亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：中药注射剂微量蛋白检测方法
技术领域：
本发明涉及中药注射剂杂质检测领域，用于中药注射剂蛋白质类杂质，以控制中 药注射剂的质量。
背景技术：
中药注射剂最早产生在1946年，由钱信忠等学者开创。在中国医药界，中药注射 剂已经广泛应用于临床。2005年版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)一部就收 录有灯盏细辛、清开灵、止喘灵及双黄连等单方和复方注射剂。中药注射剂在推进中药剂型 发展，拓展中药的应用范围，服务广大人民健康等方面的确功不可没。安全、有效、质量可控 依然是中药注射剂的基本质量要求。从技术上来讲，业界大体上已经解决了中药注射剂的 有效性问题，对于安全性依然是业界难题。然而，随着中药注射剂的广泛应用于临床，其不良反应日益暴露，特别是致死性不 良反应也屡有报道。根据目前公开的不良反应资料，中药注射剂的不良反应可以累及各个 系统和脏器，甚至导致死亡。很多中药注射剂的不良反应与原有的药理作用无关，根据多方 面分析，这些不良反应主要属于过敏反应，即病理性免疫反应，包括I、II、III和IV型病理 性免疫反应。因此减少中药注射剂中的过敏性物质是提高中药注射剂安全性的关键策略之
O中药注射剂大多为植物提取物。作为生物提取物，在原料提取过程中会带来多种 植物大分子杂质，如蛋白质、核酸等。尽管植物中的蛋白质含量较低，通过有机溶剂提取的 量较少，但微量的蛋白仍足以导致诱发过敏反应。与人相比，植物蛋白与人的同源性差异 大，因此常具有很强的抗原性。现行药典(2010年版)控制中药注射剂蛋白含量的方法沿 用了以前的磺基水杨酸比浊法，控制的蛋白质限量约为37 110μ g/ml左右，低于此限量 的蛋白药典方法很难检出。因此，蛋白含量低于37 μ g/ml的中药注射剂将被视为“合格”。 而且中药注射剂中的酸性成分会干扰磺基水杨酸法检测蛋白的结果，这导致磺基水杨酸法 应用范围受限。而其他未被药典采用的蛋白质检测方法如，凯氏(Kjeldahl)定氮法、双缩 脲法、Folin-酚试剂法、直接考马斯亮兰法(Bradford法)、紫外吸收法以及BCA法等，却因 为中药注射剂其他成分或本身颜色带来严重干扰，要么特异性较差，要么灵敏度较差，不适 合用于中药注射剂的蛋白质限量检测。为了提高安全性，有必要进一步控制中药注射剂中 的蛋白含量，因此建立特异性高并且灵敏的中药注射剂蛋白质检测方法很有必要。由于中药注射剂都有较深的颜色，成分多样，而且蛋白质是一类物质，因此很难用 目前单一方法同时提高检测的灵敏性和特异性。因此本发明是针对中药注射剂的特点而建 立的，对蛋白质检测具有灵敏度高、抗干扰能力强的特点。

发明内容
本发明利用某些膜能将蛋白质特异性高强度吸附的特点以及考马斯亮蓝对蛋白 质特异性显色的特点建立本方法，以提高中药注射剂微量蛋白检测的灵敏性和特异性。本方法包括以下三个步骤1、先将中药注射剂样品点到蛋白特异性吸附膜上；2、用含有有机溶剂的溶液洗涤点样膜，以洗去中药注射剂斑点的本色；3、将点样膜进行考马斯亮蓝显色。在以上步骤1中，吸附蛋白质的膜包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜 (Polyvinylidene fluoride,聚偏二氟乙烯膜)。 在以上步骤2中，采用的有机溶液浓度为0-100 %，有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、氯仿。采用有机溶液洗涤的量和洗涤的次数不限，以去除中药注射剂本色 为度。如果中药注射剂点样后几乎无色，本步骤可以跳过直接进入步骤3。步骤3进行考马斯亮蓝显色时，考马斯亮蓝的浓度不限。可以直接染色；也可以染 色后进行脱色处理，以降低膜的背景。含有一定蛋白质浓度的中药注射剂会显示出稳定的
