专利名称：抗原特异性IgM的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于测定体液中M类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的方法，该方法通过与至少两种不同的受体R1和R2一起培养所述的样品，其中的两种受体都能特异性地结合到抗体上，R1被结合或者可以被结合到固相上、而R2携带一个标记，其中R1的基本组成为被待测定的抗体特异性识别的呈多聚体形式的结合配偶体、而R2也可以选择地为所述的结合配偶体，并且使用呈单体形式的特异性相同的结合配偶体来减少IgG抗体的干扰。
具体地说，本发明涉及一种在有IgG类免疫球蛋白和干扰因子(诸如类风湿因子)存在下，特异性地检测IgM类免疫球蛋白的方法。
为了对外源物质的引入产生响应，哺乳动物生物体的免疫系统产生了亦被称为免疫球蛋白的抗体。它们防御亦被称作抗原的外源物质。可以把免疫球蛋白划分为五个不同的种类。人们在M，G，A，E和D类的免疫球蛋白之间进行划分。这五类免疫球蛋白的每一种都在重链的组成上有所不同，被称作μ、γ、α、ε和δ链。
每一类免疫球蛋白在生物体中都具有不同的功能。在与抗原的第一次接触、即所谓的初次免疫接种之后，出现了M类免疫球蛋白。但是，随着感染的进行，这些免疫球蛋白的浓度迅速降低。G类免疫球蛋白在初次免疫接种之后首先缓慢地形成，并且当用同一抗原进行第二次感染时大量地出现。A类免疫球蛋白是在生物体的粘膜表面上发现的，并且它决定着该处的防御过程。E类免疫球蛋白主要导致过敏反应。D类免疫球蛋白的确切功能迄今仍是未知的。
在血液中，各个种类的免疫球蛋白存在的浓度差别非常大。因此，G类免疫球蛋白(IgG)是正常人血清中的主要种类，其份额约为75％，这对应于8至18mg/ml的血清含量。第二种最频繁出现的免疫球蛋白为IgA，它的平均血清浓度为0.9至4.5mg/ml。M类免疫球蛋白存在的浓度为0.6至2.8mg/ml，D类免疫球蛋白存在的浓度为0.003至0.4mg/ml。IgE抗体的比例是最低的，它在血清中仅以0.02至0.05μg/ml的浓度存在。
为了有区别地诊断许多的疾病，重要的是检测对具体的抗原具有特异性的一类或几类非常具体的免疫球蛋白的抗体。仅仅可以通过种类-特异性抗体测试或者通过排除某些种类的免疫球蛋白的存在(例如，检测IgG和IgA抗体、而不检测IgM抗体)来保证对病毒、细菌和寄生虫感染的令人满意的诊断。这对于区分新近的或者急性的感染和更早些时候已经发生的感染以及对于临床监测感染的过程来说是特别重要的。抗体的种类-特异性检测对HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、弓形体病病毒、风疹病毒和衣原体的感染来说尤其重要。当测定保护抗体的滴度以及检查免疫接种是否成功的时候，特异于具体抗原的抗体的种类-特异性检测也是必需的。为了诊断新近的急性感染，特别有兴趣的是检测对抗原具有特异性的IgM类抗体。但是，多种干扰因子(比如特异性相同的IgG抗体的存在)频繁地干扰着抗原-特异性IgM抗体的检测。
在现有技术中，已经描述了多种用于检测对抗原具有特异性的具体种类的抗体的方法。因此，通过把特异性抗体结合到用特异性的抗原包被的固相上，频繁地检测具体种类的抗原-特异性抗体。通过把特异性地针对某类人Ig的抗体结合到待检测的Ig分子上，检测特异于抗原的、目前被结合到固相上的免疫球蛋白(Ig)。给针对人Ig的抗体提供一个标记，借此进行检测。但是，这样的一种测试方法仅在下列情况下是可能的，即如果在与针对人Ig的种类-特异性标记的抗体反应之前，通过洗涤除去所有的非特异性非结合的Ig。因此，作为通常需要的、用于自动系统的一步测试方法是不可能的。此外，对抗原具有特异性的所有种类的抗体都在第一步中结合到固相上。如果抗原对固相的包被不是足够充分的话，那么可能会发生多种抗体结合到抗原上的竞争反应。这会削弱测试的灵敏度。
