专利名称：高纯度大豆皂苷单体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域的制备方法，尤其是一种可作为大豆皂苷以及各单 体皂苷的定量分析和建立检测标准依据的高纯度大豆皂苷单体的制备方法。
背景技术：
大豆中有2%的皂苷和异黄酮等糖苷，其中皂苷约占0.5%。大豆皂苷具有抗癌、 调节免疫功能、降低血清中胆固醇含量、防治心血管疾病、抗菌、抗病毒、护肝、减肥等多重 生理功效和良好药理作用，可开发成保健食品或药品，同时它还是一种重要的发泡剂、乳化 剂、稳定剂和风味改良剂，市场潜力巨大。日本学者北川勋和大久保一良按照苷元的不同，把大豆皂苷分为A、B、E和DDMP 组。大豆皂苷分为A组的结构式如下 大豆皂苷分为B、E和DDMP组的结构式如下 同时，表1列出了 A组、B组、E组大豆皂苷以及DDMP基团结构图及其相对应的分 子量，以供后续实验的分析。表1 A组、B组、E组大豆皂苷以及DDMP基团结构图及其相对应的分子量 经对现有技术文献的检索发现，中国专利申请号200810200834. 1，名称一种高 纯度大豆皂苷A和B的制备方法，该技术称制备检测方法。该技术涉及一种高速逆流色谱 制备高纯度大豆皂苷A和B的方法，得到大豆皂苷单体A和大豆皂苷B的单体。该发明制 得的大豆皂苷A和大豆皂苷B能够达到相当高的纯度，并且该制备方法操作简便、分离效率 高、分离量较大、回收率高以及重现性好。但是，该发明分离的到的是高纯度的大豆A组皂 苷和大豆B组皂苷，即实现的是大豆皂苷的组分离，尚不能有效得到高纯度的各单体皂苷 的分离。其它专利，如中国专利申请:CN101278729A、CN1923845A、CN1245811A、CN1315323、 CN1327983A、CN1590385A、CN1683362A、日本专利 JP2003-171393A 等。这些专利都是工业化 生产富含大豆皂苷混合物的方法。由于大豆皂苷同与之共存的大豆异黄酮极性部分重叠， 这给大豆皂苷单体的分离纯化造成一定的困难。学术上，国内科学家都在致力于研究探讨 合理有效的高纯度的大豆皂苷单体的分离方法。另外，文献报道的分析检测大豆皂苷的方法很多，如薄层色谱光密度(定量)法、 二极管阵列分光光度法、薄层色谱比色法、气相色谱法、高效液相色谱法、HPLC-MS联用技 术、毛细管电泳技术、比色法等。由于HPLC的应用普及，近年来，比较常用的大豆皂苷分析 检测是使用HPLC。但是由于皂苷类组分紫外吸收信号较弱，通常用205nm作为检测波长，而 这又由于溶剂的“末端”吸收效应，造成了 HPLC分析检测大豆皂苷的困难。尽管目前有运 用光电二极管阵列检测器(PDA)，但还是难以解决精确定量分析的困难。同时，由于适当标 准参照物的缺乏，也加大了有效定量分析检测大豆皂苷的难度。当前，尽管有大豆皂苷的检 测分析国家标准颁布，但国内相应的大豆皂苷检测分析方法在各方面或多或少存在一定的 不足。其根本原因在于大豆皂苷单体标准物质的缺乏，导致无法对大豆皂苷进行准确的定 量分析。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，本发明提供一种高纯度大豆皂苷单体的 制备方法。本发明在大孔吸附树脂固相萃取制备大豆皂苷和异黄酮粗提物后，通过凝胶色 谱分子层析分部分离大豆皂苷和异黄酮，液相制备色谱法分离得到大豆皂苷纯单体，液相 色谱_质谱联用对大豆皂苷单体种类作出有效的检测和判断。