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专利名称：一种荧光定量检测沙丁胺醇的试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于医学检验领域，具体地说，本实用新型涉及ー种荧光定量检测沙丁胺醇(SAL)的免疫层析检测试剂盒。
背景技术：
沙丁胺醇，化学名称为I-(4-羟基ー 3羟甲基苯基)-2 —(叔丁氨基)こ醇，是ー种能与肾上腺素能受体结合的药物，临床上主要用于治疗哮喘、支气管痉挛等。将SAL作为饲料添加剂使用，能显著促进动物生长，増加饲料转化率和瘦肉率ロ，长期超量使用，则会在动物组织中蓄积，人食用了这种动物产品后会引发中毒。20世纪90年代初欧洲发生了多起兴奋剂中毒事件，我国从1998年至今也有多起中毒事件发生，因此欧盟各国及我国均做出相应规定禁止其作为饲料添加剂使用。但受经济利益驱使，仍存在大量非法使用的现象。因此监瞀、检测动物产品中与饲料中的兴奋剂就成为关系消费者健康的亟待解决的问题。β -兴奋剂中最常作为促生长剂使用的是克伦特罗，但随着对克伦特罗检测カ度的加大，非法使用者开始转向其他替代品。由于SAL与克伦特罗的促生长作用相差不大，其在动物体内的消除时间比克伦特罗短，毒性较弱，因此，SAL就成为克伦特罗之后最主要的替代品。但国内对于SAI的免疫检测方法研究还处于起步阶段，针对β_兴奋剂类药物的检测方法如气ー质联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)以及液ー质联用法(LC-MS)等，具有准确可靠、重复性强等有点，但是这些方法的缺点同样突出，如仪器昂贵、操作复杂、便携性差等，因而不利于大范围的推广应用及高通量检测。因此，本专利建立ー种简便、可靠、快速、灵敏检测SAL残留的检测方法，以便对动物组织中的SAI残留进行监控。申请号为CN201010235592. 7的发明专利，涉及β -兴奋剂莱克多巴胺、沙丁胺醇ニ元检测测试条及其制备方法，可有效解决能快速、简便地同时检测出兴奋剂莱克多巴胺、沙丁胺醇的问题，方法是基材PVC板上面自后向前依次设置有引水玻璃纤维、载体玻璃纤维、硝酸纤维膜和吸水棉浆板，引水玻璃纤维、载体玻璃纤维和吸水棉浆板上面覆盖有由前部覆盖膜和后部覆盖膜组成的覆膜，可用于同时检测β -兴奋剂莱克多巴胺、沙丁胺醇。但此方法对于较高的灵敏度也不容易实现，而且不可以作为定量测试。申请号为CN200810249803. 5的发明专利，公开了ー种沙丁胺醇的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的各孔包被有以克伦特罗与卵清蛋白偶联制成的包被抗原的酶标板和设在盒体内的沙丁胺醇的多克隆抗体、酶标ニ抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体、沙丁胺醇系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液。其试剂盒具有灵敏度高、重复性好、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高ー个数量级，有望在动物源性食品(如奶样、动物组织样)和尿样的沙丁胺醇残留检测中发挥重要作用，但是，这种方法还不要较长时间的的反应，不利于现场测试。
