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专利名称：：用于酶免疫测定检测尿中的αGST的稳定化介质的制作方法
技术领域：
：本发明涉及尿中的α谷光甘肽S转移酶(αGST)的稳定化介质及其在酶免疫测定检测αGST中的应用。
背景技术：
：发现谷光甘肽转移酶类是在人体组织中的含量变化极大的酶类。该酶形成三个主要的类别，被定名为α、π和μ。酶的这三个类别在其性质方面可明确区分。αGST是在肾的近肾小管区域被发现的，并被释放于正常个体的尿中，这一点已被酶免疫测定和蛋白质印迹分析所证实(Campbell，J.A.H.等(1991)Cancer(癌症)(Philadelphia)，67，1608-1613)。使近肾小管发生损伤的任何事件均可引起αGST释放到尿中，从而导致其在正常尿水平中含量的增加。因此，尿αGST水平的升高可以表征近肾小管的损伤(Sherman，R.A.等(1985)UremiaInvestigation(尿毒症研究)，8，111-115)。最近的研究工作已经表明诱导Wistar大鼠近肾小管损伤的顺铂与尿中的αGST活性水平升高和血清肌酸酐清除的降低有关(Stojanov，M.等(1994)Clin.Chem.(临床化学)，14，1125)，以及急性肾小管坏死和人肾移植梗死导致α和πGST水平的快速升高(Sundberg，A.G.M.等(1994)Nephron(肾单位)67，308-316)。能将尿作为检测和测定表征肾、特别是肾的部分区域损伤的酶的体液样品是有益处的，特别是因为不需要对身体样品的侵害性采集。总的说来，人们希望估测病情严重的患者的αGST并且极其希望使任何不必要的创伤最小。传统上，放射免疫测定已用来估测尿中的αGST，该方法伴有使用放射标记的物质的短处。经常是在样品采集后的相当长的一段时间(如数天)后，不可能进行尿αGST的必要估测。因此，常常必需使尿样在极低的温度(通常是-20℃)下贮存。然而，发现在这样极低的温度下贮存的尿样导致尿αGST免疫活性的损失，并因此而使任何免疫测定的敏感性差。该免疫活性的的损失最有可能起因于冻融变性。因此，需要一种介质，该介质使人们可在-20℃的温度下贮存尿中的αGST，在用于检测αGST的免疫测定中，不会使αGST免疫反应活性有任何损失。本发明的公开因此，本发明提供用于尿中的αGST的稳定化介质，该介质含有稳定量的非酶蛋白质、螯合剂和缓冲液，以使该介质的pH在7.0-7.5的范围内，并且该介质可有效地防止αGST免疫活性的损失。本发明的稳定化介质可用于在-20℃的温度下贮存尿样，而不会使免疫活性有任何损失。然而，除此之外，还发现，在直至测定前2小时之内，将本发明的稳定化介质加入到于2-8℃临时贮存的新鲜尿样中时，还可改善免疫反应活性。所述非酶(αGST)蛋白质优选为白蛋白。所述白蛋白可以是白蛋白和水解白蛋白的混合物。合适的水解白蛋白是水解了的明胶。所述的明胶水解产物，例如，可自SigmaChemicals市售购得(编号G-0262，酶学产品)。特别优选的白蛋白(非水解的)是血清白蛋白，尤其是牛血清白蛋白(BSA)。优选的血清白蛋白和水解了的白蛋白的混合物为牛血清白蛋白和明胶水解产物的等量(w/v)混合物。非酶蛋白质的浓度在5-15％(w/v)的范围内是适宜的，更优选的量为10％(w/v)。适宜的螯合剂是EDTA的碱金属盐。适宜的稳定化介质具有的盐浓度为4-5％(w/v)。特别适宜盐或碱金属盐，尤其是氯化钠。含有盐如氯化钠有助于白蛋白和/或白蛋白水解产物或其它所用的酶蛋白质的溶解，并且其具有所需的稳定化的性质。虽然不希望被任何本发明的理论上的解释所束缚，但可想而知盐是通过降低测定的“背景”(即，非特异性结合)而起作用的。稳定化介质也可适当地含有蛋白酶抑制剂。优选的蛋白酶抑制剂是胰蛋白酶抑制剂如抑肽酶。