本发明是通过以下技术方案实现的本发明以大豆皂苷含量较为丰富的大豆胚芽为原料，经脱脂后，先用70%体积百 分比乙醇水溶液提�。倬罂孜绞髦滔噍腿〉玫酱蠖乖碥蘸痛蠖挂旎仆痔嵛铮蝗� 后，用凝胶色谱法分子层析分部分离大豆皂苷和大豆异黄酮；最后，采用液相色谱、蒸发光 散射检测器与二极管阵列检测器检测大豆皂苷单体，并采用液相色谱-质谱联用的方法鉴 别大豆皂苷单体种类，采用制备液相色谱分离得到> 95. 0%的高纯度的单体大豆皂苷。本发明的制备方法包括步骤如下①利用大豆胚芽粉制备大豆皂苷和大豆异黄酮粗提物；②凝胶色谱法分部分离大豆皂苷和大豆异黄酮；③采用制备液相色谱纯化分离单体大豆皂苷；④采用液相色谱、蒸发光散射检测器与二极管阵列检测器检测大豆皂苷单体；⑤采用液相色谱_质谱联用的方法获得高纯度的单体大豆皂苷。
步骤①中所述的大豆皂苷粗提物，其制备方法为A、脱脂用石油醚(30-60°C )在索氏抽提装置中进行脱脂抽提大约3h左右，取出 后在通风处自然挥干石油醚。B、溶剂提取将脱脂的大豆胚芽粉按采用10 1的液料比(mL/g)溶于约的70% 的乙醇水溶液，置于摇床上，在25°C水浴中摇晃浸提大约4h左右，或辅以频率为20KHz的超 声波预处理45min，过滤，旋转蒸发回收乙醇。C、阳离子树脂去杂将大豆皂苷提取液加入装有弱酸性阳离子树脂的吸附柱中， 流速0. 5-2. OBV/h,流出液反复上柱3次，IOOml 15%甲醇水溶液洗脱；旋转蒸发回收甲醇 得洗脱液。D、固相萃取将上述大豆皂苷提洗脱液加入装有大孔吸附树脂的吸附柱中，室温 下，流速控制在0. 5-2. OBV/h ； 1-5BV的去离子水，室温下，流速控制在0. 5-2. OBV/h洗脱杂 质；1-5BV的彡95%的低级醇于室温下2. 0-5. OBV/h冲洗吸附柱，旋转蒸发回收低级醇得洗 脱液；洗脱液冻干得到大豆皂苷和大豆异黄酮粗提物粉末。步骤②中所述的凝胶色谱法，分部分离大豆皂苷和大豆异黄酮的技术条件是 皂苷和大豆异黄酮粗提物粉末Ig用2. 0-3. OmL甲醇溶解，流动相为甲醇、进样体积为 200-500 μ L、流动相流速为0. 5-0. 8mL/min、二极管阵列吸收检测波长为215nm和295nm(监 控DDMP大豆皂苷)。此步骤分部分离大豆皂苷和大豆异黄酮的原理是，由于大豆皂苷和大豆异黄酮的 分子结构的不同，随流动相流经凝胶树脂时进行分子排阻或分子层析从而得到组分离。步骤③所述的制备液相色谱法分析条件是C18反相色谱制备分离柱，温度为 30 0C ；样品浓度为Ig皂苷样品溶于2ml 50% (V/V)甲醇水溶液，进样体积为IOOyL;流动 相为A 0. 001% (V/V)乙酸水溶液，B 0. 001% (V/V)乙酸乙腈溶液；流动相流速为5mL/ min ；检测器为PDA 二极管阵列检测器(200nm-800nm，215nm为监控波长)；HPLC梯度洗脱， 梯度程序见下表。分部收集保留时间> 40min的洗脱液；旋转蒸发回收乙腈，冻干浓缩液得 到。HPLC梯度洗脱程序 注表中10 — 30min,30 — 80min,80 — 90min三个时间段内的浓度变化都随着 时间线性变化。步骤④中所述的采用的液相色谱法是指C18反相色谱分析性分离柱；样 品浓度80mg皂苷样品溶于IOml 1 9 (V/V)乙腈水溶液；进样体积20 μ 1 ；流动相A 0. 