由所谓的桥测验(Bruckentest)提供了以一步测试进行抗体检测的一种可能性。在EP-A-0 280 211中描述了桥测验的概念。在该方法中，把能够特异性地结合到待测定的抗体上的第一受体(比如抗原)结合到固相上。待测定的抗体结合到固相-结合的抗原上。此外，在测试混合物中存在另一种提供了标记的特异性抗原。通过标记来检测抗体。但在这种测试中，检测了所有的抗原-特异性抗体、而不仅仅是具体种类的抗体。
当测定抗原-特异性IgM抗体时，其它的干扰是由类风湿因子造成的。类风湿因子自身常为IgM类抗体，它通常对IgG抗体的Fc片段具有高的亲和力。结果，类风湿因子看来似乎提供了IgG抗体，从而在免疫测定中对于特异性的IgM抗体而言，结合了类风湿因子。如果类风湿因子已经结合了具有待检测的特异性的IgG分子的话，这会导致假-阳性的测量结果。
在抗原-特异性抗体的种类-特异性检测中，这一问题是DE 3303793的主题。该文献描述了一种用于检测某类Ig(“IgX”)的抗原-特异性抗体的方法，其中通过加入抗-IgG抗体来消除类风湿因子的干扰。在该方法中，把特异性抗原(诸如病毒抗原)施加到固体载体上。使结合到固相上的病毒抗原与样品接触。在下一步中，除去未结合的样品，并用抗-IgX抗体检测结合到固相上的抗原-IgX的复合物。为了尤其在IgM测试中避免类风湿因子的干扰，在测试前用抗-IgG抗体处理样品。因此，以这种方式复合的IgG抗体不再适合于类风湿因子的进攻，从而类风湿因子不能结合抗原-特异性IgG分子，其中所述的IgG分子又能导致假-阳性的结果。但是，无论其特异性如何，所有的IgG抗体都被结合。抗IgG抗体对IgG抗体的干扰而发生的沉淀会导致不希望有的沉淀物和浑浊，而这对整个的测试具有不利的影响。此外，用抗IgG抗体预处理样品也是很复杂的。
在WO 96/14337中公开了另一种通过特异性相同的其它种类的抗体来消除干扰的方法。在这种情况下，使用与IgG重链的Fd部分特异性反应的抗体或抗体片段来消除IgG抗体的干扰。结果，IgGs的抗原结合能力被掩饰得如此之强，以致于它们不再能识别特异性的抗原。类似的概念在WO 96/14338中也有所描述。
在这种情况下，使用抗-Fd抗体或其片段作为消除干扰的试剂，以便减少类风湿因子的干扰。但是，通过高度特异性的抗-Fd试剂来减少干扰是复杂和昂贵的。
在不必加入精心制造的和昂贵的消除干扰的试剂和/或几种特异性抗体的情况下，现有技术中已知的方法不能使得以一步法来检测IgM类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体。从现有技术状态已知的、以桥测验概念为基础的检测的免疫学方法(其中使用了能够结合到固相上的标记的抗原和抗原)的确能够进行一步测试。但是迄今为止利用这一简单的原理，仅仅已经可能同时检测出IgG和IgM类抗体。
因此，所述的目的为提供一种用于检测针对抗特异性抗原的IgM类抗体的改进的方法。该方法不应当需要精心制造的和昂贵的消除干扰的试剂，并且为了在自动系统中有利地使用，该方法应当优选地由一步试验的原理组成。
这一目的是通过根据本发明用于测定M类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的方法来实现的，该方法通过与至少两种不同的受体R1和R2一起培养所述的样品(其中的两种受体都能特异性地结合到抗体上，R1被结合或者可以结合到固相上，而R2携带一个标记)来实现，其中R1的基本组成为被待测定的抗体特异性识别的呈多聚体形式的结合配偶体，并且通过加入呈单体形式的结合配偶体来消除存在于样品中的特异性相同的IgG分子的干扰。
与IgG抗体相比，存在于样品中的与待检测的IgM抗体具有相同特异性的IgA，IgD和IgE抗体以非常低的浓度存在，从而预计没有IgA，IgD和IgE类的干扰。IgA，IgD和IgE类抗体-象IgG分子那样，与以五聚物-抗体存在的IgM抗体相比，上述抗体都是以单个分子的形式存在的，而且每种抗体都有两个针对抗原的结合位点。由于IgG，IgA，IgD和IgE抗体结构的相似，因此通过下述用于抗原-特异性IgM检测的方法，除了由IgG抗体造成的以外，估计可能还减少了IgD，IgA和IgE抗体的干扰。