' τπ. ο本方法实施的效果是，检测的灵敏性和特异性高，抗干扰能力强。


图1为建立PVDF膜吸附染色检测蛋白方法，确定本发明检测限的染色结果图a 为点样后风干拍片的结果，b为甲醇洗涤后风干拍片的结果，c为染考马斯亮蓝并脱色后风 干拍片的结果，a、b、c中的A组样品来自标准BSA溶液，用PBS溶液配制，B组为用丹参注 射液配制的BSA样品，从左至右浓度依次均为9mg/ml、3mg/ml、lmg/ml、0. 33mg/ml、0. lmg/ ml>37 μ g/ml>12 μ g/ml、4y g/ml、l. 3 μ g/ml>0 μ g/ml,点样量为 1 μ 1。图2为本发明的回收实验染色结果图a为点样后拍片结果；b为甲醇洗涤后拍片 结果；c为染色脱色后的结果，A组样品来自标准蛋白溶液(用PBS配制)，C组样品为用 双黄连注射液液溶解、稀释的蛋白BSA溶液。两组从左至右蛋白浓度均为9mg/ml、3mg/ml、 lmg/ml、0. 33mg/ml、0. lmg/ml、37μ g/ml、12 μ g/ml、4μ g/ml、1. 3 μ g/ml、0μ g/ml，点样量 1μ 1 ；图3为本发明与磺基水杨酸比浊法结果比较染色图Β组为标准蛋白样品对照， H组为磺基水杨酸法沉淀后的蛋白样品，两组从左至右起始蛋白浓度均为9mg/ml、3mg/ml、 lmg/ml、0. 33mg/ml、0. lmg/ml>37 μ g/ml、12 μ g/ml>4 μ g/ml、l. 3 μ g/ml>0 μ g/ml。点样量 1μ 1 ；图4为本发明的抗干扰实验染色图a为点样后的拍片结果；b为甲醇洗涤后的拍 片结果；图c为染色脱色后的结果，A5样品为标准BSA溶液，浓度为37yg/ml，点0-3为鞣质 样品浓度依次为 109. 2mg/ml、36. 4mg/ml、12. lmg/ml、4mg/ml，点 4 为 Omg/ml，点样量 1 μ 1 ；图5为本发明染色10天后的稳定性考察图a为8号膜染色原图结果，b为8号膜 室温下放置10天后的染色变化的结果；图6为本发明染色30天及60天后的稳定性考察图a为10号膜原染色结果；b为 10号膜染色室温下放置30天后的结果，c为10号膜染色室温下放置60天后的结果；图7为模拟中药注射剂生产过程，验证其蛋白质残存的检测结果点1-7分别为蛋 白质80%乙醇上清液浓缩1、3、9、27、81、243、729倍，点B5处BSA浓度为37 μ g/ml，点样量 1μ 1 ；
图8为中药注射剂成品微量蛋白质检查结果a为点样后拍片结果，b为甲醇洗涤 后的拍片结果，c为染色脱色后的拍片结果，点1样品为标准BSA样品，浓度为37 μ g/ml， “2”列为丹参注射剂，“3”列为灯盏细心注射剂，“4”列为双黄连注射剂，“5”列为清开灵注 射剂，从上往下“1”排为1倍浓度；“2”排为2倍浓度、“5”排为5倍浓度、“10”排为10倍 浓度，点样量1 μ 1。
具体实施例方式实施示例1
建立PVDF膜吸附染色检测蛋白方法，确定本发明的检测限取10 支试管管编号 0-9，用 PBS(KC1，0. 2g ;ΚΗ2Ρ04，0· 2g ;NaCl，8. Og ； Na2HPO4 ·12Η20，2· 08g ；加三蒸水到1000ml,pH 7. 2)和BSA(牛血清白蛋白)配制出浓度为 9mg/ml的BSA溶液于0号管中，在1-9号管中各加入200 μ 1 PBS，0号管中取100 μ 1溶液 至1号管中混勻，再从1号管中取100 μ 1溶液至2号管中混勻，依此类推至8号管，即得到 浓度梯度为3倍的一组标准溶液，9号管为PBS空白对照。将PVDF膜做好标记用甲醇浸润，0-9号溶液依次在PVDF膜上点样1 μ 1，凝胶成 像系统下拍照，之后用0. 25%考马斯亮蓝染色液染色5min，在转移脱色摇床上用脱色液甲 醇-水-冰醋酸(4.5 4.5 DlOml洗脱3次，每次5min，脱去背景色，将膜拍照，观察斑 点颜色强弱。