适当的缓冲液是N.E.Good和S.Izawa在MethodsinEnzymol.(酶学方法)((1972)，24，PartB，53)中所描述的那类两性离子缓冲液。特别适合的缓冲液是pH为7.3的HEPES。根据本发明的稳定化介质还可包括其它添加剂，如，各种抗微生物试剂或防腐剂。适当的防腐剂包括叠氮化钠及含有已知称为乙基汞硫代水杨酸钠或硫柳汞(thiomerosal)的汞硫醇盐的防腐剂。根据本发明的稳定化介质可在与尿样一起贮存前混合好，所述尿样用于在-20℃贮存一定的时间后进行αGST的测定。本发明还提供了定量测定尿中αGST的方法，包括使尿样与未溶解形式的抗-αGSTIgG接触，所述尿样已用本文前面所定义的稳定化介质预处理过，通过使结合的αGST与酶标记的抗-αGSTIgG接触并测量酶标记的活性来测定与抗-αGSTIgG结合的αGST的量。根据本发明的稳定化介质能使人们得到与在对本领域称作新鲜尿样的尿样进行免疫测定时得到的敏感性极其相关的尿αGST的免疫测定敏感性。与在-20℃没有稳定化介质下贮存的尿样的情况相比，尿样在根据本发明的稳定化介质的存在下贮存后，基本上没有免疫活性的损失，这一点证明于下文的实施例。优选的酶标记是过氧化物酶，更优选辣根过氧化物酶。另一个优选的过氧化物酶复合物是生物素化的亲合素(包括链霉亲合素(streptavidin))-过氧化物酶复合体，它可以与抗体-生物素复合物一起使用，以惯常的方式放大酶测定结果。在这样的酶测定试验中，根据过氧化物酶活性的测量，在固相抗体上未溶解的抗原与抗体-生物素复合物结合，反过来它又与生物素化的亲合素/链霉亲合素-过氧化物酶复合体结合。而且，用于酶免疫测定的抗-αGSTIgG-HRP复合物在稳定化介质中优选为稳定的液体形式；所述的稳定化介质含有稳定量的细胞色素c和稳定量的血清白蛋白、表面活性剂、多元醇和缓冲液，使该介质具有6.5的pH，且多元醇的终浓度在5-15％(v/v)的范围内。细胞色素c的含量优选为0.02-2％(重量/体积比)。细胞色素c的浓度可被增加到2％(重量/体积比)以上，而基本上不影响稳定作用；但使其浓度降到约0.02％(重量/体积比)以下时，则导致缓冲液稳定效果的下降。本文的术语“细胞色素c”是指在血红素的侧链和蛋白质之间存在共价键的细胞色素。稳定化的蛋白质优选为血清白蛋白，其含量为0.5-2％(重量/体积比)。特别适当的血清白蛋白是牛血清白蛋白(BSA)。如同细胞色素c组分的情况一样，BSA的量可被增加到2％(重量/体积比)以上，而基本上不影响稳定作用，但如果使浓度降到约0.05％(重量/体积比)以下，缓冲液的稳定效果则降低。血清白蛋白可被另外的稳定化蛋白质如在BSA中富含的胎牛血清白蛋白所补充。表面活性剂优选非离子表面活性剂，它们选自脂肪酸的聚氧乙烯脱水山梨醇酯、聚氧乙烯醇、聚氧乙烯异醇、取氧乙烯醚、聚氧乙烯酯、聚氧乙烯-对-叔-辛基苯酚或辛基苯基环氧乙烷缩合物、环氧乙烷与脂肪醇的缩合物、聚氧乙烯壬基苯酚、和聚二元醇的混合物或上述物质的混合物。特别优选的非离子表面活性剂包括在Tween商标下出售的聚乙烯脱水山梨醇酯，尤其是聚氧乙烯山梨糖单月桂酸酯或吐温20、或吐温60和吐温80；在Triton商标下出售的聚氧乙烯醚，如TritonX100、TritonX114、TritonX110E和TritonN101、和Brij；在NonidetP40商标下出售的辛基苯基-环氧乙烷缩合物；在Lubrol商标下出售的环氧乙烷和脂肪醇的缩合物，尤其是LubrolPX；和在SynperonicF108商标下出售的1重量份的聚二元醇和4重量份的聚丙二醇的混合物。(Tween、Triton、Brij、Nonidet、Lubrol和Synperonic均为商标名称)。特别合适的表面性剂是SynperonicF108。