本发明的方法可以进行样品中M类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的测定，其中存在具有相同的抗原特异性的IgG类抗体。此外，本发明的方法还可以在有类风湿因子存在的情况下进行。而细致地预处理样品不是必需的。
结果已经令人吃惊地弄清楚的是根据本发明呈单体形式的结合配偶体在用于检测抗原-特异性IgM抗体的免疫测定中的用途使得能够有效地消除由抗原特异性相同的IgG抗体造成的干扰。在该方法中，呈单体形式的结合配偶体特异性地结合到IgG抗体的抗原结合位点上。存在于同一样品中特异性相同的待检测的IgM抗体令人吃惊地不与呈单体形式的结合配偶体反应或者仅在可忽略不计的微弱的程度上反应。术语“可忽略不计的微弱的”是指IgM抗体的抗原结合位点不被呈单体形式的结合配偶体封闭。推测起来这是由于与以单个分子形式存在的对单体表位具有实质上较高亲和力的IgG抗体相比，五聚的IgM抗体与单体表位的亲和力要低许多。这就意味着尽管存在呈单体形式的结合配偶体，但仍不削弱IgM测试的灵敏度。被呈单体形式的结合配偶体掩饰的IgG抗体不干扰IgM的测试。
结果还令人吃惊地弄清楚的是通过结合到IgGs的抗原结合位点上的呈单体形式的结合配偶体还可以有效地消除已经结合了IgG抗体的类风湿因子的干扰。由于封闭了IgG抗体的抗原结合位点，因此在事先没有分离IgG抗体或类风湿因子的情况下，可以检测出抗原-特异性IgM抗体。呈单体形式使用的结合配偶体不能引起被掩饰的IgG抗体或类风湿因子的凝集反应。这就防止了由于沉淀物造成的不希望有的浑浊，这种浑浊会不利地影响着整个的测试方法。
由于IgM抗体不干扰，因此在本发明的方法中，用于分离IgG抗体的连续测试步骤就不是绝对必需的。因而，所述方法的特殊的优点为简化了测试步骤。
除了其中的测试试剂存在于液相中的所谓的湿法测试以外，还可以使用适于蛋白或抗体检测的所有标准的干法测试形式。在这些干法测试或者例如在EP-A-0 186 799中所述的测试带(Teststreifen)中，将测试组分施加到载体上。因此如果以测试带的形式来实现本发明的方法的话，就不需要洗涤步骤。但是，本发明的方法优选是以湿法测试进行的。
在一起培养所有的受体和呈单体形式的结合配偶体以及样品并且在一个步骤中实现所述的方法是可能的。在培养之后，该方法可以选择地仅需要一个洗涤的步骤。
一般使用两种不同的受体R1和R2以及呈单体形式的结合配偶体来实现本发明的方法。如果使用了湿法测试的话，受体R2存在于液相中。R1可以存在于液相中或者已经被结合到固相上。呈单体形式的结合配偶体优选存在于液相中。
如果把能够结合到固相上、但是仍然没有结合到固相上的受体用作R1的话，那么与受体R1和R2以及呈单体形式的结合配偶体一起培养样品。在该过程中，样品抗体结合到R1和R2上。这一培养可以在有固相存在的条件下进行。在该过程中形成了一种复合物，它由固相-R1-样品抗体-R2组成。随后从液相中分离出固相，可以选择地洗涤并测量R2的标记。通常是在固相中测量所述标记的，但是也可以在液相中进行测定。
如果与R1和R2以及呈单体形式的结合配偶体一起培养样品是在没有固相的条件下进行的话，那么随后必须使整个的测试混合物与固相接触，可以选择地进行洗涤并且测量标记。
如果受体R1已呈固相-结合的形式，那么把样品和受体R2加入固相-结合的受体R1中并一起培养。在该测试方法中，在把测试混合物加入固相-结合的受体R1中之前，优选与呈单体形式的结合配偶体和R2一起预培养样品。另外的步骤对应于以上所述的方法。
也可能通过几个步骤来实现本发明的方法。在这种情况下，优选与呈单体形式的结合配偶体一起培养样品、然后再与受体R1和R2一起培养。随后可以与其它的受体一起培养测试混合物，由此该方法可以通过几个步骤来实现。另外的测试步骤对应于前面描述的方法。