001% (V/V)乙酸水溶液，B 0. 001% (V/V)乙酸乙腈溶液；流动相流速:lml/min ；检测 器蒸发光散射(温度40°C，气压2. 3bar)PDA 二极管阵列检测器(205nm，295nm) ；HPLC梯 度洗脱，梯度程序见上表。步骤⑤中所述的液相色谱-质谱联用，即用来通过电喷雾电离质谱(Electronic Spray I on/Mas s Spectrometry, ESI/MS)得到大豆皂苷单体分子量从而获得高纯度的单体
大豆皂苷。
本发明利用现有技术中的蒸发光散射检测器(Evaportive light Scattering Detector, ELSD)，改进了其常用的检测方法，本发明消除了常见于传统HPLC检测方法中的 难点，不同于二极管阵列和荧光检测器，本发明的ELSD的响应不依赖与样品的光学特性， 任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响。ELSD的响应值与样品的 质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物，为HPLC的检测发挥了更加进一 步的优势，带来了更大的便利。本发明检测挥发性低于流动相的任何样品，而不需要样品含 有发色基团，其灵敏度比示差折光检测器高，对温度变化不敏感，基线稳定，适合与梯度洗 脱液相色谱联用。本发明的优点为本发明改进了现有技术中的液相色谱-质谱联用技术，利用凝 胶色谱成功地对大豆异黄酮和大豆皂苷进行了分部分离；利用制备型高效液相色谱制备纯 化大豆皂苷单体；采用蒸发光散射检测器，检测基线相对比较稳定，对于大豆皂苷的检测效 果很好，通过二极管阵列检测与蒸发光散射检测器并用，能够使定量检测结果更加准确；成 功分离制备了 A类中的大豆皂苷Aa、Ab，B类中的大豆皂苷Ba、Bb, E类中的大豆皂苷Be， 纯度较高，各样品峰面积达到95%以上。它将液相色谱-质谱联用对复杂样品的高分离能 力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息结合起来，在药物 分析、食品分析和环境分析等领域得到了广泛的应用。本发明为大豆总体皂苷以及各单体皂苷的定量分析提供了基�。杂诖蠖乖碥盏� 分析检测标准的建立也具有重要的意义。
图1大豆皂苷样品成分反相HPLC蒸发光散射和光电二极管阵列检测色谱对照 图；图2大豆皂苷与大豆异黄酮的凝胶色谱分离图；图3ELSD检测器过凝胶色谱后各样品HPLC分析对照色谱图；图4大豆皂苷单体的HPLC制备分离图谱(检测波长215nm)；图5ELSD检测器HPLC分析检测5个制备色谱收集样品色谱图；图6大豆皂苷单体Aa、Ab、Ba、Bb、Be的ESI/MS图谱。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前 提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下 述的实施例。实施例一(1)利用大豆胚芽粉制备大豆皂苷粗提物A、脱脂称取大豆胚芽粉20g，用石油醚(30-60°C )脱脂3hr，取出置于通风厨中 自然挥干。B、溶剂提取20g脱脂胚芽粉，按10 1的液料比(mL/g)用70%的乙醇水溶液 200ml的浸提4hr，过滤，旋转蒸发回收乙醇得滤液。