))、经 BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 AD1D4-GSS连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7_bkI10tripB中，构建了表达载体 PT7AD1D4-GSS-110-tripB。得到的 ADlD4-GSS-I10_tripB 的核苷酸序列如 SEQ ID NO 90 所示。使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录 号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5 (SEQ ID NO 83)和 pKpnI-D235 (SEQID NO :87))、经 BamH I 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 AD1D4-D235连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7_bkIIOtripB中，构建了表达载体 PT7AD1D4-D235-110-tripB。得到的 ADlD4-D235-I10_tripB 的核苷酸序列如 SEQ ID N0: 91所示。使用标准方法，通过将从cDNA(用寡核苷酸引物pKpnI-V17(SEQ IDNO :92)和 pBAD6H(SEQ ID NO 93))扩增的、经 Kpn I 和 Hind III 限制性消化的 DNA 片段 V17_TripB 连接到经Kpn I和Hind III切割的载体pT7ADlD4-GSS_tripB中，构建了表达载体 pT7ADlD4-GSS-V17-tripB。得到的 ADlD4-GSS_V17_tripB 的核苷酸序列如 SEQ ID NO 94所示。使用标准方法，通过将从cDNA(用寡核苷酸引物pKpnI-V17(SEQ IDNO :92)和 pBAD6H(SEQ ID NO 93))扩增的经 Kpn I 和 Hind III 限制性消化的 DNA 片段 V17_TripB
21连接到经Kpn I和Hind III切割的载体pT7ADlD4-D235_tripB中，构建了表达载体 pT7ADlD4-D235-V17-tripB。得到的 ADlD4-D235_V17_tripB 的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 95所示。实施例3三聚体化的TNFRII片段AD1D4_GSS_IIO-TripB的生产、再折叠和纯化T7RNA聚合酶依赖性的表达质粒pT7DlD4GSSI 10 (能表达TNFRII衍生物 AD1D4-GSS-IIO-TripB)的构建如上面的实施例2所述。如Studier 和 Moffat，J. Mol. Biol.，189 :113_130，1986 所述，以中等规模(6x1 升)培养和表达大肠杆菌BL21细胞中的质粒PT7AD1D4-GSS-I10，生产了三聚体化的人 TNFRII 片段 AD1D4-GSS-110 (SEQ ID NO 109) 简言之，在 37°C 的指数生长培养物(0D600 值为0.8)以感染复数约为5用噬菌体λ-CE6感染。在离心收集细胞之前，培养物在37°C 再生长3小时。通过渗透压休克和超声处理裂解细胞，将总细胞蛋白萃取到苯酚(用 Trisma碱调节到pH8)中。通过加入2. 5倍体积的乙醇和离心，从苯酚相中沉淀出蛋白。 将蛋白沉淀溶解到含有6M氯化胍、50mM Tris-HCl pH8和50mM dithioerythriol的缓冲 液中。在 S印hadex G-25 (Amersham Biosciences)上用 8M 脲、0· 5M NaCl、50mM Tris-HCl PH8和5mM 2-巯基乙醇进行凝胶过滤后，将粗蛋白制品应用到M2+活化的NTA-琼脂糖 (Qiagen,Germany)柱上进行融合蛋白的纯化(Hochuli等，1988)，在固定化到柱上时，如WO 94/18227所述进行循环折叠过程。在加入还原剂和/或使用之前，将为液相色谱制备的所有缓冲液在真空下脱气。在将粗蛋白提取物上样到Ni2+NTA-琼脂糖柱上后，通过用1柱体积的上样缓冲液、 随后用6M氯化胍(Guanidinium chloride)、50mMTris_HCl和5mM 2-巯基乙醇洗涤，直到 柱洗出液在280nm的光密度(OD)是稳定的，从大肠杆菌和λ噬菌体蛋白主要部分中纯化 出了融合蛋白AD1D4-GSS-I10。使用如表1所述的梯度方式，用0. 5Μ NaCl、50mM Tris-HCl pH8和2mM/0. 2mM还 原型/氧化型谷胱甘肽作为缓冲液A，用8M脲、0. 5MNaCl、50mM Tris-HCl pH8和3mM还原 型谷胱甘肽作为缓冲液B，在M2+NTA-琼脂糖柱上重折叠融合蛋白。循环折叠过程完成后，使用含有8M脲、0. 5M NaCl、50mM Tris-HCl和IOmM EDTA PH8的缓冲液，从Ni2+NTA-琼脂糖柱上洗脱下AD1D4-GSS-I10融合蛋白。通过在S-禾口 Q-S印harose (Amersham Biosciences)上的离子交换色谱,从二聚体 和更高级的多聚体纯化出单体的AD1D4-GSS-I10融合蛋白将洗脱缓冲液洗脱的融合蛋白 (约80%的融合蛋白物)在S印hadex G-25上凝胶过滤到含有8M脲、IOmM Tris-HCl pH8. 0 和25mM NaCl的缓冲液中，并应用到S-S印harose离子交换柱上。将“穿过的”级分中的不 结合蛋白直接上样到Q-S印harose柱上。用从8M脲、25mM NaClUOmM Tris-Hcl pH8至8M 脲、300mM NaClUOmM Tris-Hcl pH8的线性梯度，经10个柱体积，从Q-S印harose柱洗脱出 单体的AD1D4-GSS-110融合蛋白。单体的AD1D4-GSS-110融合蛋白在梯度的最开始处洗脱， 而二聚体和更高级的多聚体较后洗脱。通过凝胶过滤到含有IOmM HEPES pH7. 4和125mM NaCl的缓冲液中，将含有单体融合蛋白的级分复性和三聚体化。表3 缓冲液梯度控制方案
