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专利名称：稳定的抗体组合物和用于稳定其的方法
稳定的抗体组合物和用于稳定其的方法与相关申请的交叉参考
本申请要求于2008年11月观日提交的美国临时申请系列号61/118，528的优先权， 其内容引入本文。
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白细胞介素-12 (IL-12)和相关细胞因子IL-23是共享共同p40亚单位的细胞因子的 IL-12 超家族成员(Anderson 等人(2006) Springer Semin. Immunopatho 1. 27:425-42)。 IL-12主要刺激Thl细胞的分化和干扰素-Y的随后分泌，而IL-23优先刺激幼稚T细胞分化成效应T辅助细胞(Thl7)，其分泌IL-17，促炎介质(Rosmarin和Mrober (2005) J. Drugs Dermatol. 4:318-25 ；Harrington ^A (2005) Nature Immunol. 6:1123-32 ；Park 等人(2005) Nature Immunol. 6:1132-41)。人白细胞介素12 (IL-12)是具有独特结构和多效性作用的细胞因子(Kobayashi 等人(1989) J. Exp. Med. 170 :827-845 Jeder 等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10188-92 ;Ling 等人(1995) J. Exp. Med. 154:116-127 ;Podlaski 等人(1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237IL-12 是包括；35 kDa 亚单位(p35)和 40 kDa 亚单位 (P40)的异二聚体蛋白质，所述亚单位通过二硫键连接在一起(称为“p70亚单位”)。异二聚体蛋白质主要通过抗原呈递细胞例如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞产生。这些细胞类型还分泌相对于P70亚单位过量的p40亚单位。p40和p35亚单位在遗传上无关，并且无一据报道具有生物学活性，尽管P40同二聚体可以充当IL-12拮抗剂。IL-12在与涉及免疫和炎症应答的几种疾病相关的病理学中起关键作用。IL-12、其生物学活性及其在疾病中的作用的综述可以在 Gately 等人(1998) Ann. Rev. Immunol. 16 :495-521 中找到。功能上，IL-12在调节抗原特异性T辅助类型(Thl)和2型(Th2)淋巴细胞之间的平衡中起关键作用，这控制自身免疫病症的起始和进展，并且在Thl淋巴细胞分化和成熟的调节中是关键的。由Thl细胞释放的细胞因子是炎性的，并且包括干扰素γ (IFN γ, IL-2和淋巴毒素(LT)。Th2细胞分泌IL-4、IL_5、IL_6、IL-10和IL-13，以促进体液免疫、 变态反应和免疫抑制。人白细胞介素23(IL_23)是包括19 kDa亚单位(ρ 19)和共同40 kDa亚单位(ρ40) 的异二聚体蛋白质，其通过二硫键连接在一起。IL-23类似于IL-12主要通过抗原呈递细胞例如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞产生。IL-23的主要作用涉及刺激⑶4+ T细胞(也称为IL-17 T细胞或Thl7)亚群，以产生细胞因子IL-17。IL-17本身又是自身免疫炎症的确立和维持中的关键组分，诱导通过内皮细胞和巨噬细胞的促炎细胞因子生产(Kastelein 等人(2007)加Rev. Immunol. 25:221-42)。与Thl应答在自身免疫疾病中的优势以及IFN Y和IL-17的促炎活性一致，IL-12 和IL-23在与许多自身免疫和炎性疾病相关的病理学中起主要作用，例如类风湿性关节炎 (RA)、多发性硬化(MS)、牛皮癣、胰岛素依赖性糖尿病和Crohn氏病(⑶)。与健康对照相比较，升高水平的IL-12 p70已在RA患者的滑液中检测出(Morita 等人(1998)Arthritis and Rheumatism 41 306-314)。在RA滑液中的细胞因子信使核糖核酸(mRNA)表达概况占优势地鉴定Thl细胞因子。(Bucht等人(1996)Clin. Exp. Immunol. 103:；347-367)。使用缺乏IL-23的pl9亚单位或IL-12/23的p40亚单位的基因靶向的小鼠，IL-23显示对于胶原诱导的关节炎发展是关键的(Murphy等人(2003)乂 Exp. Med. 198 (12) 1951-1957)。具有MS的人患者已证实IL-12/IL-23表达中的增加，如通过急性MS斑中的p40 mRNA 水平证明的。(参见例如，Windhagen 等人(1995)J. Exp. Med. 182:1985-96)。此外， 与对照T细胞相比较，抗原呈递细胞用来自MS患者的⑶40L表达T细胞的先体外后体内刺激导致增加的IL-12生产，与⑶40/⑶40L相互作用是IL-12的有效诱导物的观察一致。 使用缺乏IL-23的基因靶向的小鼠，IL-23显示对于脑的自身免疫炎症是关键的(Cua等人 (.2QQ ,)Nature 421:7440748)。增加的IFN Y和IL-12表达已在具有⑶的患者的肠粘膜中观察到(Fais等人(1994) J. Interferon Res. 14 235-238 ;Parronchi 等 A (1997) Am. J. Path. 150823-832 ；Monteleone 等人(1997gastroenterology 112:1169-1178，和 Berrebi 等人 (1998)Am. J. Path. 152 667-672)。来自⑶患者的固有层的T细胞的细胞因子分泌概况是占优势地Thl应答的特征，包括极大升高的IFN γ水平(Fuss等人(1996) J. Immunol. 157:1261-1270)。