R1的重要组成为被待测定的IgM抗体特异性识别的呈多聚体形式的结合配偶体，它也可以被称作聚半抗原(polyhapten)。认为本发明的呈多聚体形式的结合配偶体的结构如下，其中把几个优选相同的或者类似的、相当的表位区偶联到与待测定的抗体特异性反应的载体上。术语“类似的”或者“相当的”是指在呈多聚体形式的结合配偶体中存在的结构不必所有的都必须是相同的。唯一的条件是待测定的IgM抗体特异性地结合到这些表位区上。表位区例如可以从抗原或者抗-独特型抗体得到。表位区还可以从糖链得到，象那些例如在糖化蛋白中出现的糖链。它也可以由脂类结构得到，象那些例如在磷脂或脂蛋白中出现的结构。因此，聚半抗原或呈多聚体形式的结合配偶体是由许多相同的或者类似的表位区组成的，因而针对上面已经提及的样品抗体来说具有许多类似的结合位点。在以蛋白作为抗原的情况下，结合位点被认为是一种肽，它的序列为蛋白抗原(分析物)的蛋白序列的一部分，并且抗该蛋白的抗体特异性地结合到其上。在含有糖结构的抗原的情况下，结合位点将为糖分子的区域，其中样品抗体特异性地结合到糖分子上。在脂类结构的情况下，脂类分子可以是针对样品抗体的结合位点。结合位点还可以由肽的区域与糖和/或脂类的组合组成。但是，优选使用以肽为基础的聚半抗原作为呈多聚体形式的结合配偶体。在本发明呈多聚体形式的结合配偶体的情况下，高表位密度的重要性是第一位的，从而五聚的IgM样品抗体能够通过高亲和力特异性地结合到呈多聚体形式的结合配偶体上。本发明呈多聚体形式的结合配偶体的个别肽组成的其它标准对应于下述呈单体形式的结合配偶体的要求。
例如，乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或者金的颗�？梢杂米骶郯肟乖脑靥逦镏�。聚合物、比如葡聚糖或多肽(如聚赖氨酸)、牛血清白蛋白、β-半乳糖苷酶、非特异性免疫球蛋白或其片段也可以用作聚半抗原的载体物质。在选择载体的过程中，唯一的条件是在样品液体中与抗体没有交叉反应性。另一个条件为把半抗原偶联到载体上必须是可能的。通过例如在EP-A-0 650 053和WO96/03652中所述的本领域普通技术人员已知的方法，把表位区或半抗原偶联到载体物质上。此外，在表位区和载体物质之间可以插入间隔区，这一内容在前述未审查的延迟公开的专利申请中也进行了描述。可以使用本领域普通技术人员已知的所有的间隔区。一个要求是在免疫学上它们是没有活性的，即它们与样品中的抗体不发生交叉反应。
R1或者可以被直接结合到固相上，或者通过特异性结合系统间接地结合到固相上。通过本领域普通技术人员已知的方法来实现R1与固相的直接结合。如果通过特异性结合系统将R1间接地结合到固相上的话，那么R1是一种由本发明呈多聚体形式的结合配偶体和特异性结合系统的反应配偶体组成的缀合物。在这种情况下，认为特异性结合系统是两个可以彼此特异性地反应的配偶体。在该情况下，结合能力可以以免疫反应或者另一种特异性的反应为基础。优选地使用生物素和亲和素的组合或者生物素和链霉抗生物素蛋白的组合作为特异性结合系统。其它优选的组合为生物素和抗生物素、半抗原和抗-半抗原、抗体的Fc片段和抗该Fc片段的抗体、或者糖和凝集素。那么，这种可以特异性结合配对的反应配偶体之一即为形成受体R1的缀合物的一部分。
此外，特异性结合系统的其它反应配偶体存在于固相中。通过本领域普通技术人员已知的常规方法，可以将特异性结合系统的其它反应配偶体结合到不溶的载体物质上。在这种情况下，共价结合以及吸附结合是适宜的。特别合适的固相为由聚苯乙烯或类似的塑料制成的试管或微量滴定板，其内表面被特异性结合系统的反应配偶体所包被。颗粒状物质，诸如乳胶颗粒、分子筛物质、玻璃珠、塑料管等也是合适的并且是特别优选的。多孔的层状载体、比如纸也可以用作载体。