C、固相萃取将上述大豆皂苷浸提滤液加入装有大孔吸附树脂(AB-8，天津南开大学化工厂)的吸附柱(Φ30πιπιΧ800mm，树脂床层高550mm)中，室温下，流速控制在 1.5BV/h经过大孔吸附树脂床层；5BV的去离子水，室温下，流速控制在1.5BV/h洗去除糖等 杂质(苯酚硫酸法验证糖是否洗去)；4BV的彡90%的甲醇于室温下5. OBV/h冲洗吸附柱， 旋转蒸发回收甲醇得洗脱液；洗脱液冻干得到大豆皂苷和大豆异黄酮粗提物粉末。D、阳离子树脂去杂上述干燥后得粉末溶于50mL50%甲醇水溶液中，加入装有弱 酸性阳离子树脂(Amberlite FPC 22)的吸附柱(15mmX300mm，树脂床层高200mm)中，流速 2. OBV/h，流出液反复上柱3次，IOOml 50%甲醇水溶液洗脱；旋转蒸发回收甲醇得洗脱液， 回收溶剂后冷冻干燥得大豆皂苷粗提物。(2)凝胶色谱法分部分离大豆皂苷和大豆异黄酮样品准备称取上述得到的大豆皂苷粗提物，按照1. OOg粗提物溶于2ml纯甲醇的 比例进行溶解，溶解后的溶液作为样品待用，即配即用；凝胶树脂为S^hadex LH-20 ；色谱 柱=AmerishamBiosciences (300mmX 25mm)；温度室温；流动相纯甲醇(色谱纯)；进样体 积300 μ 1 ；流动相流速0. 5ml/min ；紫外吸收检测波长:215nm (监控皂苷)和254nm(监 控异黄酮)，295nm(监控DDMP大豆皂苷)。如图2所示，分别以215nm和295nm为监控波 长，收集1-6分部峰的洗脱液。其分部组分HPLC分析图谱如图3所示。(3)制备液相色谱纯化分离单体大豆皂苷上述分部分离组分并经HPLC定性分析为大豆皂苷的组分，Ig样品浓度样品溶于 2ml50% (V/V)甲醇水溶液；进样体积为100 μ L ；分离柱为Alltima C18 (250mmX 10. 0mm， 10 μ m)；温度为30°C ；流动相流速为5mL/min ；流动相为A 0. 001 % (V/V)乙酸水溶液，B 0. 001% (V/V)乙酸乙腈溶液；检测器为PDA 二极管阵列检测器(200nm-800nm，215nm为监 控波长)；HPLC梯度洗脱。制备HPLC色谱图如图4所示，制备色谱收集到的5个高纯度大 豆皂苷单体样品色HPLC分析检测(ELSD检测器)图谱如图5所示。(4)液相色谱、蒸发光散射检测器与二极管阵列检测器检测大豆皂苷单体分析柱Aquasil RP C18 (15(kimX 4. 6謹，3 μ m)；样品浓度80mg皂苷样品溶于 IOmll 9 (V/V)乙腈水溶液；进样体积:20μ 1 ；流动相=A 0. 001% (V/V)乙酸水溶液， Β:0. 001% (V/V)乙酸乙腈溶液；流动相流速lml/min;检测器蒸发光散射(温度45°C， 气压2. 3bar)PDA 二极管阵列检测器(205nm，295nm) ；HPLC梯度洗脱，洗脱程序同上表所示。 HPLC分析型色谱图如图1所示。(5)液相色谱_质谱联用的方法获得高纯度的单体大豆皂苷液相色谱条件同(4)操作，质谱分析条件API+/MS ；离子源(Turbo Spray)；氦气 10. OOL/min ；喷雾电压:5500V ；温度500°C ；离子峰扫描范围150-1500。