22 实施例4三聚体化的TNFRII片段AD1D4-GSS-I10的生物活性在L929细胞实验中检测TNF α介导的细胞毒性的抑制，检测三聚体化的TNFRII 片段AD1D4-GSS-I10 (如实施例3所述生产的)的生物活性。使用鼠成纤维细胞细胞系L929(ECACC no. :85011425)来检测TNF α介导的细胞 毒性。将细胞维持在添加了 10% FBS和抗生素(100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素)的 RPMI 1640液体培养基(Biowhittaker，UK)中。将细胞以3xl05细胞/ml涂布到含有75 μ 1/ 孔的RPMI 1640完全培养基的96-孔平底微滴定平板(NUNC，Roskilde，Denmark)中，并在 37°C、在5% CO2中培养过夜。在补充了 2 μ g/ml放线菌素D (Sigma)的完全RPMI 1640培养 基中，将重组人 TNFa (rhTNF a ,RD Systems, UK) (lng/ml 和 0. lng/ml)与各种浓度(10-倍 稀释液)的三聚体化受体片段(AD1D4-GSS-I10)在37°C、在5% CO2中孵育1小时。此后， 将75 μ 1/孔的TNF- a /三聚体化受体片段混合物添加到细胞培养物中，在37°C、在5% CO2 中孵育过夜。一式三份地测试了每种浓度的TNF-a/受体片段混合物。使用MTT(3_[4， 5-二甲基-噻唑-2-基]-2，5-二-苯基-四唑鐺溴化物)作为CellTiter 96非放射性 细胞增殖测试试剂盒(Promega)的一部分，检测了细胞增殖。为了制备足以用于一个96孔 平板(含有在150 μ 1体积中培养的细胞)的试剂，将3. Oml MTS溶液加入到150 μ 1 PMS 中。加入30 μ 1/孔的组合的MTS/PMS溶液，在使用ELISA平板读数器在492nm记录吸光度 之前，将平板在37°C、在5% CO2中孵育1-4小时。在每个实验中，还包括TNF α和细胞的 对照组、单独的细胞和缓冲液对照组。实验结果总结在图4中。在存在最高浓度的々0104-655-110的情况下1顺(1的细 胞毒性作用受到显著抑制，因而证实了该化合物的生物学活性。实施例5使用D2E7抗体片段设计、构建和生产三聚TNF结合物选择了人化抗体D2E7的单链抗体可变区片段(scFv)作为结合物用于构建能结合 TNF的三聚多肽基于US 6，090，382公开的序列，通过扩增D2E7的VH和VL域，可以构建三
聚结合物。
含有位于N-末端scFv和C-末端三聚化结构域之间的Gly, Thr接头的三聚D2E7 scFv的设计和构津以2个步骤构建表达载体pT7H6FXD2E7tripB。第一步是构建pT7H6FX(D2E7VH) tripB。通过将从含有D2E7序列的DNA扩增的(用寡核苷酸引物FXVH(SEQ ID NO 45) 和 VHBamKpn (SEQ ID NO 46))、经 Bgl II 和 KpnI 限制性消化的 DNA 片段 FX(D7E2VH)连 接到经BamH I Kpn I切割的pT7H6bktripB载体中，构建出该载体。第二步是，通过将从 含有D2E7序列的DNA扩增的(用寡核苷酸引物G4SVL(SEQ ID NO 47)和VLkpn(SEQID NO :48))、经BamH I Kpn I限制性消化的DNA片段G4SVL连接到经BamH I Kpn I切割的 PT7H6FX (D2E7VH) tripB载体中，构建出pT7H6FXD2E7tripB。得到的FXD2E7的核苷酸序列 如 SEQ ID NO 49 所示。含有位于N-末端scFv和C-末端三聚化结构域之间的Gly, Gly, Gly, Gly, Ser, GlV，Thrftl^H^D2E7 scFv 的设计和构律以2个步骤构建表达载体pT7H6FXD2E7G4StripB。第一步是，通过将从含有D2E7 序列的DNA扩增的((用寡核苷酸引物FXVH(SEQ ID NO 45)和VHBamKpn(SEQ ID N0:46))、 经Bgl II和Kpn I限制性消化的DNA片段FX(D7E2VH)连接到经BamH I Kpn I切割的 pT7H6bktripB载体中，构建出pT7H6FX (D2E7VH) tripB。第二步是，通过将从含有D2E7序列 的 DNA 扩增的(用寡核苷酸引物 G4SVL(SEQ ID NO :47)和 VLG4Skpn(SEQ IDNO :50))、经 BamH I Kpn I限制性消化的DNA片段G4SVL连接到经BamHI Kpn I切割的pT7H6FX(D2E7VH) tripB载体中，构建出pT7H6FXD2E7tripB。得到的FXD2E7G4S的核苷酸序列如SEQ ID NO: 51所示。含有位于N-末端三聚化结构域和C-末端scFv之间的Gly，Ser接头的三聚D2E7 scFv的设计和构建使用标准方法，通过将从pT7H6FXD2E7G4StripB扩增的(用寡核苷酸引物 bclVH(SEQ ID NO 52)和VLhind(SEQ ID:53))、经Bcl I和HindIII 限制性消化的DNA片段 连接到经 BamH I 和 Hind III 切割的载体 pT76HFXtripa(Lorentsen，RH.等，Biochem J.； 347 =83-87,2000)中，构建出表达载体pT76HFXTripAGSD2E7。得到的GSD2E7的核苷酸序列 如 SEQ ID NO 54 所示。