受体R2是由与样品抗体特异性反应的分子和标记组成的。与样品抗体特异性反应的分子例如可以为特异性地结合到样品抗体上的抗体、抗体片段、蛋白、抗原或者半抗原。对作为R2的组成的分子来说，唯一的条件是它与待检测的样品抗体特异性地反应。该分子优选为特异性地结合样品抗体的本发明的呈多聚体形式的结合配偶体。通过与针对R1的呈多聚体形式的结合配偶体同样的方法，制备R2中包含的呈多聚体形式的结合配偶体。
受体R2的另一个组分为标记。可以直接检测到的物质优选用作标记，例如化学发光物质、荧光物质或放射性物质或者金溶胶、乳胶或金粒子。酶或其它生物分子也优选作标记、比如半抗原。在半抗原中，洋地黄毒苷是一种特别优选的标记。用于标记的方法为本领域的普通技术人员所熟悉并且在此不必进一步加以说明。通过测量化学发光物质、荧光物质或放射性物质或者金溶胶、乳胶或金粒子或者通过测量由所述酶转化的底物，以众所周知的方式直接检测标记。
还可以间接地检测所述的标记。在这种情况下，另一个受体(其自身又被偶联到一个产生信号的基团上)特异性地结合到R2的标记(比如洋地黄毒苷这样的半抗原)上。通过为本领域的普通技术人员所熟悉的方法来检测产生信号的基团，例如化学发光物质、荧光物质或放射性物质或者酶或金粒子。例如，抗体或抗体的片段可以用作特异性地结合到R2的标记上的另一种受体。如果使用了标记的这种间接检测的话，那么R2标记优选为洋地黄毒苷或者另一种半抗原，并且通过偶联到过氧化物酶上的抗体进行检测，所述抗体针对洋地黄毒苷或者抗半抗原。
为了减少抗原特异性相同的IgG抗体的干扰，根据本发明把呈单体形式的结合配偶体加入测试混合物中。术语“单体”是指本发明呈单体形式的结合配偶体仅含有针对待减少干扰的抗体的一个表位区或者仅有一个结合位点，即与IgG抗体进行特异性免疫反应的结构。为了保证仅有待减少干扰的抗原-特异性IgG抗体结合到呈单体形式的结合配偶体上、而待检测的IgM抗体不结合，这些结合配偶体的单体结构是很重要的。
表位区-如上所述针对于呈多聚体形式的结合配偶体-例如可以从抗原或者抗-独特型抗体得到。根据针对呈多聚体形式的结合配偶体的前提条件，呈单体形式的结合配偶体的表位区也可以由糖和/或脂类结构或者肽、脂类和/或糖组分组合的结构得到。可以使用可由表位区得到的所有结构，所述结构具有一个结合位点，而在有特异性相同的IgM抗体存在的条件下待减少干扰的IgG类抗体特异地结合到所述结合位点上。对结合位点、即对以单体形式使用的结合配偶体而言，唯一的前提条件是保留结合到IgG上的特异的能力。这一条件也适用于在结合位点中存在糖或脂类结构的情况。
根据本发明，还可能使用位于结合位点两侧或者与结合位点重叠的呈单体形式的结合配偶体，其中待消除干扰的IgG抗体特异性地结合到所述结合位点上。因而还可能消除IgG抗体的干扰，该抗体的结合位点包括一个与被待检测的IgM抗体识别的表位不完全相同的表位。这些IgG抗体可以与待检测的IgM抗体之间具有或多或少的交叉反应性。对应于这些交叉反应性抗体的表位并从而对这些表位具有高度亲和力的呈单体形式的结合配偶体的加入也消除了这些IgG抗体的干扰。在或多或少的程度上与待测IgM抗体表位重叠的呈单体形式的结合配偶体的混合物优选用于消除IgG抗体的干扰。
优选使用肽作为呈单体形式的结合配偶体。在以蛋白作为分析物的情况下，结合位点被认为是一种肽-类似于针对呈多聚体形式的结合配偶体的定义，它的序列为蛋白抗原的蛋白序列的一部分，并且针对该蛋白的抗体(在本发明的情况下为IgG抗体)特异性地结合到它的上面。除了这些肽以外，还认为结合位点包括具有氨基酸序列的肽，它具有与前述的肽基本上相当的特异性和/或结合到待检测的IgG抗体上的亲和力。这些肽优选地可以由前述的肽通过取代、缺失或插入个别的氨基酸残基得到。
还认为本发明的对应于特异性结合位点的肽包括肽的衍生物，其中通过化学反应已经使一个或几个氨基酸衍生化。具体说来，本发明的肽的衍生物的例子为那些其中的主链或/和活性氨基酸侧基(例如游离的氨基、游离的羧基或/和游离的羟基)已被衍生化的分子。氨基衍生物的具体实例为氨磺酰或氨甲酰、硫代氨基甲酸乙酯的衍生物以及铵盐(例如盐酸化物)。羧基衍生物为盐、酯和酰胺。羟基衍生物的例子为O-酰基或O-烷基衍生物。所述的肽优选是根据本领域普通技术人员已知的方法通过化学合成生产的，并且在此不必进行特别的说明。