液相色谱-质谱 分析图谱，如图6所示。制备的大豆皂苷高纯度单体经质谱解析结果如下表。表3实例一制备所得大豆皂苷单体样品纯度 实施例二(1)利用大豆胚芽粉制备大豆皂苷粗提物A、脱脂同实例一。B、溶剂提取20g脱脂胚芽粉，按10 1的液料比(mL/g)用70%的乙醇水溶液 200ml的辅以频率为20KHz的超声波预处理45min，过滤，旋转蒸发回收乙醇得滤液。C、固相萃取将上述大豆皂苷浸提滤液加入装有大孔吸附树脂(Amberlite XAD-2)的吸附柱(①30mmX 800mm，树脂床层高550mm)中，室温下，流速控制在1. 5BV/h经 过大孔吸附树脂床层；5BV的去离子水，室温下，流速控制在2. OBV/h洗去除糖等杂质(苯 酚硫酸法验证糖是否洗去)；4BV的彡90%的乙醇于室温下2. 0-5. OBV/h冲洗吸附柱，旋转 蒸发回收乙醇得洗脱液；洗脱液冻干得到大豆皂苷和大豆异黄酮粗提物粉末。D、阳离子树脂去杂同实例一。(2)凝胶色谱法分部分离大豆皂苷和大豆异黄酮样品准备同实例一。(3)制备液相色谱纯化分离单体大豆皂苷上述分部分离组分并经HPLC定性分析为大豆皂苷的组分，lg样品浓度 样品溶于2ml 1 9(V/V)乙腈水溶液；进样体积为lOOyL;分离柱为Alltima C18(250mmX10. 0mm, 10 u m)；温度为 30°C ；流动相流速为 5mL/min ；流动相为 A :0. 001 % (V/V)乙酸水溶液，B:0. 001% (V/V)乙酸乙腈溶液；检测器为PDA 二极管阵列检测器 (200nm-800nm, 215nm为监控波长)；HPLC梯度洗脱。(4)液相色谱、蒸发光散射检测器与二极管阵列检测器检测大豆皂苷单体同实例一。(5)液相色谱_质谱联用的方法获得高纯度的单体大豆皂苷同实例一。制备的大豆皂苷高纯度单体经质谱解析结果如下表。表4实例二制备所得大豆皂苷单体样品纯度
1权利要求
一种高纯度大豆皂苷单体的制备方法，其特征在于，以大豆皂苷含量较为丰富的大豆胚芽为原料，经脱脂后，先用70％体积百分比乙醇水溶液提�。倬罂孜绞髦滔噍腿〉玫酱蠖乖碥蘸痛蠖挂旎仆痔嵛铮蝗缓螅媚荷追ǚ肿硬阄龇植糠掷氪蠖乖碥蘸痛蠖挂旎仆蛔詈螅捎靡合嗌�、蒸发光散射检测器与二极管阵列检测器检测大豆皂苷单体，并采用液相色谱 质谱联用的方法鉴别大豆皂苷单体种类，采用制备液相色谱分离得到≥95.0％的高纯度的单体大豆皂苷。
2.根据权利要求1所述的高纯度大豆皂苷单体的制备方法，其特征是，包括步骤如下①利用大豆胚芽粉制备大豆皂苷和大豆异黄酮粗提物；②凝胶色谱法分部分离大豆皂苷和大豆异黄酮；③采用制备液相色谱纯化分离单体大豆皂苷；④采用液相色谱、蒸发光散射检测器与二极管阵列检测器检测大豆皂苷单体；⑤采用液相色谱_质谱联用的方法获得高纯度的单体大豆皂苷。
3.根据权利要求1或者2所述的高纯度大豆皂苷单体的制备方法，其特征是，步骤①中 所述的大豆皂苷和大豆异黄酮粗提物，其制备方法为A、脱脂用石油醚(30-60°C)在索氏抽提装置中进行脱脂抽提大约3h左右，取出后在 通风处自然挥干石油醚；B、溶剂提取将脱脂的大豆胚芽粉按采用10 1的液料比为mL/g，溶于约的70%的乙 醇水溶液，置于摇床上，在25°C水浴中摇晃浸提大约4h左右，或辅以频率为20KHz的超声波 预处理45min，过滤，旋转蒸发回收乙醇；C、阳离子树脂去杂将大豆皂苷提取液加入装有弱酸性阳离子树脂的吸附柱中，流速 0. 