此外，来自⑶患者的结肠组织切片显示IL-12表达巨噬细胞和IFN γ 表达 T 细胞的丰度(Parronchi 等人(1997)Am. J. Path. 150823-832)。增加的 IL-23 表达也已在具有Crohn氏病的患者和炎性肠病的小鼠模型中观察到。IL-23对于T细胞介导的结肠炎是关键的，且在结肠炎的小鼠模型中通过IL-17-和IL-6依赖性机制促进炎症(参见例如通过 Zhang 等人(2007)7/ iera. Immunopharmacology 7:409-416 的综述)。IL-12/IL-23 p40和IL-23 pl9信使RNA在牛皮癣皮肤损伤中的超表达暗示用针对IL-12/23 p40亚单位蛋白质的中和抗体抑制IL-12和IL-23可以提供用于治疗牛皮癣的有效治疗方法(Yawalkar 等人(1998) J. Invest. Dermatol. Ill :1053-57 ;Lee 等人(2004) J. Exp. Med. 199 :125-30 ;Shaker 等人(2006) Clin. Biochem. 39:119-25; Piskin 等人(2006) J. Immunol. 176 :1908-15 ；还参见由 iTorti 等人(2007)7； Am. Acad. Dermatol. 57 (6) : 1059-1068 ;Fitch 等人(2007)0/rre/ i TSewBaioA^F Tfeports 9:461-467)的近期综述。)。2种细胞因子都促成在牛皮癣中1型T辅助细胞(Thl)免疫应答的发展，但各自具有独特作用(Rosmarin和Strober (2005) J. Drugs Dermatol. 4:318-25 ;Hong等人(1999)J. Immunol. 162:7480 - 91 ;Yawalkar等人(1998)J. Invest. Dermatol. 111:1053-57)。用于牛皮癣治疗的此种治疗方法是本领域明确需要的。由于人IL-12和IL-23在多种人病症中的作用，治疗策略已设计为抑制或抵消 IL-12/IL-23活性。特别地，已寻求结合且中和IL-12/IL-23的p40亚单位的抗体作为抑制IL-12/IL-23活性的工具。一些最早的抗体是鼠单克隆抗体(mAbs)，通过由用IL-12 免疫接种的小鼠的淋巴细胞制备的杂交瘤分泌(参见例如Strober等人的PCT公开号WO 97/15327 ;Neurath 等人(1995) J. Exp. Med. 182 1281-1290 ;Duchmann 等人(1996) J. Immunol. 26:934-938).这些鼠IL-12抗体对于其体内用途是受限的，这是由于与小鼠抗体施用于人相关的问题，例如短血清半衰期、不能触发特定人效应子功能和在人中引起针对小鼠抗体的有害的免疫应答(“人抗小鼠抗体”(HAMA)反应)。一般而言，克服与全鼠抗体在人中的使用相关的问题的尝试已涉及将抗体基因工程改造为更“人样”。例如，已制备了其中抗体链的可变区是鼠衍生的并且抗体链的恒定区是人衍生的嵌合抗体(Junghans 等人(1990) Cancer Res. 50 1495-1502 ;Brown 等人 (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2663-2667 ;Kettleborough 等人(1991 )Protein Engineering 4:773-783)。然而，因为这些嵌合和人源化抗体仍保留一些鼠序列，所以它们仍可能引起有害的免疫反应，人抗嵌合抗体(HACA)反应，尤其当施用延长的时间段时。针对鼠抗体或其衍生物(例如嵌合或人源化抗体)的优选IL-12/IL-23抑制试剂是完全人抗IL-12/IL-23抗体，这是因为此种试剂不应引起HAMA反应，即使用于延长的时间段。已描述了这样的重组人抗体，其以高亲和力和缓慢解离动力学结合人IL-12/IL-23 的p40亚单位，并且具有中和人IL-12的能力，包括hIL-12诱导的植物凝集素胚细胞增殖 (blast proliferation)和hIL-12诱导的人IFNy生产(参见美国专利号6，914，128)。单克隆抗体(Mabs)对于特异性抗原的选择性使得其成为极佳的治疗候选物。然而，由于抗体分子的结构，它们易受酶促和非酶促降解攻击。例如，抗体在升高的温度贮存延长的时间段导致抗体的非酶促降解(Connell，G.E.和R. H. Painter (1966) Can. J. Biochem. 44 (3):371-9 ;Cordoba，A. J.等人(2005)J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 818 (2) : 115-21 ;Cohen，S. L.等人(2007) J. Am. Chem. Soc. 129 (22) :6976-7)ο人免疫球蛋白Y (IgG)抗体一般由2条等同轻链和重链组成。重链具有Y类型， 而轻链可以是κ或λ类型，在其羧基末端恒定区中不同。链间二硫键使重链保持在一起。 二硫键数目在IgG亚类中不同。例如，对于IgGl，存在2个重链间二硫键，以及一个二硫键使每条轻和重链保持在一起。IgG分子由通过铰链区连接的Fc区和2个Fab区组成。铰链区分成3个部分-上部、核心和下部区域(