此外，术语肽的衍生物还包括这样的一些肽，其中的一个或几个氨基酸被20种“标准”氨基酸的天然存在的或者非天然存在的氨基酸同系物取代。上述同系物的实例为4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸、β-丙氨酸和4-氨基丁酸。肽的衍生物必须具有与所述的肽基本上相当的特异性或/和结合到待减少干扰的IgG抗体上的亲和力，其中所述衍生物是由所述的肽得到的。
本发明的对应于特异性结合位点的肽也被称为肽-模拟物质、即下文中的肽-模拟物，该物质具有与前述的肽或肽的衍生物基本上相当的特异性或/和结合到待减少干扰的IgG抗体上的亲和力。肽-模拟物是化合物，就其与待测定的抗体的相互作用而论，肽-模拟物可以代替肽，并且尤其是对蛋白酶和肽酶来说，所述的模拟物可以比天然的肽具有更高的稳定性。在下列文献中描述了用于生产肽-模拟物的方法Giannis和Kolter，“Angew.Chem.”105(1993)，1303-1326以及Lee等人，《日本化学协会会刊》66(1993)，2006-2010。
本发明的结合位点的长度、即单体肽的长度通常至少为4个氨基酸。所述长度优选介于4至20个、6至15个或者特别优选介于9至12个氨基酸之间。就肽-模拟物或肽的衍生物而言，考虑到分子的大�。嗨频某ざ仁潜匦氲�。
本发明的作为呈单体形式的结合配偶体的单体肽含有表位，其中待减少干扰的IgG抗体特异性地聚合到该表位上。但是，不再对应于特异性表位的其它侧翼肽序列可以存在于所述肽的N-末端和/或C-末端。这一措施对于改善所述肽的溶解性可能是必须的。唯一的前提条件是作为呈单体形式的结合配偶体的肽实际上是作为单体存在的并且保留了强烈地结合到待减少干扰的IgG抗体上的能力。
针对呈单体形式的结合配偶体(在该情况下为肽)的用途而言，一个前提条件是与存在于呈多聚体形式的结合配偶体或呈多聚体形式的聚半抗原上的表位相同的表位是以单体形式存在的。这就意味着为了有效地消除干扰，结合到呈单体形式的结合配偶体上的IgG抗体必须与待检测的IgM抗体具有相同的免疫特异性。在IgM抗体的测试中，总是应当消除抗原特异性相同的IgG抗体的干扰。
与在呈多聚体形式的结合配偶体上的表位的浓度相比，优选以过剩10倍至10,000倍的量来使用呈单体形式的结合配偶体。呈单体形式的结合配偶体优选以过剩10倍至1000倍的量来使用，特别优选地以过剩100倍的量加以使用。呈单体形式的结合配偶体的浓度仅仅限制到呈单体形式的结合配偶体在某浓度以上不再溶解的程度。在呈多聚体形式的结合配偶体上的表位的浓度取决于载体物质的尺寸，并且针对任何的测试方法和任何的检测参数可以容易地由本领域普通技术人员单独加以确定。在肽型表位(长度6至20个氨基酸)的情况下，对在呈多聚体形式的结合配偶体上的表位的浓度而言，指导值为每毫升载体物质5至500ng的肽是合适的。
为了另外再减少IgG抗体的干扰，除了呈单体形式的结合配偶体以外，还可以使用其它的消除干扰的试剂、比如在介绍中所述的抗-Fd抗体。
对于抗原-特异性IgM的测试而言，可以采用多相以及均相方法作为测试方法。在均相测试方法中，不把由R1、样品-IgM和R2组成的复合物结合到固相上。而几种上述复合物彼此的凝集造成了浑浊，这对IgM的浓度是一种测量。减少了IgG干扰的呈单体形式的结合配偶体并不抑制凝集作用。