多元醇稳定蛋白质-蛋白质间的相互作用。合适的多元醇包括葡萄糖、甘油、甘露糖醇、山梨糖醇和蔗糖或其混合物。特别优选的多元醇为甘油，其终浓度为10％(v/v)。特别合适的缓冲液是磷酸盐缓冲液。依据酶复合物的性质，用于抗αGSTIgG-HRP-复合物的稳定化的介质还可包括其它的添加剂，如，各种抗微生物试剂、防腐剂和蛋白酶抑制剂、稳定蛋白质-蛋白质间相互作用的试剂、抗氧化剂和有助于鉴别的着色剂。适当的抗微生物试剂是庆大霉素。适当的防腐剂包括含有已知称为乙基汞硫代水杨酸钠或硫柳汞的汞硫醇盐的防腐剂。适当的蛋白酶抑制剂是，例如，胰蛋白酶抑制剂如抑肽酶。适当的着色剂是卡红染料。通过下列实施例对本发明做进一步的阐述。实施本发明的最佳方式实施例1用下列试剂制备pH为7.3的用于尿αGST的稳定化介质试剂-HEPES-0.5MNa2EDTA-10mMNaCl-4.5％(w/v)BSA-5％(w/v)明胶水解产物-5％(w/v)抑肽酶-10μg/ml乙基汞硫代水杨酸钠-0.01％(w/v)叠氮化钠-0.05％(w/v)将所有上述组分加入到80％终体积的去离子水中，并用NaOH调pH至7.3。然后用去离子水使溶液达终体积。在加入BSA和明胶水解产物的时候，重要的是它们需分别加入，并注意保证在加入第二组分之前，第一组分已经完全溶解。通过将1重量份的介质加入到4重量份的尿中(1/5稀释)，轻轻混合并将样品冻于-20℃或在测定前2小时之内临时贮存于2-8℃，而将如此制备的稳定化介质用于稳定尿αGST。实施例2用下列试剂制备pH为6.5的用于抗-αGSTIgG-HRP-复合物的稳定化介质试剂含量NaCl8.000gNaH2PO4·2H2O0.260gNa2H2PO4·2H2O1.425g细胞色素c0.250gSynperonicF10810.000gBSA10.000g胎牛血清25.000ml乙基汞硫代水杨酸钠0.100g庆大霉素0.100g卡红染料0.930g浓HCl(用于调节pH)不定去离子水不定用去离子水加至1000ml将700ml的去离子水加到玻璃容器中。边搅拌边向该容器中加入NaCl、NaH2PO4·2H2O、Na2H2PO4·2H2O和乙基汞硫代水杨酸钠，直至试剂溶解。在搅拌后加入SynperonicF108到该溶液中，直到该表面活性剂溶解。检查溶液的pH，并用5MHCl调节pH至6.5。然后向溶液中加入BSA并使之溶解。然后边继续搅拌边向该溶液中加入胎牛血清，直到溶解。然后边继续搅拌边加入庆大霉素、细胞色素c和卡红染料，直至溶解。重新检查pH，如必要调pH至6.5。将终体积调至1000ml，并使缓冲液过滤通过0.2μm滤器，以备贮存。使用时，将9份的缓冲液加入到1份的甘油中。实施例3以当前由BiotrinInternationalLimited提供销售的以Nephkit为其商标的冻干形式的酶免疫测定试剂盒，研究由实施例2制备的稳定化介质内的抗-αGSTIgG-HRP复合物的稳定性。Nephkit试验提供的方法可用于定量测定尿中的αGST，并可表征肾内的近肾小管的损伤。当复合物在室温下贮存24小时，10倍浓缩的由实施例2制备的稳定化介质的稳定性为100％。实施例4实施例1的稳定化的介质用于在-20℃贮存期间稳定尿αGST的应用采集9个尿样(雌、雄不分)，并用由BiotrinInternationalLimited，MountMerrion，CountryDublin，Ireland销售，以Nephkit为其商标的酶免疫测定试剂盒立即测定αGST。结果示于表1的第二栏。然后将样品分成两组，向其中的一组加入由实施例1制备的稳定化介质(-20℃(SM))，另外一组中不加入(-20℃)。在用Nephkit测定之后，使样品于-20℃继续贮存3天。发现在稳定化介质中于-20℃贮存的样品中得到的测定值与原始4℃(新鲜样品)的数据极为接近。