图1)。上部区域使Fab臂与核心连接，而下部区域使Fc部分与核心连接。核心区包含链间二硫键，并且具有高脯氨酸含量。铰链区的长度在IgG亚类中不同， 并且提供对于Fab臂的弹性，从而允许在臂之间的角度变化以及围绕其轴的旋转自由。由于其弹性的结果，铰链区暴露，并且因此容易受温度和延长时间段的贮存干扰。例如，铰链区对于蛋白酶例如木瓜蛋白酶和Iys-C易接近，这常规地用于生成抗体的Fc和Fab片段。 在这个区域中切割IgG分子的其他酶包括组织蛋白酶L、纤溶酶和金属蛋白酶。当在5°C贮存延长的时间段时，在液体制剂中的单克隆抗体经历非酶促水解， 从而获得 Fab+Fc 和 Fab 片段(Jiskoot，W.等人(1990) Pharm. Res. 7 (12) :1234-41 ； Alexander，A. J.和 D. Ε· Hughes (1995)Anal. Chem. 67 (20):3626-32 ；Cordoba,A. J.等 Λ(2005) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 818 (2) :115-21 ； Liu，H.等人(2006) J. Chrom. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 837:35-43;和 Cohen，S. L.等人(2007) J. Am. Chem. Soc. 1 (22) :6976_7)。一般通过尺寸排阻层析(SEC)监控的断裂在极端pH条件和高温下增加(Cohen，S. L.等人(2007) J. Am. Chem. Soc. 129(22):6976-7)。切割跨越重链区序列 kr-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys 在多个肽键上发生。跨越重链序列Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys的切割导致Fab片段(48 kDa) 的相应梯，而在％1-078残基之间的切割经由β消除机制发生，并且导致重和轻链片段(23 kDa)。在包含κ轻链的IgG分子的铰链区中金属诱导的断裂在重组单克隆抗体 Campath 中得到证实(Smith，Μ. Α.等人(1996) Int. J. Pept. Protein Res. 48 (1):48-55)。Smith等人报道在微碱性pH铜介导的断裂，并且切割特异性定位在重链序列 Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys的铰链区中的赖氨酸和苏氨酸残基之间。切割机制未由作者揭示，然而，切割在pH 5-6的酸性条件下减少。仍需要测定围绕抗体分子断裂的参数，以提供稳定组合物(例如制剂)和用于在加工和贮存过程中阻止其制剂中的抗体切割的方法。例如，仍需要包括抗体或其片段的水性药物制剂，其适合于治疗用途以抑制或抵消有害的IL-12和/或IL-23活性，并且在加工和长期贮存过程中具有增强的稳定性，并且对于λ轻链断裂具有增强的抗性。发明概述
在第一个方面，本发明提供了包括抗体或其抗原结合部分的水性制剂，所述抗体包括 λ链，例如适合于治疗用途以抑制或抵消有害的IL-12和/或IL-23活性，并且与领域公认的制剂相比较具有改善性质的抗体。例如，本发明的制剂例如以液态或固态具有至少M个月的保存期限。在另一个实施方案中，本发明的制剂在制剂的至少5个冻/融循环后维持稳定性。在第二个方面，基于下述观察在组氨酸的存在下，由于在铰链区中的特异性切割，铁导致包含λ轻链的抗体断裂的增加，本发明提供了用于抑制包括λ轻链的免疫球蛋白断裂的组合物和方法。组氨酸单独在制剂中的存在对断裂没有作用。断裂水平就铁和组氨酸水平而言是剂量依赖性的。由铁和组氨酸引起的升高水平的断裂在包含κ轻链的抗体中未观察到。含λ链的抗体在这样的残基上切割，所述残基存在于铰链区中，在连接轻链和重链的二硫键附近。在第一个方面，本发明提供了包括包含至少部分λ轻链的分子和包括组氨酸的缓冲系统的稳定制剂，其中所述制剂基本上不含金属。在一个实施方案中，金属是狗2+或!^3+。在另一个实施方案中，金属是Cu2+或 Cul+。在另一个实施方案中，本发明进一步提供了在具有约5 -约7的pH的包括组氨酸的缓冲溶液中包括治疗有效量的包括λ轻链的分子的稳定制剂，其中金属以在组氨酸的存在下不导致λ轻链切割的浓度存在。在另一个实施方案中，本发明进一步提供了稳定制剂，其包括包含至少部分λ轻链的分子、包括咪唑的缓冲系统和金属，其中分子在金属的存在下在铰链区内不被切割。在一个实施方案中，制剂在实施选自下述的至少一种程序后是基本上不含金属的过滤、缓冲液更换、层析和树脂交换。在一个实施方案中，缓冲液更换包括用选自下述的缓冲液透析包括组氨酸的缓冲液、包括柠檬酸盐和磷酸盐的缓冲液和包括咪唑的缓冲液。在一个实施方案中，金属以下述浓度存在例如小于约5，060十亿分率(parts per billion)(ppb)、小于约 1，060 ppb、小于约 560 ppb、小于约 310 ppb、小于约 160 ppb、 小于约110 ppb和小于约70 ppb。在特定实施方案中，金属以小于约160 ppb的浓度存在， 且更优选以小于约70 ppb的浓度存在。在一个实施方案中，制剂包括包含λ轻链的分子和选自多元醇和表面活性剂的至少一种另外赋形剂。在一个实施方案中，制剂进一步包括稳定剂。在一个实施方案中，制剂进一步包括甘露糖醇、聚山梨醇酯80和甲硫氨酸。在一个实施方案中，制剂进一步包括柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。在一个实施方案中，PH是约5或更少。在另一个实施方案中，制剂包括(a) 1-10%甘露糖醇，(b)0. 001% -0. 聚山梨醇酯80，和(c)具有5 - 7 的pH，包括1-100 mM组氨酸和1-50 mM甲硫氨酸的缓冲系统。在另外一个实施方案中，制剂包括(a)2-6%甘露糖醇，(b)0. 005-0. 05%聚山梨醇酯80，和(c)具有5 - 7的pH，包括 5-50 mM组氨酸和5-20 mM甲硫氨酸的缓冲系统。在特定实施方案中，制剂包括(a)约4% 甘露糖醇，(b)约0.01%聚山梨醇酯80，和(c)具有约6的pH，包括约10 mM组氨酸和约10 mM甲硫氨酸的缓冲系统。在一个实施方案中，本发明提供了水性药物制剂，其包括(a) 1-250 mg/ml与 IL-12/IL-23的p40亚单位的表位结合的人抗体，(b) 1-10 %甘露糖醇，(c) 0. 001% -0. 聚山梨醇酯80，(d) 1-50 mM甲硫氨酸，和(e) 1-100 mM组氨酸，具有5 - 7的pH， 其中制剂基本上不含金属。在一个实施方案中，药物制剂不具有小于约2. 5 mS/com的导电性。在另一个实施方案中，药物制剂不是在美国专利号6，914，128的实施例9中使用的制剂。在一个实施方案中，分子是单克隆抗体或其抗原结合部分。在各种实施方案中，抗体或其抗原结合部分的浓度是例如约1 -约250 mg/ml、约40 -约200 mg/ml、或是约100