但是，优选实施多相方法。特别优选地实施一种根据桥测验原理的方法(参见EP-A-0 280 211)。在一个优选的实施方案中，采用本发明的聚半抗原和特异性结合系统的结合配偶体(优选生物素)的缀合物作为R1。R2由本发明的聚半抗原或呈多聚体形式的结合配偶体和标记(优选洋地黄毒苷)组成。在R1和R2中，特别优选使用相同的聚半抗原。在这一优选的实施方案中，在有用在该情况下优选的亲和素或链霉抗生物素蛋白包被的固相存在的条件下，将受体R1和R2与样品以及呈单体形式的结合配偶体(优选肽)同时培养。在该方法中，R1和R2的呈多聚体形式的结合配偶体与待测定的IgM抗体特异性地反应，而特异性相同的IgG抗体被肽、即被呈单体形式的结合配偶体掩饰、从而它们便不能结合到呈多聚体形式的结合配偶体上。因此，亲和素/链霉抗生物素蛋白-R1-IgM-样品抗体-R2的完整的复合物被结合到固相上。在从液相中分离出固相并且任选地洗涤固相之后，与特异性识别R2的标记的其它受体(在这种情况下与抗洋地黄毒苷的抗体)一起培养结合到固相上的复合物。把另一种受体偶联到产生信号的基团(优选用过氧化物酶)上。在经历了另一任选的洗涤步骤之后，通过产生信号的基团来检测样品抗体，在这种情况下通过由酶转化的底物进行检测。在该测试方法中，与R1、R2、呈单体形式的结合配偶体以及其它受体一起培养样品也可以同时进行。这更加简化了测试方法。
上述测试方法还非常适于应用到自动系统中。还可能检测出几种抗原-特异性IgM抗体，比如抗多种HIV抗原的HIV抗体。在这种情况下，所述的其它受体还可以用作通用的标记，这是因为这种其它受体特异性地识别R2标记。如果同时检测出抗原特异性不同的几种IgM抗体的话，R1和R2的聚半抗原的组成以及用于减少干扰的呈单体形式的结合配偶体必须具有合适的特异性。
本领域普通技术人员已知的所有生物液体都可以用作样品。体液(诸如全血、血清、血浆、尿、唾液等)优选用作样品。
除了上述样品以外，固相和前述的受体、取决于应用而可能需要的其它添加剂(诸如缓冲液，盐，洗涤剂，蛋白添加剂、比如BSA)可以存在于测试混合物中。必需的添加剂是本领域普通技术人员已知的，并且可以由所述的技术人员通过简单的方式加以确定。
此外，本发明的一个主题为一种用于测定M类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的试剂，其中除了用于免疫测定的常用的测试添加剂以外，所述试剂还包含呈单体形式的结合配偶体(即优选肽)和能够结合到待测定的抗体上的受体R1，其中R1能够结合到固相上并且它的基本组成为被待测定的抗体特异性识别的呈多聚体形式的结合配偶体。
本发明的另一个主题为一种用于测定M类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的试剂，其中除了用于免疫测定的常用的测试添加剂以外，所述试剂还包含呈单体形式的结合配偶体(即优选肽)和能够结合到待测定的抗体上的两种受体R1和R2，其中的R1能够结合到固相上、而R2携带一个标记，其中受体R1和R2各自的基本组成均为被待测定的抗体特异性识别的呈多聚体形式的结合配偶体。
本发明的另一个主题为呈多聚体形式的结合配偶体通过本发明前述方法之一用于IgM抗体的抗原-特异性测定的用途。
本发明的再一个主题为呈单体形式的结合配偶体(即优选肽)用于在抗原-特异性IgM抗体的测定中减少IgG抗体和/或类风湿因子干扰的用途。
本发明通过下面的实施例加以解释。
实施例抗原-特异性IgM的测试抗-HIV 2-IgM将生物素-标记的和洋地黄毒苷-标记的多聚体抗原(HIV2)与样品抗体和链霉抗生物素蛋白-包被的固相一同培养(在25℃或37℃下培养大约60至180分钟，在本实施例中120分钟，25℃)。在洗涤步骤之后，结合到壁上的免疫复合物与抗-洋地黄毒苷-过氧化物酶的缀合物反应(在25℃或37℃下培养大约30至120分钟，在本实施例中60分钟，25℃)。在另一洗涤步骤之后，通过底物的反应来检测过氧化物酶缀合物-标记的免疫复合物(在25℃或37℃下培养大约30至120分钟，在本实施例中60分钟，25℃)。
反应步骤(除了底物的反应之外)在Tris/HCl缓冲液(pH7.5，50至150mM，在本实施例中为100mM)中发生，所述缓冲液包含约0.05至0.4％的洗涤剂(此处为0.2％的聚多卡醇)以及约0.5％的蛋白/蛋白衍生物的添加剂(此处尤其为来自乳白蛋白和BSA的胨)。