含有位于N-末端三聚化结构域和C-末端scFv之间的Gly，Ser, Gly, Gly, Gly, Gly, Ser接头的三聚D2E7 scFv的设计和构建使用标准方法，通过将从pT7H6FXD2E7G4StripB扩增的(用寡核苷酸引物 bclG4SVH(SEQ ID NO 55)和 VLhind(SEQ ID:53))、经Bcl I 禾口Hind III 限制性消化的DNA 片段连接到经 BamH I 禾口 Hind III 切割的载体 pT76HFXtripa(Lorentsen，RH.等，Biochem J. ；347 =83-87,2000)中，构建出表达载体 pT76HFXTripAG4SD2E7。得到的 G4SD2E7 的核苷 酸序列如SEQ ID NO 56所示。为了制备上面的融合蛋白 H6FXD2E7tripB， H6FXD2E7G4StripB, H6FXTripAD2D7TripA 禾口 H6FxTripAG4SD2E7，如 Studier 等(1990)所述，使 质粒 pT7H6FXD2E7tripB, pT7H6FXD2E7G4StripB, pT7H6FXTripAD2D7TripA 禾P pT7H6FxTripAG4SD2E7在大肠杆菌BL21细胞中小规模地生长(1升；2xTY培养基，5mM MgSO4 和100 4g氨苄青霉素)。在37°C指数生长的培养物(0D600值为0.8)以感染复数约为5用噬菌体XCE6进行感染。使培养物在37°C再生长3小时，通过离心收集细胞。将细胞 重新悬浮在50ml 0. 5M NaCl、50mM Tris-HCl pH8和ImM EDTApH8中。向每份中加入苯酚 (50ml，调节至pH8)，超声处理混合物，以提取总蛋白。进行离心澄清(25分钟，10. OOOg)后， 通过加入2. 5体积的乙醇和离心，使粗蛋白级分从苯酚相中沉淀出来。将蛋白沉淀溶解到 含有 6M 氯化胍、50mM Tris-HCl pH8 和 0. IM dithioerythriol 的缓冲液(15_25ml)中。在 Sephadex G-25 (Pharmacia, Sweden)上凝胶过滤到 8M 脲、IM NaCl、50mM Tris-HCl pH8 禾口 IOmM 2-巯基乙醇中后，将粗蛋白制品应用到Ni活化的NTA-琼脂糖柱(75ml柱体积)上 进行纯化(Hochuli等，1988)。然后使洗涤缓冲液(6M胍-HCl，50mMTris-HCl pH8和IOmM 2-巯基乙醇)流经柱，直到得到稳定的基线值。然后对每个柱应用pH梯度(1000ml，8M脲和IOmM 2-巯基乙醇中的梯度，通过线 性(每体积)混合含有50mM磷酸二氢钠(pH5缓冲液)和50mM磷酸氢二钠(pH8缓冲液) 的溶液得到)，洗脱基本纯的融合蛋白。为了通过Thegersen等(WO 94/18227)的方法进行体外重折叠，将20mg每种
纯化的融合蛋白在重折叠"缓冲液B"(如下所述)中与足以产生约75ml填充床体积柱 的M2+活化NTA-琼脂糖基质悬浮液的等份试样混合成悬浮液。然后对每种融合蛋白如 WO 94/18227中关于纤溶酶原kringle 4所述进行反复的重折叠过程，但是使用含有0. 5M NaCl、50mMTris-HCl pH8，2mM谷胱甘肽和0. 2mM氧化型谷胱甘肽的缓冲液作为“缓冲液 A"，使用含有8M脲、IM NaCl,50mM Tris-HCl pH8和2mM谷胱甘肽的缓冲液作为〃缓冲液 B"，在10°C进行含有融合蛋白的scFv的重折叠。完成重折叠过程后，用300ml含有0. 5M NaCl和50mM Tris-HClpH 8的缓冲液洗 涤每个柱，以洗去谷胱甘肽。然后用20mM EDTA，0. 5MNaCl和50mM Tris-HCL pH8将每种蛋 白的重折叠部分从NTA-琼脂糖中洗脱到洗脱缓冲液中。向每种蛋白样品中加入固态脲达 到约8M的终浓度、并通过稀释或透析将NaCl浓度降低到5mM以下以后，再通过离子交换色 谱(S-S 印 harose，Pharmacia，1，6 (i. d.)，经 90 厘米柱，在含有 8M 脲、5mM Tris-HCl (来自 IM贮液、pH8)和25mM醋酸钠(来自IM贮液、pH5)的缓冲液中，以2ml/min洗脱，对每种正 确折叠的融合蛋白产物进行最终的纯化。在水性缓冲液(例如磷酸盐缓冲的盐水)中透析 后，回收每种纯的和正确地重折叠的融合蛋白，其产率为2-6mg/升生长培养物。实施例6使用TNFRSF13B受体片段设计和构建三聚的APRIL结合物使用APRIL受体TNFRSF13B，并基于源自tetranectin的三聚化结构域TripB，构 建针对三聚细胞因子APRIL的三聚结合物。具有不同接头的这样的结合物的设计和克隆如 下所述TNFRSF13B6 的克隆以2个步骤构建表达载体pT7H6FXTNFRS13B6tripB。第一步是，使用标准方法， 通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories, Inc目录号7181-1和7182-1) 的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bgl i iFX Δ TNFRSF13Β (SEQ ID NO 57)禾Π Δ TNFRSF 13Bkpn (SEQ IDNO :58))、经 Bgl II 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片 段FX Δ TNFRSF13B连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6_bktripB中，构建 PT7H6FXATNFSF13B。第二步是，使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech
29Laboratories, Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸 引物 kpnATNFSF13B(SEQ ID NO 59)禾口 Δ TNFSF13B6kpn(SEQ ID N0:60))、经 Kpn I 限制 性消化的DNA片段Δ TNFRSF13Β6连接到经Kpn I切割的pT7H6FX Δ TNFSF13Β载体中，构建 出最终的表达载体pT7H6FXTNFRSF13B6tripB。得到的FXTNFRSF13B6的核苷酸序列如SEQ ID NO 61 所示。TNFRSF13B10 的克降以2个步骤构建表达载体pT7H6FXTNFRS13B10tripB。第一步是，使用标准方法， 通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories, Inc目录号7181-1和7182-1) 的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bgl i iFX Δ TNFRSF13Β (SEQ ID NO 57)和 Δ TNFRSF 13Bkpn (SEQ ID NO :58))、经 Bgl II 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片 段FX Δ TNFRSF13Β连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6_bktripB中，构建出 PT7H6FXATNFRSF13B。第二步是，使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories, Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷 酸引物 kpn Δ TNFSFl3B(SEQ ID NO 59)和 Δ TNFSF13ΒIOkpn(SEQ ID NO :62)) J^Kpn I 限 制性消化的DNA片段Δ TNFSF13Β10连接到经Kpn I切割的pT7H6FX Δ TNFRSF13Β载体中， 构建出最终的表达载体pT7H6FXTNFRSF13B10tripB。得到的FXTNFRSF13B10的核苷酸序列 如 SEQ ID NO 63 所示。TNFRSF13B20 的克降以2个步骤构建表达载体pT7H6FXTNFRS13B20tripB。第一步是，使用标准方法， 通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories, Inc目录号7181-1和7182-1)的 混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bgliiFXATNFRSF13B(SEQ ID NO 57)和 Δ TNFRSF 13Bkpn (SEQ ID NO :58)) J^Bgl II 和Kpn I 限制性消化的DNA片段FX Δ TNFSF13B 连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6_bktripB中，构建出pT7H6FX Δ TNFRSF13B。第 二步是，使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories, Inc目录号 7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物kpn Δ TNFRSF13Β (SEQ ID NO 59)禾口 Δ TNFRSF 13B20kpn (SEQ ID NO 64))、经 Kpn I 限制性消化的 DNA 片段 ATNFSF13B20连接到经Kpn I切割的pT7H6FX Δ TNFRSF13B载体中，构建出最终的表达载体 pT7H6FXTNFRSF13B20tripB。得到的 FXTNFRSF13B20 的核苷酸序列如 SEQ ID NO :65 所示。TNFRSF13B30 的克隆以2个步骤构建表达载体pT7H6FXTNFRS13B30tripB。第一步是，使用标准方法， 通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories, Inc目录号7181-1和7182-1) 的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bgliiFXATNFRSF13B(SEQ ID NO: 57)和 ΔTNFRSF 13Bkpn(SEQ ID NO :58))、经 Bgl II 和 Kpn I 限制性消化的 DNA 片 段FX Δ TNFRSF13Β连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6_bktripB中，构建出 PT7H6FXATNFRSF13B。第二步是，使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories, Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷 酸引物 kpnATNFRSF13B(SEQ ID NO 59)和 Δ TNFRSF13B30kpn(SEQ ID N0:66))、经 Kpn I 限制性消化的DNA片段Δ TNFRSF13Β30连接到经Kpn I切割的pT7H6FX Δ TNFRSF13Β载体 中，构建出最终的表达载体pT7H6FXTNFRSF13B30tripB。得到的FXTNFRSF13B30的核苷酸序