然而，没有稳定化介质的冷冻样品却都表现出αGST免疫反应活性的减低。如前所述，该免疫反应活性的损失很可能起因于冻融诱导的变性。表1实施例5尿αGST-峰值样品的稳定作用将两个尿样品A和B分别稀释成5个不同的αGST水平(10、25、50、100和500ng/ml)，并使它们在4℃和-20℃在实施例1的稳定化介质存在下贮存2天。结果示于表2和3。从表2和3可以看出，稳定化介质的存在使αGST的免疫活性免受损失，这使酶免疫测定的检测变得容易。表2</tables>表3</tables>实施例6制备含有200ng/mlαGST的两个样品，将其命名为C200和D200，并向各样品中加入实施例1的稳定化介质。将上述两个样品都分成两份，并将所得的等分样品分别贮存于4℃和-20℃。在贮存2天后，参照实施例4，按Nephkit测定步骤，对每个样品进行不同稀释度(1/40-1/320)的测定。结果示于表4和5。权利要求1.尿中的αGST的稳定化介质，含有稳定量的非酶蛋白质、螯合剂和缓冲液，以使该介质具有7.0-7.5的pH，以及该介质可有效地防止αGST免疫活性的损失。2.根据权利要求1的稳定化介质，其特征在于非酶蛋白质为白蛋白。3.根据权利要求1或2的稳定化介质，其特征在于非酶蛋白质是白蛋白和水解了的白蛋白的混合物。4.根据权利要求3的稳定化介质，其特征在于所述的混合物是血清白蛋白和水解了的白蛋白的混合物。5.根据权利要求3或4的稳定介质，其特征在于所述混合物是牛血清白蛋白和明胶水解产物的等量(w/v)混合物。6.根据前面任一权利要求的稳定化介质，其特征在于非酶蛋白质的浓度为10％(w/v)。7.根据前面任一权利要求的稳定化介质，其特征在于螯合剂是EDTA的碱金属盐。8.根据前面任一权利要求的稳定化介质，其特征在于该介质具有4-5％(w/v)的盐浓度。9.根据权利要求8的稳定化介质，其特征在于所述的盐是碱金属盐。10.根据权利要求8或9的稳定化介质，其特征在于所述的盐是氯化钠。11.根据前面任一权利要求的稳定化介质，包括蛋白酶抑制剂。12.根据前面任一权利要求的稳定化介质，其特征在于缓冲液是两性离子缓冲液。13.根据权利要求12的稳定化介质，其特征在于缓冲液是HEPES。14.根据前面任一权利要求的稳定化介质，其特征在于缓冲液的pH为7.3。15.定量测定尿中αGST的方法，包括使尿样与未溶解形式的抗-αGSTIgG接触，所述尿样已用根据权利要求1-14的任一权利要求的稳定化介质预处理过，通过使结合的αGST与酶标抗-αGSTIgG接触并测量酶标记的活性来测定与抗-αGSTIgG结合的αGST的量。16.根据权利要求15的方法，其特征在于酶标记是过氧化物酶。17.根据权利要求15或16的方法，其特征在于过氧化物酶是辣根过氧化物酶。18.根据权利要求17的方法，其特征在于抗-αGSTIgG-HRP-复合物以稳定的液体形式存在于稳定化介质中，所述介质含有稳定量的细胞色素c和稳定量的血清白蛋白、表面活性剂和缓冲液，以使该介质具有6.5的pH，多元醇的终浓度为5-15％(v/v)。全文摘要尿αGST的稳定化介质含有稳定量的非酶蛋白质(如牛血清白蛋白和明胶水解产物的等量(w/v)混合物)、螯合剂和缓冲液，这样该介质的pH在7.0-7.5之间，该介质可有效地防止αGST免疫活性的损失。所述稳定化介质可用于在-20℃的温度下贮存尿样，而使在不含所述稳定化介质中贮存的尿样中观察得到那类αGST免疫活性没有任何损失。在试验前2小时以内，将该稳定化介质加入到于2-8℃临时贮存的新鲜尿样中时，该介质亦可改善αGST的免疫活性。文档编号G01N33/53GK1164279SQ94195185公开日1997年11月5日申请日期1994年10月17日优先权日1994年10月17日发明者约翰·马丁·多伊尔,科马克·杰勒德·基尔蒂申请人:拜奥特恩知识产权有限公司