mg/mlο在一个实施方案中，抗体是能够与IL-12/IL-23的p40亚单位的表位结合的人抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，当P40亚单位与IL-12的p35亚单位结合时，人抗体或其抗原结合部分能够与P40亚单位的表位结合。在另一个实施方案中，当p40亚单位与IL-23的pl9亚单位结合时，人抗体或其抗原结合部分能够与p40亚单位的表位结合。 在另外一个实施方案中，当P40亚单位与IL-12的p35亚单位结合时，并且当p40亚单位还与IL-23的pl9亚单位结合时，人抗体或其抗原结合部分能够与p40亚单位的表位结合。在特定实施方案中，人抗体或其抗原结合部分结合选自Y61和J695的抗体与之结合的IL-12/ IL-23的p40亚单位的表位。在特定实施方案中，本发明再进一步提供了水性药物制剂，其包括(a)约100 mg/ ml与IL-12/IL-23的p40亚单位的表位结合的人抗体，(b)约4%甘露糖醇，(b)约0. 01% 聚山梨醇酯80，(c)约10 mM甲硫氨酸，和(d) 10 mM组氨酸，具有约6的pH。在一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分以1 χ 10, M或更少的Kd或以1 χ 10_3 S-1或更少的k。ff速率常数与IL-12/IL-23的p40亚单位解离，如通过表面等离振子共振测定的。在一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分中和IL-12/IL-23的p40亚单位的生物学活性。在一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分中和IL-12的生物学活性。在特定实施方案中，IL-12功能的中和通过人抗体或其片段与IL-12的p40亚单位的相互作用来达到。在特定实施方案中，人抗体或其抗原结合部分以1 χ 10_9 M或更少的IC5tl在体外PHA测定中抑制植物凝集素胚细胞增殖，或以1 χ ΙΟ"10 M或更少的IC5tl抑制人IFNy产生。在另一个实施方案中，人抗体或其结合部分中和IL-23的生物学活性。在特定实施方案中，IL-23功能的中和通过人抗体或其片段与IL-23的p40亚单位的相互作用来达到。在一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO=I的氨基酸序
14列的重链⑶R3和包括SEQ ID NO :2的氨基酸序列的轻链⑶R3。在另一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重链⑶R2和包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链CDR2。在另一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO 5的氨基酸序列的重链⑶Rl和包括SEQ ID NO 6的氨基酸序列的轻链⑶R1。在另外一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO :8的氨基酸序列的轻链可变区。在特定实施方案中，人抗体是抗体J695或其抗原结合部分。在一个实施方案中，制剂具有至少M个月的保存期限。在另一个实施方案中，制剂在制剂的至少5个冻/融循环后维持稳定性。在一个实施方案中，制剂进一步包括另外试剂，例如另外的治疗剂。在一个实施方案中，另外的治疗剂选自布地奈德，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢菌素，柳氮磺吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制剂，美沙拉秦，奥沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-I受体拮抗剂，抗IL-Ιβ单克隆抗体，抗IL-I受体抗体，抗IL-6单克隆抗体，抗IL-6受体抗体，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-U IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、 IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF 和 PDGF 的抗体或激动剂，针对 CD2、CD3、CD4、CD8、CD20、CD25、 ⑶观、⑶30、⑶40、⑶45、⑶69、⑶90或其配体的抗体，氨甲蝶呤，FK506，雷帕霉素，霉酚酸酯， 来氟洛米，NSAID，布洛芬，强的松龙，磷酸二酯酶抑制剂，SlPl激动剂，bcl-2抑制剂，腺苷激动剂，抗凝剂，补体抑制剂，肾上腺素能药，IRAK, NIK, IKK, p38，MAP激酶抑制剂，IL-1 β 转换酶抑制剂，TNFa转换酶抑制剂，T细胞发信号抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，血管紧张素转换酶抑制剂，可溶性细胞因子受体，可溶性Ρ55 TNF受体，可溶性p75 TNF受体，sIL-lRI， sIL-lRII, sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13 和 TGFβ。在另一个实施方案中，另外的治疗剂选自抗TNF抗体及其抗体片段、TNFR-Ig构建体、TACE抑制剂、PDE4抑制剂、皮质类固醇、布地奈德、地塞米松、柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸、奥沙拉嗪、IL-I β转换酶抑制剂、IL-lra、酪氨酸激酶抑制剂、6-巯基嘌呤和IL-11。