实用新型内容本实用新型的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种成本低廉、操作简便、灵敏性高的一种荧光检测沙丁胺醇试剂盒。为实现上述目的，本实用新型采取了以下技术方案ー种荧光定量检测沙丁胺醇的免疫层析试剂盒，该试剂盒包括有试纸条和装有荧光标记液的试剂瓶，所述试纸条由样品垫、硝酸纤维素包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成；所述硝酸纤维素包被膜包括检测区和质控区；所述检测区包被有O. 18 I. SOug的沙丁胺醇-牛血清白蛋白偶联物(SAL-BSA偶联物)，所述质控区包被有O. 18-1. 8ug的抗兔IgG ;所述荧光标记液中含有浓度分别为O. 2^1ug/ml的荧光标记SAL抗体(沙丁胺醇抗体)和荧光标记兔IgG。所述荧光标记液的激发波长(Ex)为310 550nm，发射波长(Em)为340 620nm。本实用新型所述的沙丁胺醇的免疫层析试纸盒的检测原理是竞争法，荧光素分子或荧光胶乳微粒与SAL抗体共价结合。将检测样本(尿样或提取液)加入荧光标记物中，其荧光标记SAL抗体可与尿液中的SAL结合，形成复合物；而包被在硝酸纤维素膜上检测区(T)的SAL-BSA偶联物也竞争结合荧光标记SAL抗体。当含SAL样本与荧光标记物混合后滴加至试纸条的上，在层析作用下混合液沿着硝酸纤维素膜向前移动，样本中所含SAL量越多，可与T区SAL-BSA偶联物结合的荧光标记的抗体越少，从而使T区测得荧光检出值降低。通过荧光检测仪扫描T区荧光信号強度，可检测出样本中SAL含量。本实用新型的沙丁胺醇免疫层析试纸条与GC/MS、HPLC等色谱仪器以及酶免法检测沙丁胺醇相比，具有简便(简单操作一歩完成)、适合不同数量样本检测和快速(15分钟左右即可有結果)等优点；与免疫胶体金标记试纸条相比，本实用新型具有灵敏度更高、准确定量等优点。本实用新型的沙丁胺醇层析试剂盒，不需要标记垫，采用瓶装的荧光标记液与样本预先混合的方法，使反应与信号释放更加均一，与其他层析法相比，其批量生产的精密度和准确度达到最好效果。在荧光定量检测仪上可以达到仅10秒就能对沙丁胺醇进行灵敏的定量測定，更快更精确的测定动物组织中所含的沙丁胺醇残留；沙丁胺醇层析试纸条具有良好的准确度(回收率为80%-110%)，定量偏差20%以内)和高灵敏度(灵敏度达O. 3ug/kg)，需要的样品量少(80ul)，操作非常简便。

图I是本实用新型的所述荧光定量检测沙丁胺醇层析试剂盒中试纸条的结构示意图；图2是本实用新型的所述荧光定量检测沙丁胺醇层析试剂盒中试纸条的结构示意图；图3是本实用新型的所述荧光定量检测沙丁胺醇层析试剂盒中用于放置试纸条的检测卡的结构示意图；附图标记说明I、样品垫，2、硝酸纤维素包被膜，3、包括检测区，4、质控区，5、吸水6、底板，7、卡外壳，8、显不窗,9、加样孔。
具体实施方式
[0018]本实用新型所述荧光标记液为荧光素与蛋白的标记物或带有荧光胶乳与蛋白的标记物，其中所使用的荧光素为异硫氰酸荧光素、四こ基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白、多甲藻绿素蛋白、镧系螯合物、羧基荧光素、香豆素等其中的ー种或几种。在本实用新型实施例中，所采用的SAL抗体为常规单克隆抗体技术制备的单抗，所采用的SAL-BSA偶联物(即沙丁胺醇抗原)是利用常规化学合成方法得到，利用竞争法的原理检测标本。本实用新型的试纸条根据本领域的常规方法制备，试纸条的宽度为通常为2. 7 一
3.5mm,以下实施例所例举的试纸条的宽度为3mm。