5-2. OBV/h，流出液反复上柱3次，100ml 15%甲醇水溶液洗脱；旋转蒸发回收甲醇得洗 脱液；D、固相萃取将上述大豆皂苷提洗脱液加入装有大孔吸附树脂的吸附柱中，室温下， 流速控制在0. 5-2. OBV/h ； 1-5BV的去离子水，室温下，流速控制在0. 5-2. OBV/h洗脱杂质； 1-5BV的彡95%的低级醇于室温下2. 0-5. OBV/h冲洗吸附柱，旋转蒸发回收低级醇得洗脱 液；洗脱液冻干得到大豆皂苷和大豆异黄酮粗提物粉末。
4.根据权利要求1所述的高纯度大豆皂苷单体的制备方法，其特征是，步骤②中所 述的凝胶色谱法，分部分离大豆皂苷和大豆异黄酮的技术条件是皂苷和大豆异黄酮粗提 物粉末lg用2. 0-3. OmL甲醇溶解，流动相为甲醇、进样体积为200-500 u L、流动相流速为 0. 5-0. 8mL/min、二极管阵列吸收检测波长为215nm和295nm，监控DDMP大豆皂苷。
5.根据权利要求1所述的高纯度大豆皂苷单体的制备方法，其特征是，步骤③所述的 制备液相色谱法分析条件是C18反相色谱制备分离柱，温度为30°C;样品浓度为lg皂苷样 品溶于2ml 50%体积百分比甲醇水溶液，进样体积为100 u L ；流动相为A 0. 001 %体积百 分比乙酸水溶液，B 0. 001%体积百分比乙酸乙腈溶液；流动相流速为5mL/min ；检测器为 PDA 二极管阵列检测器；HPLC梯度洗脱，分部收集保留时间> 40min的洗脱液；旋转蒸发回 收乙腈，冻干浓缩液得到。
6.根据权利要求1所述的高纯度大豆皂苷单体的制备方法，其特征是，步骤④中所 述的采用的液相色谱法是指C18反相色谱分析性分离柱；样品浓度80mg皂苷样品溶于IOml 1 9体积百分比乙腈水溶液；进样体积20 μ 1 ；流动相A:0. 001%体积百分比乙酸 水溶液，B 0. 001%体积百分比乙酸乙腈溶液；流动相流速lml/min ；检测器蒸发光散射 PDA 二极管阵列检测器，HPLC梯度洗脱。
7.根据权利要求1所述的高纯度大豆皂苷单体的制备方法，其特征是，步骤⑤中所述 的液相色谱_质谱联用，通过电喷雾电离质谱得到大豆皂苷单体分子量从而获得高纯度的 单体大豆皂苷。
全文摘要
一种生物技术领域的高纯度大豆皂苷单体的制备和检测方法。包括以下步骤①利用大豆胚芽粉制备大豆皂苷粗提物；②凝胶色谱法分部分离大豆皂苷和大豆异黄酮；③采用制备型液相色谱纯化分离单体大豆皂苷；④采用液相色谱、蒸发光散射检测器与二极管阵列检测器检测大豆皂苷单体；⑤采用液相色谱-质谱联用的方法区别大豆皂苷单体种类。本发明成功地对大豆异黄酮和大豆皂苷进行了分部分离并制备纯化大豆皂苷单体，检测基线相对比较稳定，对于大豆皂苷的检测效果很好；通过二极管阵列检测与蒸发光散射检测器并用，使定量检测结果更加准确；成功分离制备了A类中的大豆皂苷Aa、Ab，B类中的大豆皂苷Ba、Bb，E类中的大豆皂苷Be，纯度较高，各样品峰面积达到95％以上。
文档编号G01N30/06GK101891796SQ20101024311
公开日2010年11月24日 申请日期2010年8月4日 优先权日2010年8月4日
发明者严明霞, 赵大云, 黄玉艾 申请人:上海交通大学
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