30列如SEQ ID NO 67所示。TNFRSF13B61 的克降以2个步骤构建表达载体pT7H6FXTNFRS13B61tripB。第一步是，使用标准方法， 通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories, Inc目录号7181-1和7182-1) 的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bgliiFXATNFRSF13B(SEQ ID NO: 57)禾口 Δ TNFRSF 13Bkpn (SEQ ID NO :58))、经 Bgl II 禾口 Kpn I 限制性消化的 DNA 片 段FX Δ TNFRSF13Β连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6_bktripB中，构建出 PT7H6FXATNFRSF13B。第二步是，使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories, Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷 酸引物 kpnATNFRSF13B(SEQ ID NO 59)和 Δ TNFRSF13B6Ikpn(SEQ ID Ν0:68))、经 Kpn I 限制性消化的DNA片段Δ TNFRSF13Β61连接到经Kpn I切割的pT7H6FX Δ TNFRSF13Β载体 中，构建出最终的表达载体pT7H6FXTNFRSF13B61tripB。得到的FXTNFRSF13B61的核苷酸序 列如SEQ ID NO 69所示。实施例7使用TNFRSF Fnl4受体片段设计和构建三聚TWEAK结合物使用TWEAK受体TNFRSF Fnl4，并基于源自tetranectin的三聚化结构域TripB构 建针对三聚细胞因子TWEAK的三聚结合物。该结合物的设计和克隆如下所述使用标准方法，通过将从人心脏(Clontech Laboratories, Inc目录号7121-1)分 离出的 cDNA 扩增的(用寡核苷酸引物 bamFn-rev(SEQ IDNO 70)和 FNkpn-fo (SEQ ID NO: 71)、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXFnl4连接到经BamH I和Kpn I切割的 载体PT7H6-bktripB中，构建出表达载体pT7H6FXFnl4tripB。得到的FXFnl4的核苷酸序列 如 SEQ ID NO 72 所示。实施例8使用TNFRSF13C受体片段设计和构建三聚BAFF结合物使用BAFF受体TNFRSF13B，并基于源自tetranectin的三聚化结构域TripB构建 针对相应三聚细胞因子BAFF的三聚结合物。该结合物的设计和克隆如下所述三聚TNFRSF13C片段的克隆使用标准方法，通过将从人淋巴结(Clontech Laboratories, Inc目录号7164-1) 分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物baml3C-rev(SEQID NO 73)和13Ckpn_fo (SEQ ID NO :74) J^BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXTNFRSF13C连接到经BamH I和Kpn I切 割的载体PT7H6-bktripB 中，构建了表达载体pT7H6FXTNFSF13CtripB。得到的FXTNFRSF13C 的核苷酸序列如SEQ ID NO 75所示。实施例9TNF的三聚体化CTLD结合物的分离和构建使用如以前在W0/0248189中公开的Tetranectin(SEQ ID NO :96)C_型凝集素-样 结构域(CTLD)的支架结构来分离和构建三聚细胞因子TNF (TNF α)的三聚结合单元。结合 单元的设计和克隆如下所述文库构建和初步筛选使用噬菌体展示来分离TNF CTLD结合物。使用的噬菌体展示文库是基于
31tetranectin 的单价 CTLD 形式(SEQ ID NO 97)。组合文库PhtCTLD-lb003(W0/0248189，实施例 5)和与 PhtCTLD_lb003 的基本相 同地制成的文库变体，该文库变体在装配反应中包括针对环1的两个额外随机化的寡核苷 酸在tetranectin (SEQ IDNO 98)的氨基酸残基位点116-122随机化的TN-lib3_tprev和 TN-Iib2-tprey (SEQ ID NO 99)和针对环4的两个额外寡核苷酸在位点146-149随机化 的 TN-lib3-tpfo(SEQ ID NO 100)和 TN-lib2_tpfo (SEQ ID N0:101)。使用约 IxlO12 个噬 菌体作为输入，进行了 2轮筛�。诘谝宦痔匝≈惺褂�10 μ g/ml生物素化的-TNF，在第二轮 淘选使用lyg/ml。如下进行筛选在Iml PBS(PBS，0.2g KCl,0. 2g KH2PO4,8gNaClU. 44g Na2HPO4, 2H20,用水补加至1L，并用NaOH调节至pH7. 4)中洗涤20 μ 1链霉抗生物素蛋白包被的顺 磁珠(Dynal)2次，在室温下、在3%脱脂奶粉中封闭1小时。将在3%脱脂奶粉/PBS中的 250 μ 1预封闭噬菌体与250 μ 1可溶的生物素化TNF混合，使之在37°C孵育30分钟。在 PBS, 0. 1% Tween 20中洗涤1次、在PBS中洗涤2次链霉抗生物素蛋白珠后，将它们加入反 应物中，以捕获结合了抗原的噬菌体。用PBS、0. I^Tween 20和PBS进一步洗涤珠子，用 200 μ 1 50mM dithiothreitol，将结合了抗原的噬菌体从珠子上洗脱30分钟。用洗脱的噬 菌体重新感染指数生长的大肠杆菌TGl细胞，然后涂布平板，并在含有2%葡萄糖和0. Img/ ml氨苄青霉素的2xTY琼脂平板上滴定。基本上按照W0/0248189所述，通过在ELISA中分析与TNFα的结合而从选择的群 体中筛选出单个克隆，只是在ELISA中用于覆盖的抗原是5 μ g/ml TNF。在第2轮筛选中分离出了称作TN3-2的特异性TNF α结合物(表4)。次级文库构津和亲合力驱动的筛选研究了向ΤΝ3-2引入新的序列变化是否能提高ΤΝ3-2的TNF亲合力。为了构建 ΤΝ3-2突变体文库，使用ΤΝ3-2克隆作为模板，使用寡核苷酸TN-Iib2_tpfo (SEQ ID NO 101)和 TN-Iib3-tpfo (SEQ ID NO 100)在环 4 中进行新的随机化(Lib. TN3-2 1οορ4 r)。 