专利名称：滤纸片气相色谱-质谱分析检测尿有机酸/氨基酸代谢产物的方法
技术领域：
本发明属于有机酸或氨基酸代谢产物的检测方法，具体涉及采用尿滤纸通过气相色谱-质谱分析检测尿有机酸/氨基酸代谢产物的方法。
背景技术：
由于尿中含有氨基酸、糖类、脂质和许多其它内源性化合物的终末或中间代谢产物，这些有机化合物有相对较高的水溶性和肾廓清率，其浓度通常亦高于血清和其他体液，且标本最易于收集。既往我国对遗传代谢缺陷病仅能进行初步检测；依赖将标本送至国外合作单位确定，严重滞后遗传代谢性疾病的筛查、治疗和发病机制研究工作的开展，影响我国该医学领域的整体水平。
北美及欧洲所采用的气相色谱-质谱联用(gas chromatography-massspectrometry，GC-MS)方法为利用原尿标本直接分析，或冷冻后快递至检测中心，不适合我国国情，易漏诊支链酮酸代谢障碍。近年日本学者应用滤纸收集尿标本，经尿素酶处理后不经有机萃取直接进行GC-MS分析，用以鉴定有机酸和部分氨基酸及糖醇代谢产物，试图推行用GC-MS方法进行遗传代谢性疾病新生儿群体筛查。但气相色谱峰杂峰甚多，不利结果分析，且甚易污染气相色谱柱和质谱离子源，其简单尿氨基酸分析结果亦不足以诊断和研究复杂氨基酸病。
发明内容
本发明的目的在于对尿滤纸进行肟化、萃取后，利用气相色谱-质谱分析检测尿有机酸/氨基酸代谢产物的方法。
本发明是这样实现的1)采用滤纸片收集尿标本；2)对滤纸尿标本进行洗脱处理，测定肌酐含量确定尿液浓度，得到尿液样本；3)对尿液样本完成a-酮酸的肟化反应；4)采用有机溶剂进行萃�。�5)对上述处理的样本进行甲基硅烷化衍生；6)采用气相色谱仪-质谱仪联合对尿样进行检测。根据所要检测的物质建立有机酸、氨基酸及其他代谢产物质谱图谱库。
采用本发明所建立的方法具有如下优点1、采用滤纸收集尿标本，适合我国人口众多、幅员辽阔、地区发展不平衡的特点，有利于进行大规模的遗传代谢缺陷病的高危筛查、研究及远程分析，符合我国国情；2、萃取前常规进行肟化处理程序，利于α-酮酸的检出，不致漏诊重要的支链酮酸代谢障碍；3、应用乙酸乙酯和乙醚两次有机萃�。醇◆慷糠治�。有机酸/氨基酸代谢产物回收率高，重复性好。色谱杂峰少，不至污染色谱毛细管柱和质谱离子源；4、所选定色谱-质谱定性/定量分析条件稳定，样本色谱峰分离效果良好，质谱图信息完整，易于计算机谱库鉴定。样本分析时间短，适合高通量样本筛查分析。
图1本方法检测的正常尿有机酸/氨基酸GC-MS分析色谱图；图2本方法检测的甲基丙二酸尿症尿GC-MS分析色谱3本方法检测的多种羧化酶缺乏症尿GC-MS分析色谱图具体实施方式
1、尿标本收集采用国产新华3号滤纸，切成5cm×8cm大�。占磕蚧蛉我獯文颍粤栏珊笾米ㄓ寐酥礁稍锎�。
2、滤纸尿标本处理干燥滤纸尿样用2ml去离子双蒸水分次洗脱，离心，收集洗脱液。
3、确定尿样浓度测定肌酐含量确定尿液浓度，取相当2.5μmol肌酐尿样。
4、样本中加入50μg内标十五烷酸和2-酮己酸，与100μl盐酸羟胺、200μl0.25M硫酸、500μl饱和氯化胺混合45min以完成α-酮酸的肟化反应，改善支链酮酸的回收率。
5、在酸性环境下，分别用3ml乙酸乙酯和乙醚进行两次萃�。邢阜掷氩⒑喜⒂谢芗料啵�1g无水硫酸钠(震荡、离心)去除少许残余水份，加入外标饱和24烃(C24)，用纯净氮气吹干。
6、萃取后的样本中加入100μl甲基硅烷化衍生剂N，O-双-(三甲基硅烷基)-三氟乙酰胺和1％三甲基氟硅烷(BSTFA+1％TMS)，置干燥加热器上60℃衍化30~60min，冷却后用正己烷稀释至500μl。取1μl上样进行GC-MS分析。
7、气相色谱仪-质谱仪联合分析应用安捷伦5890/5973N型GC-MS进行样本分析，配备7673型自动进样器，HP-5毛细管色谱柱，柱长30m，直径0.32mm，膜厚0.25μm。色谱和质谱分析条件如下采用无分流式进样，进样口温度设定为250℃。氦气为载气(1ml/min)，界面温度250℃。质谱检测采用电子离解模式总离子扫描方式(EI 70eV)，质荷比(m/z)范围50~到600，扫描周期0.4s。色谱柱箱程序升温从60℃开始，20℃/min升温至90℃后停留4min，然后以8℃/min升温至300℃，样本分析时间约25min。计算机系统记录色谱和质谱图形，应用质谱图谱库参比鉴定和各色谱峰的丰度进行定性和定量分析。
