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专利名称：血清中肌酐的二步酶法测定方法及测定试剂的制作方法
技术领域：
本发明 涉及医学检验技术领域，具体涉及一种血清中肌酐的二步酶法测定方法及测定试剂。
背景技术：
肌酐(Cr)是一种低分子含氮化合物，相对分子质量116，000。Cr主要由肌肉产生，是肌酸的终末代谢产物，正常情况下，人体内Cr的含量基本稳定，一般维持在3 14mg/L，仅仅由肾小球排泄，不被肾小管重吸收，由于Cr是小分子物质不与血浆蛋白结合，所以测定血清Cr浓度及根据血清Cr与尿酐浓度计算所得的Cr清除率是既简单又可靠的肾小球滤过功能指标，深受临床重视。临床实验室对于血和尿中Cr的测定常用酶法或碱性苦味酸法(Jaffe法)，Jaffe法虽然试剂较便宜，但线性范围窄，易受血清中其他假性Cr物质的干扰，尤其是当血清胆红素值彡165.5 iimol/L时开始出现负偏差，而且血清胆红素越高偏差越大。此外。JafTe法受到酮体、乳糜血和溶血的严重干扰，头孢类和维生素C及多巴胺等药物也使其结果出现较大干扰。酶法利用Cr在肌酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶等酶及显色剂和水、氧的共同作用下生成醌亚胺(红色)，通过检测反应终点的吸光度来推算样品中Cr的含量，酶法不管是一步酶法或两步酶法，测定过程中Cr水解后产生的肌酸和内源性肌酸同时转化为醌亚胺，Cr测定结果包括了 Cr和肌酸之和。正常男性血Cr参考范围为53 106 y mol/L，女性44 88 u mo I/L ;正常男性血肌酸参考范围为15 45 u mol/L,女性为30 80 u mol/L,当发生急性肌损伤、饥饿、糖尿病、营养不良、甲亢、发热时肌酸显著升高，对Cr造成的偏差更显著。为解决内源性肌酸干扰，仅以肌酐酶为第二试剂的两步酶测定方法，由于第一步反应体系中有4-AAP和色原，肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶催化作用产生醌亚胺，肌酸被转化而被耗�。�当加入肌酐酶后启动Cr水解反应生成肌酸，再经肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶催化作用产生醌亚胺，反应过程如下第一步反应
^ %
肌ft+H20+02 —>鱗氨酸+麗素(I)
- 、
肌奴酸+H20+02 ^> 11' -+ 1I1 m+ H2O2 (2)
,卿,
H202+4-AAP+ 色原^ Si亚胺+2H20+HC1C 3 )第二步反应
权利要求
1.一种血清中肌酐的二步酶法测定方法，其特征在于利用肌酐测定试剂的试剂I中的过氧化氢酶消除内源性肌酸产生的过氧化氢，进而由肌酐测定试剂的试剂2中的过氧化氢酶抑制剂抑制试剂I中的过氧化氢酶，从而测定样本中肌酐含量。
2.根据权利要求I所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法，其特征在于所述的肌酐测定试剂的试剂I中包含过氧化氢酶，肌酸酶，肌氨酸氧化酶和色原，试剂2中包含过氧化氢酶抑制剂，肌酐酶，过氧化物酶和4-氨基安替比林；其中过氧化氢酶抑制剂为叠氮化物，羟胺，氟化物，醋酸盐，甲酸盐，乙醇、甲醇中的一种或几种。
3.—种权利要求I或2所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂，其特征在于该试剂由试剂I和试剂2组成，其中试剂1、2各组分及浓度范围为 试剂I : 缓冲ft (pH 7, (F8. 5) 50-500 _ol/L 肌酸酶 1-100 Kl L 眺鉍酸杈化_ 1-100 K17L 抗坏血酸鉍化_ HOO KU/L JiWtMW 0 卜20 HJ/L 色I-1U() mmol/L 表_'活性剂 0. HOO g/L 1-100 mmol I 防腐剂0.1-100 ml .I; 试剂2 缓冲液 Cpll 7. 0-8. S) 50-500 mmol； LKmm Ho。ku/l -1-鉍基安替比林 0.5-50 mmo I /I, 过氣化物SI 卜100 KU/L 去干扰_ 0. 05-10 mnol/L 抑制剂1-100 mmo I/I 稳定剂1-100 mmol/I 0. 1—100 ml/L0
4.根据权利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂，其特征在于所述缓冲液为磷酸缓冲液、三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N’ -2-乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N，N-双(2-羟基乙烷磺酸)缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-(N-吗啡啉)乙磺酸钠缓冲液、4- (2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’ -4- 丁磺酸缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-I-丙磺酸缓冲液、4- (2-羟乙基)-I-哌嗪丙磺酸缓冲液、3_(环己胺)-1_丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液的一种或几种。
5.根据权利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂，其特征在于所述的色原为酚类化合物，和/或苯胺类似物，3-羟基-2，4，6-三碘苯甲酸的一种。
6.根据权利要求5所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂，其特征在于所述的酚类化合物为2-氯酚，2，4- 二氯苯酚，4-氯酚，2，6- 二氯苯酚中的一种；所述的苯胺类似物为N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)_3_甲基苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基1)-3-甲氧基苯胺钠盐(二水合物)，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N- (3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N- (2-羟基-3-磺丙基)-3，5- 二甲氧基苯胺钠盐，N- (2-羟基-3-磺丙基)-3 5- 二甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N- (2-羟基-3-磺丙基)_3，5- 二甲基苯胺钠盐中的一种。
7.根据权利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂，其特征在于所述的去干扰剂为亚铁氰化钾、高铁氰化钾、胆红素氧化酶中的一种或几种。
8.根据权利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂，其特征在于所述的防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、proclin系列防腐剂中的一种或几种。
9.根据权利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂，其特征在于所述的稳定剂选自聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA中的一种或者几种。
10.根据权利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂，其特征在于所述的表面活性剂为TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列中一种。
全文摘要
本发明公开一种血清中肌酐的二步酶法测定方法及测定试剂，利用肌酐测定试剂的试剂1中的过氧化氢酶消除内源性肌酸产生的过氧化氢，进而由肌酐测定试剂的试剂2中的过氧化氢酶抑制剂抑制试剂1中的过氧化氢酶，从而测定样本中肌酐含量。本发明具有可规避以过氧化物酶氧化过氧化氢造成的本底升高、致使检测结果准确度、精密度不好的优点。
文档编号G01N21/78GK102721684SQ20121016876
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月24日 优先权日2012年5月24日
发明者沃燕波, 邹炳德, 邹继华 申请人:宁波美康生物科技股份有限公司