基本上按照W0/0248189所述进行文库构建。在含有递减浓度的生物素化TNF(100ng/ml至0. lng/ml)的3轮亲合力驱动筛选 中使用了 TN3-2100p4r文库。如上所述进行选择。如上所述筛选阳性克隆。结论亲本克隆TN3-2 的序列与 tetranectin 在环 1 (Tetranectin 氨基酸号 116-122) 和环4(Tetranectin氨基酸号146-149)中有所不同。对TN3_21oop4r文库进行3轮亲合 力驱动筛选后，通过ELISA分析鉴别出阳性克�。允境�48个克隆中的45个能结合TNFa。 选出的一种鉴定的TNF α结合克隆的环1和环4序列以及它们对应的SEQ ID NO如表4所 示(ΤΝ3-2-Β, TN3-2-C, TN3-2-D)。表4 亲本克隆ΤΝ3-2的环1和环4中的氨基酸序列和从文库TN3_21oop4r分离 出的3个亲合力成熟化克隆 "tetranectin的环4序列之外的突变实施例10TNF的三聚体化CTLD结合物的亲合力检测将按照实施例7所述分离出的编码单体CTLD TNFa结合物的DNA插入片段亚克 隆进大肠杆菌PBAD表达载体(Invitrogen Corp.，USA)中。使重组单体TNF α结合物在大 肠杆菌中表达，并根据生产商的说明书从周质中纯化。在BiaCore上进行分析之前，将纯化 的单体在 IOmM TrispH8. 0U50mM NaCl、2mM CaCl2 中透析。为了表达TNFa结合物的三聚形式，使用限制性内切核酸酶Bgl II和Mim I切割 编码TNF α结合物的合适DNA插入片段(来自实施例7)，并将含有环1和4的DNA片段亚 克隆进经Bgl II Mun I限制性消化的大肠杆菌pT7H6FX-htlec DNA(如WO 02/48189中的 实施例1和图5所述)中。在大肠杆菌中表达了重组的三聚TNF α结合物，基本上按照WO 94/18227的实施 例9所述纯化未折叠的融合蛋白衍生物。简而言之，通过将融合蛋白上样到处于8Μ脲、50mM Tris-HCl pH8. 0、500mM NaCl、 5mM 2-巯基乙醇中的带Ni2+的次氮基三醋酸(NTA)柱上，进行TNFa结合物的重折叠。上 样以后，对柱进行循环重折叠过程。使用的重折叠缓冲液是复性缓冲液A(50mM Tris-HCl pH8. 0, 500mM NaCl，2mM CaCl2, 2mM还原型谷胱甘肽和0. 2mM氧化型谷胱甘肽)和变性缓 冲液 B(8M 脲，50mM Tris-HCl pH8. 0,500mM NaCl，2mMCaCl2，3mM 还原型谷胱甘肽)。使用 50mM Tris-HCl pH8. 0、500mM NaClUOmM EDTA，将重折叠的融合蛋白从柱上洗脱下来，使 用牛凝血因子 Xa (Protein Engineering Technology, Aarhus, Denmark),以 1 100 (w/ w)、在4°C切割融合蛋白过夜。通过在S^hadex G25上进行凝胶过滤，将切割后的蛋白 换入8M脲、25mM醋酸钠缓冲液(pH5)、50mM NaClUmMTris-HCl缓冲液中，并上样到IOml SP-Sepharose 柱(AmershamBiosciences)上，用 50mM 至 500M NaCl 经 20 个柱体积进行梯 度洗脱。通过非还原性SDS/PAGE分析进行判断，收集含有切割的单体蛋白的级分并合并， 通过在PDlO柱(Amersham Biosciences)上的凝胶过滤将缓冲液换成IOmM Tris ρΗ8· 0、 150mM NaCl、2mM CaCl2。在BIAcore 3000装置(BiaCore，Sweden)上进行了表面等离子体共振(SPR)结 合分析。将要固定化的TNFa捕获抗体(AHC3712，BiosourceInternational)溶解到IOmM 醋酸钠PH5. 0中，并使用胺耦连试剂盒(BiaCore，Sweden)固定到CM5 BiaCore传感器芯片 上。
33
以5μ Ι/min的流速进行结合分析。在将蛋白样品上样之前，将芯片在IOmM Tris pH8. 0,150mM NaCl,2mM CaCl2, 50 μ M EDTA 和 0. 005%表面活性剂 Ρ20 中平衡。将 TNF α 以 10 μ g/mL 的浓度溶解到 IOmM TrispH8. 0，150mM NaCl，2mM CaCl2 中，并注射 10 μ L。使 用KINJECT选项，注射单体或三聚形式的TNF α结合物的等份试样(20 μ 1)进行5分钟的 解离，然后用IOmM甘氨酸ρΗ2. 5再生芯片。在从1至200ηΜ的6个不同蛋白浓度下测试 TNFa结合物的结合。使用BIA评价程序3. 2版(BiaCore)评价结合数据。表5显示了来自BiaCore数据的动力学值。从单体结合物至相应的三聚结合 物(ΤΝ-2-Β, TN-2-C和TN-2-D)有亲合力的增加倍数，显示了将TNF α结合物TN3-2-B， TN3-2-C，TN3-2-D三聚体化的亲合力作用。表 5 通过将TNF α结合物三聚体化，亲合力(Kd)有了显著增长。例如，单体的TN3_2_B 具有非常差的k。ff值。与此相反，同一 CTLD结合物的三聚形式(TN-2-B)的k。ff值提高了超 过1000倍。总体上可以看出，三聚体化能将解离速度提高数倍。而且，实施例7的低亲合 力亲本克隆TN3-2仅能以其三聚形式在BiaCore上检测到，因为其单体的亲合力低于检测 限度。参考文献Studier 和 Moffat(1986)，Journal of Molecular Biology 189:113—130.Hochuli, Ε. ，Bannwarth, W. ,Dobel ,Η. ，Gentz，R.禾口 StUber，D. (1988)，Bio/ Technology 6 :1321_1325·Lorentsen, RH.等(2000)Biochemical Journal 347 83-87.