依上述对多种尿样进行检测如图1所示，图中各色谱峰依此鉴定为1.乳酸；2.乙醇酸；3.3-羟基丁酸；4.尿素；5.乙酰乙酸；6.乙基丙二酸；7.琥珀酸；8.内标-I；9.3-甲基戊烯二酸；10.3-羟基己二酸内酯；11.己二酸；12.庚烯酸；13.4-羟基苯乙酸；14.不饱和辛二酸；15.辛二酸；16.乌头酸；17.高香草酸；18.枸椽酸；19.马尿酸；20.3-甲基-4-羟基扁桃酸；21.内标-II；22.3-羟基癸二酸；23.4-羟基马尿酸；24.外标如图2所示，图中各色谱峰依此鉴定为1.乳酸；2.乙醇酸；3.3-羟基丙酸；4.丙酮酸；5.3-羟基丁酸；6.甲基丙二酸；7.丙二酸；8.苯甲酸；9.琥珀酸；10.内标-I；11.延胡索酸；12.戊二酸；13.扁桃酸；14.2-羟基戊二酸；15.3-羟基己二酸；16.3-羟-3-甲基戊二酸；17.4-羟基苯乙酸；18.高香草酸；19.4-羟基苯乳酸；20.内标-II；213-甲基-4-羟苯乳酸；22.外标如图3所示，图中各色谱峰依此鉴定为1.乳酸；2.3-羟基丙酸；3.丙酮酸；4.4-羟基丁酸；5.3-羟基戊二酸；6.尿素；7.琥珀酸；8.内标-I；9.丙酰甘氨酸；10.异丁酰甘氨酸；11.3-羟-3-甲基戊二酸；12.3-甲基巴豆酰甘氨酸；13.甲基巴豆酰甘氨酸；14.4-羟基苯乙酸；15.乌头酸；16.高香草酸；17.马尿酸；18.3-甲基-4-羟基扁桃酸；19.内标-II；20.外标。
权利要求
1.滤纸片气相色谱-质谱分析检测尿有机酸/氨基酸代谢产物的方法，其特征步骤是1)采用滤纸片收集尿标本；2)对滤纸尿标本进行洗脱处理，测定肌酐含量确定尿液浓度，得到尿液样本；3)对尿液样本完成a-酮酸的肟化反应；4)采用有机溶剂进行萃�。�5)对上述处理的样本进行甲基硅烷化衍生；6)采用气相色谱仪-质谱仪联合对尿样进行检测。
2.如权利要求1所述滤纸片气相色谱-质谱分析检测尿有机酸/氨基酸代谢产物的方法，其特征是所述收集的尿标本是晨尿。
3.如权利要求1所述滤纸片气相色谱-质谱分析检测尿有机酸/氨基酸代谢产物的方法，其特征是所述a-酮酸的肟化反应是在样本中加入内标十五烷酸和2-酮己酸，与盐酸羟胺、硫酸、饱和氯化胺混合，完成α-酮酸的肟化反应。
4.如权利要求1所述滤纸片气相色谱-质谱分析检测尿有机酸/氨基酸代谢产物的方法，其特征是所述萃取是采用乙酸乙酯和乙醚进行两次萃�。邢阜掷氩⒑喜⒂谢芗料�。
5.、如权利要求1或4所述滤纸片气相色谱-质谱分析检测尿有机酸/氨基酸代谢产物的方法，其特征是在萃取后对样本进行残余水份去除，其方法是加入无水硫酸钠通过震荡、离心，去除残余水份，再加入加入外标C24，用纯净氮气吹干。
6.如权利要求1所述滤纸片气相色谱-质谱分析检测尿有机酸/氨基酸代谢产物的方法，其特征是所述甲基硅烷化衍生是在样本中加入甲基硅烷化衍生剂，置干燥加热器上60℃～90℃衍化30～60min，冷却后用正己烷稀释。
7.如权利要求1所述滤纸片气相色谱-质谱分析检测尿有机酸/氨基酸代谢产物的方法，其特征是建立有机酸、氨基酸及其他代谢产物质谱图谱库。
全文摘要
本发明公开了一种滤纸片气相色谱－质谱分析检测尿有机酸/氨基酸代谢产物的方法。该方法是将滤纸收集的尿液经过洗脱、肟化反应、萃取、甲基硅烷化衍生后采用气相色谱仪－质谱仪联合对尿样进行检测。本发明的方法具有如下优点1.采用滤纸收集尿标本，适合我国人口众多、幅员辽阔、地区发展不平衡的特点，有利于进行大规模的遗传代谢缺陷病的高危筛查、研究及远程分析，符合我国国情；2.具有肟化处理程序，利于α－酮酸的检出，不致漏诊重要的支链酮酸代谢障碍；3.通过萃�。谢�/氨基酸代谢产物回收率高，重复性好。色谱杂峰少，不至污染色谱毛细管柱和质谱离子源；4.采用气相色谱－质谱定性/定量分析条件稳定，样本色谱峰分离效果良好，样本分析时间短，适合高通量样本筛查分析。
文档编号G01N33/493GK1532544SQ0311879
公开日2004年9月29日 申请日期2003年3月20日 优先权日2003年3月20日
发明者罗小平, 王慕逖, 魏虹, 梁雁, 宁琴 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院
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