结果如图1所示。从图1可见，PBS配制的BSA无色，风干后不留痕迹，而丹参注射液有颜色(棕褐 色)，点样风干后可见斑点。但经甲醇洗涤后再风干拍片，丹参注射液的颜色被洗去，各点无 色。经染色后可见部分斑点。A组和B组均可见第6个斑点(B组的第6个斑点比A组的略 深)。可见，本发明的检测限量约为12yg/ml(12ng)0实施示例2本发明的回收实验用丹参注射液代替实施示例1中的PBS，制备另一组BSA溶液，与标准溶液点在同 一张PVDF膜上，经0. 25%考马斯亮蓝染色、甲醇冰醋酸溶液脱色处理结果见图IB组斑点。 显色限量与A组(PBS)相似，检测限量也为12 μ g/ml (12ng)。依照同样的方法用双黄连注射液做回收实验，结果如图2所示。从图2中得知，双黄连注射液的颜色较深，通过甲醇洗涤后仍有部分点的颜色保 留在PVDF膜上。但不加蛋白的点(C组第9个斑点)仍为无色，其中含蛋白较低点(第6 个点以后)也为无色。通过比较对应的斑点强弱，两次回收实验结果均表明膜吸附染色法检测微量蛋白 的回收率较高，中药注射剂有色物质的存在不会降低本方法蛋白质检测的灵敏度，因而具 有较强的抗干扰能力。实施示例3本发明与磺基水杨酸比浊法比较取19支试管，编号为0、B1-B9、H1-H9。称取18mg BSA至于0号管中，加Iml PBS 溶解。按照实施示例1中所述制备方法制得相同的两组梯度溶液B9和H9试管为PBS空白 对照，之后B1-B9每支试管各加入对等体积的PBS，H1-H9每支试管各加入对等体积的30%磺基水杨酸溶液混合，10000 X g离心6min，取上清液在同一张PVDF膜上点样，经0. 25%考 马斯亮蓝染色、甲醇冰醋酸溶液脱色处理，拍照结果见图3。由图3可见，按照药典方法用30%磺基水杨酸沉淀蛋白质后，上清液中依然能够 检测到蛋白质，而且点H2处蛋白量按照B5处蛋白量估算可知磺基水杨酸反应后中蛋白质 浓度高于37yg/ml。另取一组编号1-7的具塞比色管中制备浓度比为3的一组BSA梯度溶液各5ml， 浓度依次为 2mg/ml、0. 66mg/ml、0. 22mg/ml、73 μ g/ml、24 μ g/ml、8 μ g/ml、2. 6 μ g/ml，按照 药典方法加入等体积的30%磺基水杨酸溶液，此时相当于BSA浓度为lmg/ml、0. 33mg/ml、 0. llmg/ml、37l·! g/ml、12l·! g/ml、4l·! g/ml、l. 3μ g/ml，在黑色背景下观察沉淀和浑浊情况，
结果见表1。 表1标准蛋白溶液磺基水杨酸发沉淀比浊 注+，可见沉淀；_，未见沉淀；+/_，不好确定。*药典采用的观察体积。 目前药典采用的比浊体积为2ml，由表1可知，药典方法对蛋白质的检测限为37 111 μ g/ml，尽管增大体积会提高检测灵敏度。对照实施示例1中本发明的检测限为12 μ g/ ml的结果，因此，本发明的灵敏度高于药典所用的磺基水杨酸法。实施示例4本发明的抗干扰试验在蛋白质检测时，鞣质类是中药注射剂的主要干扰成分，可呈黄、棕、褐、红等颜 色。现以缩合鞣质为例考察本发明的抗干扰能力。取5支试管，编号0、1、2、3、4、5，1、2、3号管各加入100μ 1蒸馏水，0号管中加入已
制备好的缩合鞣质试液(棕黄色，由焦性没食子酸制备，0. 1092g/ml)，从0号管中取50 μ 1 试液到1号管中混勻，再从1号管中取50 μ 1到2号管中混勻，再从2号管中取50 μ 1到3 号管中混勻，4号管为PBS空白对照，5号管为BSA加足量鞣质试液离心后所得的上清液(棕 褐色)。将这组试管样品点在同一张PVDF膜上，经0. 25%考马斯亮蓝染色、甲醇冰醋酸溶 液脱色处理，结果见图4。从结果可以看出，中药注射剂中的常见成分缩合鞣质点样后经甲醇洗涤后，未见 颜色，用本发明染色后，无蛋白点仍不显色。说明本发明有较强的抗干扰能力。点5也表明 鞣质可以和一定量的蛋白质共存。实施示例5本发明的显色稳定性试验染好色的PVDF膜室温下放置10天后重拍，结果见图5。