这种情况下的样品抗体为抗HIV2表位的单克隆小鼠抗体(IgM与IgG)，将该抗体在抗-HIV阴性人血清中稀释到大约2-10μg/ml。
与在聚半抗原上的肽表位的浓度相比，同过剩了10倍或100倍的游离的未标记的HIV2肽抗原发生了竞争。
测试信号的单位为mA
单体肽的加入使得可以进行特异于IgM的HIV2抗体的测试。在不加入肽的情况下，一些样品给出了假-阳性的测试结果。
权利要求
1.用于测定M类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的方法，该方法通过与至少两种不同的受体R1和R2一起培养所述的样品，其中的两种受体都能特异性地结合到所述抗体上，R1被结合到或者可以被结合到固相上、而R2携带一个标记，其特征在于R1的基本组成为被待测定的抗体特异性识别的呈多聚体形式的结合配偶体，并且通过加入呈单体形式的结合配偶体来减少样品中存在的特异性相同的IgG分子的干扰。
2.如权利要求1所要求保护的方法，其特征在于R1和R2的基本组成为被待测定的抗体特异性识别的呈多聚体形式的结合配偶体，并且通过加入呈单体形式的结合配偶体来减少样品中存在的特异性相同的IgG分子的干扰。
3.如权利要求1或2所要求保护的方法，其特征在于使用生物素/亲和素、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/抗生物素、半抗原/抗半抗原、抗体的Fc片段/抗该Fc片段的抗体或糖/凝集素作为特异性结合系统，以便将R1结合到所述固相上。
4.如权利要求1至3之一所要求保护的方法，其特征在于所述的受体R2是用化学发光物质、荧光物质或放射性物质、或者用酶或另一种生物分子标记的。
5.如权利要求1至4之一所要求保护的方法，其特征在于所述的样品与R1和R2以及用于减少干扰的呈单体形式的结合配偶体同时培养。
6.如权利要求1至5之一所要求保护的方法，其特征在于所述的测试混合物与特异性地结合到所述受体R2的所述标记上的其它受体一起培养，其中所述的其它受体为一种针对R2的标记的特异性受体和标记组成的缀合物，随后测定所述的标记。
7.如权利要求1至6之一所要求保护的方法，其特征在于与在所述R1和R2的呈多聚体形式的结合配偶体上的表位浓度相比，以过剩10倍至10,000倍的量加入所述用于减少干扰的呈单体形式的结合配偶体。
8.用于测定根据前述权利要求之一的M类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的试剂，其特征在于除了用于免疫测定的常用的测试添加剂以外，所述试剂包含呈单体形式的结合配偶体以及能够结合到所述待测定的抗体上的受体R1，所述受体能够结合到固相上并且其基本组成为呈多聚体形式的结合配偶体。
9.用于测定根据前述权利要求之一的M类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的试剂，其特征在于除了用于免疫测定的常用的测试添加剂以外，所述试剂包含呈单体形式的结合配偶体以及能够结合到所述待测定的抗体上的两种受体R1和R2，所述两种受体的基本组成均为呈多聚体形式的结合配偶体，并且其中R1能够结合到固相上、而R2携带一个标记。
10.呈单体形式的结合配偶体用于在抗原-特异性IgM抗体的测定中减少IgG抗体和/或类风湿因子干扰的用途。
全文摘要
本发明涉及一种在有G类免疫球蛋白和/或类风湿因子存在的情况下,用于测定体液中M类免疫球蛋白的抗原特异性抗体的方法,该方法通过与至少两种不同的受体R
文档编号G01N33/68GK1245560SQ97181480
公开日2000年2月23日 申请日期1997年11月26日 优先权日1996年11月29日
发明者E·法茨, U·施米特, B·奥芬罗赫－黑恩勒 申请人:罗赫诊断器材股份有限公司
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