在另外一个实施方案中，另外的治疗剂选自甲基强的松龙、环磷酰胺、4-氨基吡啶、替扎尼定、干扰素-β la、干扰素-β lb、共聚物1、高压氧、静脉内免疫球蛋白、克拉屈滨(clabribine)、TACE抑制剂、激酶抑制剂、sIL_13R、抗P7和ρ-选择蛋白糖蛋白配体 (PSGL)。在另一个实施方案中，本发明进一步提供了包括包含至少部分λ轻链的分子、包括组氨酸的缓冲系统和金属螯合剂的稳定制剂，其中分子在铰链区内不被切割，或在铰链区内的切割水平小于在不存在金属螯合剂的情况下观察到的切割水平。在一个实施方案中，金属是狗2+或!^3+。在另一个实施方案中，金属是Cu2+或 Cul+。在一个实施方案中，金属螯合剂选自柠檬酸盐，铁载体，杯芳烃(calixerenes)，氨基多羧酸，羟基氨基羧酸，N-取代的甘氨酸，2- (2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙磺酸(BES)， 二齿、三齿或六齿铁螯合剂，铜螯合剂，及其衍生物、类似物和组合。在优选实施方案中，金属螯合剂是去铁胺。在第二个方面，本发明提供了用于抑制或阻止在包含组氨酸的制剂中包括至少部分λ轻链的分子切割的方法，该方法包括抑制或阻止金属切割分子的能力的步骤。在一个实施方案中，抑制或阻止包括在制剂中包括至少一种金属螯合剂。在另一个实施方案中，抑制或阻止包括对分子实施选自下述的至少一种程序过滤(超滤和渗滤)、缓冲液更换、层析和树脂交换。在一个实施方案中，缓冲液更换包括用选自下述的缓冲液透析包括组氨酸的缓冲液、包括柠檬酸盐和磷酸盐的缓冲液和包括咪唑的缓冲液。在另外一个实施方案中，抑制或阻止包括通过改变λ轻链或重链中的至少一个氨基酸来抑制或阻止切割。在另外一个实施方案中，抑制或阻止包括通过这样改变λ链中的氨基酸序列从而使得氨基酸序列谷氨酸-半胱氨酸-丝氨酸被改变来抑制或阻止切割。 在另外一个实施方案中，抑制或阻止包括降低制剂的PH朝向更酸性水平，例如至ρΗ 5或更少。在另一个实施方案中，抑制或阻止包括在制剂中包括另外的缓冲液，例如柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。在一个实施方案中，制剂包括约1-100 mM组氨酸，例如约10 mM组氨酸。在一个实施方案中，制剂包括在25°C或40°C 6个月后不导致含λ链抗体切割的铁水平，例如铁以小于约160 ppb存在。在一个实施方案中，分子以约lmg/ml -约300 mg/ml的浓度范围存在，例如约 ang/ml、例如约 7mg/ml、例如约 100mg/ml。在一个实施方案中，分子是免疫球蛋白，例如单克隆抗体。在特定实施方案中，分子是抗IL-12/23抗体，例如J695。在另一个实施方案中，抗体是抗⑶_80或和抗IGF1，2抗体。在另一个实施方案中，分子包含选自下述的铰链区DVD-IgTM、Fab片段、F(ab’)2 片段、嵌合抗体、CDR嫁接的抗体、人源化抗体、人抗体、二硫键连接的Fv、单结构域抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体和双特异性抗体。在一个实施方案中，分子包括至少部分重链。在另一个实施方案中，部分重链包括氨基酸序列丝氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-赖氨酸(SCDK)，或不抑制抗体结合的至少一种修饰。在另一个实施方案中，切割在丝氨酸和半胱氨酸残基之间的铰链区中发生。在另外一个实施方案中，切割在半胱氨酸和天冬氨酸残基之间发生。在一个实施方案中，金属是!^2+或狗3+。在另外一个实施方案中，金属是Cu2+或 Cul+。在一个实施方案中，λ轻链包括氨基酸序列谷氨酸-半胱氨酸-丝氨酸 (ECS)，或不抑制抗体结合的至少一种修饰。在另一个实施方案中，切割在λ链的铰链区中发生。在另一个实施方案中，切割在谷氨酸和半胱氨酸残基之间发生。在另外一个实施方案中，切割在丝氨酸和半胱氨酸残基之间发生。在一个实施方案中，切割在约2°C -约25°C的温度发生，例如约2°C -约8°C。在一个实施方案中，切割在PH约4 -约8发生，例如约ρΗ 5 -约6。在一个实施方案中，至少一种金属螯合剂是选自下述的铁载体产气菌素、农杆菌载铁素、固氮菌素(azotcAactin)、kicillibactin、N- (5-C3-L (5氨基戊基)羟基氨基甲酰基)_丙酰胺基)戊基)-3 (5- (N-羟基乙酰氨基)-戊基)氨基甲酰基)-丙异羟肟酸 (去铁敏、去铁胺或DFO或DEF)、去铁硫辛(desferrithiocin)、肠杆菌素、erythrobactin、 铁色素、铁草铵B、铁草铵Ε、fluviabactin、镰刀霉氨酸C、分枝菌素、副球菌素、假单胞菌
16素、弧菌载铁素、创伤弧菌载铁素(vulnikictin)、耶尔森菌素、ornibactin，及其衍生物、类 1 以物禾口组合(Roosenberg，J. Μ.等人(2000) Studies and Syntheses of Siderophores, Microbial Iron Chelators,and Analogs as Potential Drug Delivery Agents. Current Medicinal Chem. 7:159-197)。在优选实施方案中，金属螯合剂是去铁胺。在另一个实施方案中，至少一种金属螯合剂是柠檬酸盐或磷酸盐。在另一个实施方案中，至少一种金属螯合剂是选自下述的氨基多羧酸乙二胺四乙酸(EDTA)、氮川乙酸(NTA)、反式环己二胺四乙酸(DCTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、 N-2-乙酰氨基-2-亚氨基二乙酸(ADA)、天冬氨酸、双(氨乙基)乙二醇醚N，N，N’ N’ -四乙酸(EGTA)、谷氨酸和N，N，-双(2-羟苄基)乙二胺-N，N，- 二乙酸(HBED)，及其衍生物、类似物和组合。在另一个实施方案中，至少一种金属螯合剂是选自下述的羟基氨基羧酸N-羟乙基亚氨基二乙酸(HIMDA)、队^双羟乙基甘氨酸(1^(^116)、和^ (三羟甲基甲基)甘氨酸 (tricine),及其衍生物、类似物和组合。在另一个实施方案中，至少一种金属螯合剂是N-取代的甘氨酸，或其衍生物、类似物或组合。