将另一张号PVDF膜室温下放置30天后、60天后重拍，结果见图6。对比结果可以说明膜吸附染色法检测蛋白质准确可靠，PVDF膜对蛋白质亲和力强，CBB对蛋白质显色稳定性好，且可以长时间存放而不褪色。实施示例6模拟中药注射剂生产过程，验证其蛋白质残存配制80%乙醇5ml，加入足量BSA充分振摇混合(IOmin以上)，10000Xg下离 心5min，取不同体积的上清液于7支EP管中，体积依次为1 μ 1、3 μ 1、9 μ 1、27 μ 1、81 μ 1、 243μ 1、729μ 1，试管依次编号为1、2、3、4、5、6、7。将这7支试管置于通风柜中风干。风干 后各加入Iyl PBS充分振摇，离心获得点样样品。另以37 μ g/ml的标准BSA溶液为对照， 点样后经0. 25%考马斯亮蓝染色、甲醇冰醋酸溶液脱色处理，结果见图7。图7中点5可见明显斑点，点4可见可辨认的斑点。80 %乙醇是制剂工业常用的 蛋白质沉淀浓度，由此推测，在中药注射剂生产过程中传统的“水煮醇沉”或“醇提水沉”工 艺并不能将蛋白质完全除去，原始蛋白质浓度可能高达ι μ g/ml。而1 μ g/ml的蛋白是不能 被磺基水杨酸法检出的，仍可能作为蛋白检测“合格”保留在中药注射剂成品中。实施示例7中药注射剂成品微量蛋白质检查从市场上买来清开灵注射剂、丹参注射剂、双黄连注射剂和灯盏细辛注射剂。将清 开灵注射剂、丹参注射剂、双黄连注射剂和灯盏细辛注射剂于冷冻管中冷冻干燥，再用PBS 制备相当于原溶液浓度1倍、2倍、5倍、10倍的溶液样品，将不同浓度的中药注射剂样品点 在同一张PVDF膜上，经0. 25%考马斯亮蓝染色、甲醇冰醋酸溶液脱色处理，结果见图8。从图8可见，丹参和灯盏细辛注射液在浓缩10倍内不易检测出蛋白存在，而清开 灵浓缩5倍即可检出蛋白，双黄连注射液浓缩10倍可见蛋白斑点。这与这四种中药注射剂 过敏反应的临床报道大体一致。
权利要求
一种检测中药注射剂微量蛋白质的方法，其特征在与按以下步骤进行1)先将中药注射剂样品点到蛋白特异性吸附膜上；2)用含有有机溶剂的溶液洗涤点样膜，以洗去中药注射剂斑点的本色；3)将点样膜进行考马斯亮蓝染色。
2.根据权利要求1所描述的中药注射剂微量蛋白质检测方法，其特征在于用于吸附 蛋白质的膜包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)，点样量(体 积)1 10 μ 1。
3.根据权利要求1所描述的中药注射剂微量蛋白质检测方法，其特征在于洗涤去除中 药注射剂点样本色所用的有机溶液浓度为0-100%，有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙 腈、丙酮、氯仿，以及它们两种或两种以上任意比例的混合；采用有机溶液洗涤的量和洗涤 的次数不限，以去除中药注射剂点样斑点的本色为度。
4.根据权利要求1所描述的中药注射剂微量蛋白质检测方法，其特征是染色所用的考 马斯亮蓝浓度不限；既可以对经过步骤2处理后的点样膜直接染色，也可以染色后再进行 脱色处理，以进一步降低染色背景。
全文摘要
一种能够检测中药注射剂微量蛋白的检测方法，用于检测中药注射剂蛋白质类杂质，以控制中药注射剂的质量。其特征在于按以下步骤进行1)先将中药注射剂样品点到蛋白质特异性吸附膜上；2)用含有有机溶剂的溶液洗涤点样膜，以洗去中药注射剂斑点的本色；3)随后将点样膜进行考马斯亮蓝染色。如果中药注射剂所含的蛋白质不低于12μg/ml，就会在膜上显示稳定可辨的蓝色。本发明的检测灵敏度高于磺基水杨酸沉淀法，同时较强的抗干扰能力，适用于所有中药注射剂微量蛋白质的检测。
文档编号G01N33/68GK101865926SQ20101019969
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者卢国勋, 李奇峰, 段为钢 申请人:云南中医学院