权利要求
含有3个单体的三聚多肽，其中每个所述的单体含有能结合三聚细胞因子的特异性结合元件，且每个所述的单体含有三聚化结构域。
2.根据权利要求1的三聚多肽，其中所述的三聚细胞因子是肿瘤坏死因子配体超家族 的成员。
3.根据权利要求2的三聚多肽，其中所述的肿瘤坏死因子配体超家族的成员选自由下 述组成的组LTA ； TNF ； LTB ； TNFSF4 ； TNFSF5 ； TNFSF6 ； TNFSF7 ； TNFSF8 ； TNFSF9 ； TNFSF10 ； TNFSFl 1 ； TNFSF12 ； TNFSF13 ； TNFSF13B ； TNFSF14 ； TNFSF15 ；和 TNFSF18。
4.根据权利要求2的三聚多肽，其中所述的特异性结合元件是源自肿瘤坏死因子受体 超家族成员的多肽。
5.根据权利要求2的三聚多肽，其中所述的肿瘤坏死因子受体超家族成员选自由下 述组成的组:TNFRSF1A, TNFRSF1B, LTBR, TNFRSF4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFRSF6B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF1 OA, TNFRSF1 OB, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF12, TNFRSF12L, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, TNFRSF Fnl4, NGFR, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF19L, TNFRSF21, TNFRSF22 和 TNFRSF23。
6.根据权利要求1的三聚多肽，其中所述的特异性结合元件源自TNFRSFlA(p55TNF受 体)。
7.根据权利要求1的三聚多肽，其中所述的特异性结合元件源自TNFRSFlB(p75TNF受 体)。
8.根据权利要求7的三聚多肽，其中所述的特异性结合元件是含有选自下述的氨基酸 序列的多肽TNFRSF1B 1-235 (SEQ ID NO 76), TNFRSFIB 1-185 (SEQ ID NO 77), TNFRSF1B 1-163 (SEQ ID NO 78)和 TNFRSFIB 1-142(SEQ ID NO :79)。
9.根据权利要求7的三聚多肽，其中所述的特异性结合元件是含有由选自下述的DNA 序列编码的氨基酸序列的多肽TNFRSF1B D1D2(SEQ IDNO 13)，TNFRSF1B D1D2，1/6(SEQ ID NO 15)，TNFRSFIB D1D2 1/4(SEQID NO 17)，TNFRSF1B D1D2,1/3 (SEQ ID NO 19), TNFRSF1B D1D2,1/2 (SEQ ID NO 21), TNFRSF1B D1D4(SEQ ID NO 23), TNFRSF1B D2 (SEQ IDNO 25)，TNFRSF1B D2,1/6(SEQ ID NO 26)，TNFRSF1B D2,1/4(SEQ IDNO27)，TNFRSF1B D2,1/3(SEQ ID NO 28), TNFRSF1B D2,1/2(SEQ IDNO 29)和 TNFRSFIB D2D4(SEQ ID NO: 30)。
10.根据权利要求1的三聚多肽，其中所述的特异性结合元件是抗体或抗体片段。
11.根据权利要求10的三聚多肽，其中所述的抗体或抗体片段能在至少一个区域内结 合人TNF(SEQ ID NO :80)，该区域选自由下述的氨基酸残基组成的区域氨基酸残基1-18， 1-20，1-26，1-30，12-22，22-31，22-40，36-45，49-97，49-98，56-79，58-65，69-97，70-87， 76-90,96-105,105-128，108-128，110-127，115-125，117-128，132-157，135-155，136-153， 138-149，141-153 和 146-157。
12.根据权利要求11的三聚多肽，其中所述的抗体或抗体片段选自MAb1(ECACC89080301)，MAb21 (ECACC 90012432)，MAb 25 (ECACC89121401)，MAb 32 (ECACC89080302)，MAb37 (ECACC 89080303)，MAb42 (ECACC 89080304)，MAb 47 (ECACC 89121402), MAb 53 (ECACC90012433)和 MAb 54 (ECACC 89083103)或其片段。
13.根据权利要求10的三聚多肽，其中所述的抗体是D2E7或其片段。