以下结合附图和具体实施例来详细说明本实用新型。 实施例一在该实施例中，荧光定量检测沙丁胺醇免疫层析试剂盒，包括有试纸条和装有荧光标记液的试剂瓶(图省略)。其中，按试纸条的常规方法，试纸条由样品垫I、包括检测区(T区)3和质控区(C区)4的硝酸纤维素包被膜2、吸水纸5依次相互搭接地粘贴在底板6上构成，如图I和图2所示。在该实施例中，包被膜的检测区T线处包被有O. 18ug的SAL-BSA偶联物(S卩沙丁胺醇抗原)，在包被膜的质控区C线处包被有O. 18ug的抗兔IgG，用于结合荧光标记的兔IgG，用于检测试纸条的有效性。在该实施例中，荧光标记液受3IOnm激发，发射波长为340nm。在该实施例中，荧光标记液的制备采用含羧基的荧光胶乳标记物(本实施例用到的荧光素为7-羟基香豆素胶乳)的制备方法(A)，步骤如下将IOOmg的7_轻基香豆素胶乳分别与14mg SAL抗体或14mg兔IgG混合后,边搅拌边缓慢加入I-こ基-3_ (3-ニ甲基氨丙基)-碳化ニ亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，使其整个反应体系中EDC的含量为O. 2mg，NHS含量为O. lmg，在低温下2 8°C避光反应过夜。用透析或其他方法去除杂质；用荧光保护剂复溶。将上述制备好的荧光胶乳微粒标记的SAL抗体和荧光胶乳微粒标记兔IgG按适当比例混合，以使两种抗体浓度分别都为O. 2ug/ml，分装备用。实施例ニ在该实施例中，荧光定量检测沙丁胺醇免疫层析试剂盒，包括有试纸条和装有荧光标记液的试剂瓶(图省略)。其中，按试纸条的常规方法，试纸条由样品垫I、包括检测区(T区)3和质控区(C区)4的硝酸纤维素包被膜2、吸水纸5依次相互搭接地粘贴在底板6上构成，如图I和图2所示。其中，试纸条由样品垫、包括检测区(T区)和质控区(C区)的纤维素包被膜、吸水纸按试纸条的常规方法依次相互搭接地粘贴在底板上。在该实施例中，包被膜的检测区T线处包被有I. 35ug的SAL-BSA偶联物，在包被膜的质控区C线处包被有O. 45ug的抗兔IgG,用于结合突光标记的兔IgG,用于检测试纸条的有效性。在该实施例中，荧光标记液受550nm激发后，发射波长为620nm。在该实施例中，荧光标记液的制备采用含氨基的荧光胶乳标记物(本实施例用到的荧光素为四甲基异硫氰酸罗丹明胶乳)的制备方法，步骤如下将IOOmg突光胶乳标记物与16mg SAL抗体或16mg兔IgG混合后，置于4 40°C环境，调节体系PH7. O 8. 5，一边搅拌一边缓慢加入O. 4 O. 6%戊ニ醛；反应2 5小时，透析或其他方法去除杂质，用荧光保护剂复溶。将上述制备好的荧光胶乳微粒标记的SAL抗体和荧光胶乳微粒标记兔IgG按适当比例混合，以致两种抗体浓度分别都为O. 5ug/ml，分装备用。实施例三在该实施例中，荧光定量检测沙丁胺醇免疫层析试剂盒，包括有试纸条和装有荧光标记液的试剂瓶(图省略)。其中，按试纸条的常规方法，试纸条由样品垫I、包括检测区(T区)3和质控区(C 区)4的硝酸纤维素包被膜2、吸水纸5依次相互搭接地粘贴在底板6上构成，如图I和图2所示。本实施例的沙丁胺醇免疫层析检测试剂盒，半成品通过以下エ序组装而成由样品垫I、包被膜2、吸水纸5顺次搭接粘贴在底板6上，构成试纸条，再试纸条安装在卡外壳
7(如图3所示)内，固定成检测卡，所述卡外壳7还涂有可供荧光仪扫描识别的产品信息喷码标记层。与写入信息的ID芯片(现有技术中的ID芯片采用的定量计算公式为检测信号值与计算浓度的半对数直线方程式或其他计算方程式，可自动进行结果判定)。分装好的荧光标记液和其他配件组装成试剂盒。本实用新型所述荧光定量检测沙丁胺醇的免疫层析试剂盒，在使用时，组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料卡外壳7 (检测卡)中，塑料上壳设有两个开孔，即如图3所不,所述卡外壳7 —侧的表面设有加样孔9和显不窗8,加样孔9对应于所述的突光定量检测沙丁胺醇的免疫层析试纸条样品垫，结果显示窗8对应于所述荧光定量检测沙丁胺醇的免疫层析试纸条的检测区和质控区，该荧光定量检测沙丁胺醇的免疫层析试纸条可以从该塑料外壳中取出。在该实施例中，包被膜的检测区T线处包被有O. 