例如，N-取代的甘氨酸选自甘氨酰甘氨酸，及其衍生物、类似物和组合。在另一个实施方案中，至少一种金属螯合剂是2- (2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙磺酸(BES )，或其衍生物、类似物和组合。在另一个实施方案中，至少一种金属螯合剂是杯芳烃，例如基于酚和醛的羟烷基化产物的大环或环状寡聚物，或其衍生物、类似物或组合(Gutsche，C. D. (1989) Calixarenes. Cambridge :Royal Society of Chemistry ;Dharam,P 禾口 Harjit,S. (2006) Syntheses, Structures and Interactions of Heterocalixarenes, Arcivoc.)。在另一个实施方案中，至少一种金属螯合剂包括DTPA和DEF的组合。在另一个实施方案中，至少一种金属螯合剂包括EDTA、EGTA和DEF的组合。在另一个实施方案中，至少一种金属螯合剂是羟基吡啶-衍生物、腙-衍生物、和羟苯基-衍生物或烟酰基-衍生物，例如1，2- 二甲基-3-羟基吡啶-4-酮(去铁酮(Deferiprone)、DFP 或 Ferriprox) ；2-脱氧-2- (N-氨基甲酰基甲基-[N，-2'-甲基-3'-羟基吡啶-4'-酮])-D-吡喃葡萄糖(Feralex-G)、吡哆醛异烟酰腙(PIH) ；4, 5- 二氢-2-(2, 4- 二羟苯基)-4-甲基噻唑 4-羧酸(6156-252)、4-[3，5-双(2-羟苯基)-[1，2，4] 三唑-1-基]苯甲酸(ICL-670) ；N，N，-双(ο-羟苄基)乙二胺-N，N，- 二乙酸(HBED)、 5-氯-7-碘代-喹啉-8-醇(氯碘羟喹)，或其衍生物、类似物或组合。在另一个实施方案中，至少一种金属螯合剂是选自下述的铜螯合剂三亚乙基四胺(曲恩汀)、四亚乙基五胺、D-青霉胺、乙二胺、双吡啶、菲咯啉(phenantroline)、红菲绕啉、新亚铜试剂、浴铜灵磺酸盐、cuprizone、顺式，顺式-1，3，5，-三氨基环己烷(TACH)， tachpyr，及其衍生物、类似物和组合。在另一个实施方案中，至少一种金属螯合剂可以选自本领域所述试剂的螯合剂、 类似物和衍生物，例如在下述中描述的那种“Iron Chelators and Therapeutic Uses，，， 通过 Bergeron, R.等人’ in Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 第 6 版，第 3 卷Cardiovascular Agents and Endocrines,由 Abraham, D. J 编辑，John Wiley & Sons，he. 2003。另外，螯合剂可以选自在下述中所述试剂的螯合剂、类似物和衍生物美国专利号6，083，966、美国专利号6，521，652、美国专利号6，525，080、美国专利号 6，559，315、PCT/US2004/029318, PCT/US2003/022012、TO/2002/043722 和 WO 2004/007520。在另一个实施方案中，制剂包括选自下述的至少一种另外赋形剂氨基酸、糖、糖醇、缓冲剂、盐和表面活性剂。在另一个实施方案中，制剂包括选自下述的至少一种另外赋形剂约1 -约60 mg/ml甘露糖醇、约1 -约50 mM甲硫氨酸、约0. 001 % -约0. 5 %(w/v)聚山梨醇酯80、 约 0.001% -约 (w/v)泊洛沙姆(polyoxamer) 188、约 1 -约 150 mM 氯化钠、约 1 -约30 mM乙酸盐、约1 -约30 mM柠檬酸盐、约1 -约30 mM磷酸盐和约1 -约30 mM精氨酸。在另一个实施方案中，断裂的抑制或阻止包括通过添加酸、滴定或透析或本领域已知减少PH的各种过滤过程改变制剂的pH朝向更酸性水平，所述各种过滤过程例如但不限于透析或切向流过滤。在另一个实施方案中，断裂的抑制或阻止包括使用特异性缓冲剂例如磷酸盐或柠
檬酸盐。在第二个方面的另一个实施方案中，本发明提供了用于检测在包含组氨酸的制剂中包括至少部分λ轻链的分子切割的方法，该方法包括在制剂中包括至少一种金属螯合剂和就切割分析至少部分λ轻链的步骤。附图简述
当连同附图一起阅读时，本发明的前述和其他目的、特征和优点以及本发明自身根据优选实施方案的下述描述将得到更全面地理解，其中 图1显示抗体分子的铰链区。图2显示在尺寸排阻层析(SEC)后，J695的不同种类的分级分离(级分1_4)。图3显示通过SDS-PAGE分析的来自图2的SEC的不同级分的评价，显示在级分3 中的不可还原的(NR)种类，重链(HC)，轻链(LC)和HC的片段(HC-Fc)，和在级分4中的LC 和 HC-Fab。图4显示在去糖基化后来自图2的级分3通过LC/ESI-MS的分析，显示在铰链区中在HC上的多个切割位点。峰已从(a)到(e)进行标记，并且峰和切割位点的鉴定在表1 中提供。图5显示来自图2的级分4通过MS的分析，显示这个级分中的相应Fab片段。峰从(f )到(j )进行标记，并且峰和切割位点的鉴定在表1中提供。图6显示来自图2的级分4通过MS的分析，显示来自氨基酸残基1_215的游离LC 和来自氨基酸残基1-217的游离HC。图7显示来自图2的级分3通过CE-SDS的分析，显示片段2 (Fab+Fc)，而级分4 包含Fab和LC和HC片段。完整抗体中的片段2与其他峰良好分辨。图8显示使用10，000 MWCO膜包含500 ppb铁的J695 (Mab-批次1)针对柠檬酸缓冲液的透析。图9显示掺料到J695的正常对照批次内的不同水平金属盐(2. 5,10和50 ppm), 在40°C温育1个月，并且通过CE-SDS分析。