14.根据权利要求9的三聚多肽，其中所述的抗体是CDP870或其片段。
15.根据权利要求1的三聚多肽，其中所述的特异性结合元件是具有C型凝集素样结构 域(CTLD)支架结构的蛋白质。
16.根据权利要求15的三聚多肽，其中所述的具有C型凝集素样结构域的特异性结合 元件是选自TN3-2-B(SEQ ID NO: 103)，TN3-2-C (SEQID NO 104)和 TN3_2_D(SEQ ID NO: 105)。
17.根据权利要求1的三聚多肽，其中所述的三聚化结构域是源自tetranectin。
18.根据权利要求17的三聚多肽，其中所述的源自tetranectin的三聚化结构域含有 与SEQ ID NO 81的序列具有至少68%氨基酸序列相同性的序列。
19.根据权利要求18的三聚多肽，其中所述的氨基酸序列相同性至少为75%，例如至 少87%，包括至少92%。
20.根据权利要求17的三聚多肽，其中所述的源自tetranectin的三聚化结构域含有 氨基酸序列SEQ ID NO :81ο
21.根据权利要求17的三聚多肽，其选自TN-2-B(SEQID NO 106)，TN-2-C (SEQ ID NO 108), TN-2-D(SEQ ID NO 107)和 AD1D4-GSS-I10(SEQID NO: 109)。
22.根据权利要求1的三聚多肽，其中还含有位于所述特异性结合元件和三聚化结构 域之间的接头。
23.一种药物组合物，其含有根据权利要求1-22中任一项的三聚多肽。
24.治疗患有由三聚细胞因子、例如肿瘤坏死因子介导的病理的对象的方法，包括给所述 的对象施用有效量的根据权利要求1-22中任一项的三聚多肽或根据权利要求23的组合物。
25.根据权利要求24的方法，其中所述的肿瘤坏死因子介导的病理选自类风湿性关 节炎、银屑病和克罗恩氏病。
26.制备含有3个单体的三聚多肽的方法，每个所述单体含有能结合三聚多肽细胞因 子的特异性结合元件，且每个所述单体含有三聚化结构域，所述的方法包括下述步骤(i) 在能表达所述三聚多肽的条件下，培养用编码所述三聚多肽的载体转化的宿主；和(ii)分 离所述的三聚多肽。
27.根据权利要求26的方法，其中所述的特异性结合元件含有选自下述的氨基酸 序列TNFRSFIB 1-235 (SEQ ID NO 76)，TNFRSFIB 1-185 (SEQ ID NO 77), TNFRSF1B 1-163(SEQ ID NO 78)和 TNFRSFIB 1-142(SEQID NO :79)。
28.根据权利要求26的方法，其中所述的特异性结合元件是多肽，其含有由选自下述 的DNA序列编码的氨基酸序列:TNFRSF1B D1D2(SEQ IDNO 13) ,TNFRSF1B D1D2,1/6 (SEQ ID NO 15),TNFRSF1B D1D21/4(SEQID NO :17)，TNFRSF1B D1D2,1/3(SEQ ID NO 19),TNFRSF1B D1D2,1/2 (SEQ ID NO :21)，TNFRSF1B D1D4(SEQ ID NO :23)，TNFRSF1B D2 (SEQ IDNO :25)， TNFRSF1B D2,1/6(SEQ ID NO 26),TNFRSF1B D2,1/4(SEQ IDNO :27)，TNFRSF1B D2,1/3(SEQ ID NO 28), TNFRSF1B D2,1/2 (SEQ IDNO :29)和 TNFRSFIB D2D4 (SEQ ID NO :30)。
29.根据权利要求1-22中任一项的三聚多肽的应用。
30.根据权利要求1-22中任一项的三聚多肽在制备药物组合物中的应用。
31.检测样品中的三聚细胞因子的实验方法，其包括(i)使所述样品与根据权利要求 1的三聚多肽接触，和(ii)检测所述三聚多肽与所述三聚细胞因子的结合。
全文摘要
本发明提供了能结合三聚细胞因子的三聚结合单元。更具体地，提供了含有三聚化结构域和3个单体的三聚多肽，所述单体含有能结合三聚细胞因子的结合元件。优选地，该三聚结合单元以这样的方式结合，使得在结合以后，能基本上封闭三聚细胞因子的全部受体结合位点，从而抑制三聚细胞因子的潜在生物活性。一方面，本发明涉及能结合肿瘤坏死因子配体超家族的三聚细胞因子例如TNF、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL和BAFF的三聚结合物。
文档编号G01N33/68GK101899106SQ20101013525
公开日2010年12月1日 申请日期2003年10月29日 优先权日2002年10月29日
发明者H·K·奥托, M·H·安德森, T·L·霍尔帝特 申请人:阿纳福公司
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