9ug的SAL-BSA偶联物(即沙丁胺醇抗原)，在包被膜的质控区C线处包被有O. 45ug的抗兔IgG，用于结合荧光标记的兔IgG，用于检测试纸条的有效性。在该实施例中，荧光标记液受490nm激发，发射波长为530nm。在该实施例中，荧光标记液的制备采用含硫碳酰氨基的荧光素(本实施例用到的荧光素为异硫氰酸荧光素)的制备方法，步骤如下用ρΗ8· O ρΗ9· 6碳酸缓冲液分别溶解20mg SAL抗体或20mg兔IgG,用ρΗ8· O ΡΗ9. 6碳酸缓冲液溶解或悬浮3. 5mg异硫氰酸荧光素；边搅拌边将上述的异硫氰酸荧光素渐渐加入球蛋白溶液中，加完后，继续避光搅拌12h左右，结合完毕后，装入透析袋中，用上述碳酸缓冲盐水在低温下透析过夜，用荧光保护剂复溶。将上述制备好的荧光物标记的SAL抗体和荧光胶乳微粒标记兔IgG按适当比例混合，以致两种抗体浓度分别都为lug/ml，分装备用用来测试免疫层析试纸条的荧光定量光谱检测系统(免疫荧光检测仪)，主要包含荧光光源系统、检测系统及自动软件分析控制系统。[0047]本实用新型的所述荧光定量检测沙丁胺醇的免疫层析试剂盒，检测样本需要通过以下操作吸取50 150ul的样本(尿样/提取液)与荧光标记液等量混合，混匀后吸取50 150ul，往水平放置检测卡加样孔加入，不要带入气泡，开始层析反应。反应15分钟，由荧光检测仪读取测试結果。本发明的实施例I 一 3所述的定量沙丁胺醇免疫层析检测试剂盒与免疫荧光检测仪对200例样本(尿样/提取液)的测定结果比较表明在O. 2ppb IOppb范围内测定沙丁胺醇的准确性高定量曲线线性系数均大于O. 99，样本中含Ippb与2ppb浓度的沙丁胺醇其准确度为80% 120%，试剂盒检出限为O. 3ppb。相对一般采用的胶体金法(定性)和酶
联免疫检测法检测试剂盒的检测结果具有更好的灵敏度和特异性。具体如下表。
权利要求1.ー种荧光定量检测沙丁胺醇的试剂盒，其特征是，该试剂盒包括有试纸条和装有荧光标记液的试剂瓶，所述试纸条由样品垫、硝酸纤维素包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成；所述硝酸纤维素包被膜包括有包被有O. 18 I. Sug的沙丁胺醇-牛血清白蛋白偶联物的检测区和包被有O. 18-1. Sug的抗兔IgG的质控区；所述荧光标记液中含有浓度分别为O. 2 I. Oug/ml的荧光标记沙丁胺醇抗体和荧光标记兔IgG。
2.根据权利要求I所述的荧光定量检测沙丁胺醇的试剂盒，其特征是，还包括有卡外壳，所述试纸条被包装在卡外壳内，所述卡外壳ー侧的表面设有加样孔和显不窗，所述加样孔对应于试纸条样品垫的位置，所述显示窗对应于试纸条的检测区和质控区的位置。
3.根据权利要求2所述的荧光定量检测沙丁胺醇的试剂盒，其特征是，所述卡外壳还涂有供荧光仪扫描识别的产品信息的喷码标记层。
专利摘要本实用新型公开了一种荧光定量检测沙丁胺醇的免疫层析试剂盒，该试剂盒包括有试纸条和装有荧光标记液的试剂瓶，所述试纸条由样品垫、硝酸纤维素包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成；所述硝酸纤维素包被膜包括检测区和质控区；所述检测区包被有SAL-BSA偶联物，所述质控区包被抗兔IgG；所述荧光标记液中含有荧光标记SAL抗体和荧光标记兔IgG。与免疫胶体金标记试纸条相比，本实用新型具有灵敏度更高、准确定量等优点，而操作比酶联法更加快速和简便。
文档编号G01N21/64GK202433384SQ20112040385
公开日2012年9月12日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者刘晓云, 唐海波, 王继华 申请人:广州万孚生物技术有限公司