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图10显示在包含500 ppb铁的J695与1 mM去铁胺在40°C温育1个月后，通过 CE-SDS的分析。图11显示在针对水透析，并且与组氨酸、铁或铁和组氨酸两者温育后，不含铁的 J695的正常批次。图12显示包含500 ppb铁的应激J695针对正常应激批次的来自图2的片段2通过ESI/LC-MS的比较。图13显示相应Fab种类的分析，揭示当包含铁的应激J695与正常应激批次相比较时，切割位点是可比较的。图14显示LC和HC片段的分析，揭示更高水平的重(1-217)和轻链(1-215)片段。图15显示铁诱导的包含λ或Κ轻链的IgG分子断裂的研究。图16显示在λ或Κ轻链上的残基序列和被切割的键。发明详述 I.定义
术语“抗体”泛指任何免疫球蛋白(Ig)分子，其包括通过二硫键互连的4条多肽链一一 2条重(H)链和2条轻(L)链，或其任何功能片段、突变体、变体或衍生物，其保留Ig分子的基本表位结合特征。此种突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的，其非限制性实施方案在本文中讨论。在全长抗体中，每条重链包括重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。 重链恒定区包括3个结构域一一 CHI、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(本文缩写为 LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域一一 CL。VH和VL区可以进一步再分成称为互补性决定区(CDR)的高变区，由称为构架区(FR)的更保守区域点缀。每个VH和 VL由3个⑶Rs和4个FRs组成，从氨基末端到羧基末端以下述次序排列FR1、⑶Rl、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以具有任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和 IgY)、类别(例如 IgG 1、IgG2、IgG 3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亚类。术语“Fe区”指免疫球蛋白重链的C末端区域，其可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化生成。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区一般包括2个恒定结构域一一 CH2结构域和CH3结构域，且任选包括CH4结构域。替换Fc部分中的氨基酸残基以改变抗体效应子功能是本领域已知的(美国专利号5，648，260和5，624，821)。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)、 吞噬作用、依赖补体的细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。 特定人IgG同种型，特别是IgGl和1863，经由分别与？(^1^和补体Clq结合介导ADCC 和⑶C。免疫球蛋白的2条等同重链的二聚化通过CH3结构域的二聚化介导，并且通过铰链区内的二硫键稳定(Huber 等人(1976) Nature 264:415-20 ；Thies 等人(1999) J. Mol. Biol.四3:67-79)。在铰链区内半胱氨酸残基的突变以阻止重链-重链二硫键使CH3结构域的二聚化去稳定。负责CH3 二聚化的残基已得到鉴定(Dair Acqua (1998) Biochem. 37:9266-73).因此，可能生成单价半_Ig。单价半Ig分子已在自然界中对于IgG和IgA亚类发现(SeIigman (1978) Ann. Immunol. 1 855-70 ;Biewenga 等人(1983) Clin. Exp. Immunol. 51:395-400)。半Ig分子可以在组织穿透中具有特定优点，这是由于其比常规抗体的那种更小的尺寸。在一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在本发明的结合蛋白的恒定区例如Fc区中被替换，从而使得重链的二聚化被破坏，导致半Ig分子。轻链可以是κ 或λ类型。术语抗体的“抗原结合部分”或“抗体部分”包括保留与抗原(例如hIL-12和/或 hIL-23)特异性结合的能力的抗体片段。此种抗体片段还可以是双特异性、双重特异性或多特异性的，例如它与2种或更多种不同抗原特异性结合。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。在术语抗体的“抗原结合部分”内包括的结合片段例子包括 (i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii) F(ab’)2片段，包括在铰链区通过二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(ν)由VH结构域组成的dAb片段 (Ward等人，(.19mNature 341 544-546)；和(vi )分离的互补性决定区(CDR)。此外， 尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组法通过合成接头进行连接，所述合成接头使得它们能够制备为单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv (scFv)；参见例如，Bird等人(1988)242:423-426 ； 和 Huston 等人(1988Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。此种单链抗体也意欲包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。还包含其他形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并且产生2个抗原结合部位(参见例如，Holliger，P.等人(1993)/￥oc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ;Poljak，R. J.等人(1994) Sirwciare 2:1121-1123)。此种抗原结合部分是本领域已知的(Kontermann和Dubel编辑(2001) Antibody EnRineering, Springer-Verlag, New York.第790页。此外，单链抗体还包括包含一对串联Fv区段 (VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其连同互补轻链多肽构成一对抗原结合区(Zapata等人 (1995) Protein Eng. 8 (10) 1057-1062 ；美国专利号 5，641，870)。再进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大免疫粘附分子的部分。此种免疫粘附分子的例子包括使用链霉抗生物素蛋白核心区，以制备四聚scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.等人
Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 )，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和 C末端多组氨酸标签，以制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.等人(1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)。抗体部分例如Fab和F(ab’)2片段可以使用常规技术由完整抗体制备，例如完整抗体分别地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得，如本文描述的。优选的抗原结合部分是完整结构域或完整结构域对。术语“多价结合蛋白”指包括2个或更多个抗原结合部位的结合蛋白。在一个实施方案中，多价结合蛋白工程改造为具有3个或更多个抗原结合部位，并且一般不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”还指能够结合2种或更多种相关或无关靶的结合蛋白。双重可变结构域(DVD-Ig )结合蛋白包括2个或更多个抗原结合部位，并且是四价或多价结合蛋白。DVD-Ig s可以是单特异性的，即能够结合一种抗原，或多特异性的，即能够结合2种或更多种抗原。包括2条重链DVD-Ig 多肽和2条轻链DVD-Ig 多肽的DVD-Ig 结合蛋白被称为DVD-Ig 。DVD-Ig 的每一半包括重链DVD-Ig 多肽和轻链DVD-Ig 多肽，和2个抗原结合部位。每个结合部位包括重链可变结构域和轻链可变结构域，具有涉及抗原结合的总共6个CDRs/抗原结合部位。术语“双特异性抗体”指通过下述生成的全长抗体四源杂交瘤(quadroma)技术 (Milstein，C.和 Α. C. Cuello (1983) Nature 305 (5934) 537-40)，2 种不同单克隆抗体的化学缀合(Staerz，U. D.等人(1985)Nature 314 (6012)628-31 )，或在Fc区中引入突变的“结进孔(knob-into-hole)” 或类似方法(Holliger，P.等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-8. 18)，从而导致多个不同的免疫球蛋白种类，其中仅一个是功能性双特异性抗体。通过分子功能，双特异性抗体在其2个结合臂之一(一对HC/LC)上结合一种抗原(或表位)，并且在其第二个臂(不同对的HC/LC)上结合不同抗原(或表位)。通过这个定义，双特异性抗体具有2个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列中)，并且对于它与之结合的每种抗原是单价的。术语“双重特异性抗体”指这样的全长抗体，其在其2个结合臂的每一个(一对HC/ LC)中可以结合2种不同抗原(或表位)(PCT公开号WO 02/02773)。因此，双重特异性结合蛋白具有2个等同的抗原结合臂，具有等同特异性和等同CDR序列，并且对于它与之结合的每种抗原是二价的。免疫球蛋白恒定结构域指重或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的。术语“单克隆抗体”或“mAb”指得自基本上同质抗体群体的抗体，即构成群体的个别抗体是等同的，除可能少量存在的可能天然发生的突变外。单克隆抗体是高度特异性的， 针对单一抗原。此外，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比，每种mAb针对在抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆的”不应解释为要求通过任何特定方法的抗体产生。在一个实施方案中，单克隆抗体通过杂交瘤技术产生。术语“嵌合抗体”指这样的抗体，其包括来自一个物种的重和轻链可变区序列和来自另一个物种的恒定区序列，例如具有与人恒定区连接的鼠重和轻链可变区的抗体。术语“⑶R嫁接的抗体”指这样的抗体，其包括来自一个物种的重和轻链可变区序列，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列由另一个物种的CDR序列替换，例如具有鼠重和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠⑶Rs (例如⑶R3)已由人⑶R序列替换。术语“人抗体”包括具有与人种系免疫球蛋白序列对应的可变和恒定区的抗体，如由 Kabat 等人描述的(参见 Kabat 等人(1991，&卯日/^然 of Proteins of Immunological Interest，第 5 版’ U. S. Department of Health and Human Services, NIH
发明者肯托尔 A., H. 拉兹杰夫斯基 C., R. 科雷亚 I., W. 瓦纳 N., 弗劳恩霍菲 W. 申请人:雅培制药有限公司