专利名称：：抗心磷脂抗体elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本实用新型涉及抗心磷脂抗体ELISA检测试剂盒。
背景技术：
：抗心磷脂抗体(ACL)属于是一种以血小板和内皮细胞膜上带负电荷的心磷脂作为靶抗原的自身抗体。常见于系统性红斑狼疮(SLE)及其他自身免疫性疾病。该抗体与血栓形成、血小板、自然流产或宫内死胎关系密切。研究证实，许多因素与ACA产生密切相关，常见的原因有(1)自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)的硬皮病等；(2)病毒感染如腺病毒、风疹病毒、水痘病毒、腮腺炎病毒等感染；(3)其它疾病如支原体系统疾病等；(4)口服某些药物如氯丙嗪、吩噻嗪等；心磷脂是pangbom1941年从牛的心肌中分离出来的一种具有抗原性的磷脂，并加以命名，其在哺乳动物肌中含量最高，每个心磷脂分子包含4个不饱和的脂肪酸，极易氧化。ACA是与心磷脂分子中带负电荷的磷酸二酯基团结合，但这种结合必须要有心磷脂分子中的甘油酯部分，如果以苄环取代引甘油酯部分，心磷脂的抗原性则消失。ACA分子中的脂肪酸部分为其抗原性的必需成分；ACA与其它分子中带负荷的磷酸二酯基团并不结合，而只与磷脂分子中的该成分起反应。近年Hotkko等研究发现，ACA仅与已氧化的心磷脂结合，而并不能与进行氧化的还原性的心磷脂类似物结合。自1983年Harris等建立了测ACA(抗心磷脂抗体)的方法以来，有关该抗体的研究在世界范围内得到广泛重视并迅速发展。Koike认为心磷脂与ACA的IgG结合需ACA的辅因子卩2糖蛋白I(p2—GPI)的存在。Harris建立的ACA固相放射免疫法(RLA)所检出的ACA现认为是针对心磷脂与(32_GPI的复合体该法具有较高的敏感性，以后经Loizou等改良成与放射免疫法效果相同而更为方便的ELISA法。目前现有检测抗心磷脂抗体的方法有金标和化学发光检测抗体，只能作简单的定性，而化学发光法需用专门的专用仪器，而对于血清中游离抗体的检测现大多用酶联免疫吸附法(ELISA)，这种方法的特异性和敏感性均较高且无须特殊仪器，既可定性又可定量，可检测抗体类及亚类，易于标准化，具有操3作简单、结果正确、省时等优点，现巳被医院普遍所采用，成为定量测定ACA的世界性标准。但目前市场上，还缺乏质量可靠的心磷脂抗体ELISA检测试剂盒。
实用新型内容本实用新型的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种心磷脂抗体ELISA检测试剂盒。本实用新型采用了下述技术方案来解决上述技术问题一种心磷脂抗体ELISA检测试剂盒，包括盒体，盒体内设有放置试剂瓶的下凹瓶位，其特征在于，盒体内置有一块多孔酶联板、8瓶设有密封盖的试剂瓶、一张封板膜、及使用说明书，所述多孔酶联板为用ACA抗原包被的多孔酶联板；8瓶试剂瓶中的试剂分别为样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、IgG酶标抗体溶液、显色液A液、显色液B液、浓縮洗涤液和终止液各1瓶。上述多孔酶联板为48孔酶联板或96孔酶联板，多孔酶标板包括支撑架，及放置在支撑架之上的6或8条可拆的微孔反应板条，每个微孔反应板条设有8个可拆的反应孔。上述下凹瓶位由泡沫塑料或纸板制成。上述样品稀释液为5ml或10ml，阳性对照液和阴性对照液均为0.5ml或lml，IgG酶标抗体溶液为5ml或10ml，显色液A液和显色液B液均为2.5ml或5ml，浓縮洗漆液为20ml或30ml，终止液为2.5ml或5ml。上述封板膜的大小与多孔酶联板的顶面大小一致。试剂盒中的ACA抗原为由牛心中提取的心磷脂抗原，纯度需达到质量百分比98%以上。试剂盒中的IgG酶标抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG抗体，IgG抗体可以是各种类型的IgG抗体，如鼠抗人IgG、羊抗人IgG或兔抗人IgG。试剂盒中的浓縮洗涤液可采用常规的20XELISA洗涤液，如含有吐温的磷酸盐缓冲液；样品稀释液也可采用常规的ELISA样品稀释液，如含有磷酸盐缓冲液的样品稀释液；阴性对照为正常人血清；阳性对照为含有ACA抗体的人血清；显色液可采用常规的ELISA显色液，如含有过氧化氢的显色液和/或含有四甲基联苯胺的显色液等。试剂盒中除包括上述物质外，还可包括常规ELISA测试时所需要的试剂、工具或容器，如蒸馏水或去离子水、洗液滴瓶或试管等。4其中用ACA抗原包被的多孔酶联板可采用常规的抗原包被酶联板后用封闭液封闭的方式制备。本实用新型的抗心磷脂抗体ELISA检测试剂盒的使用包括如下步骤a、加样取用ACA抗原包被的预包被酶联板，每次实验设空白对照孔、阴性血清对照孔和阳性对照孔，在各孔先加样品稀释液，再依次加入阴性血清对照、阳性血清对照和样品，混匀，置37。C温育15-30分钟；b、洗板弃取各孔内液体，采用洗涤液洗涤加样孔；c、加酶在各孔加IgG酶标抗体溶液，空白对照孔不加，置37。C温育15-30分钟；d、洗板弃取各孔内液体，采用洗涤液洗涤加样孔；e、显色依次在各孔加显色剂，混匀，置室温18'C-25°C，10-15分钟；f、终止；依次在各孔加终止液，混匀；g、测定用酶标仪对空白孔调零，测定各孔的吸光度值(OD值)。如定性检测样本中的抗心磷脂抗体，可根据测定OD值与Cutoff值(阴性对照平均吸光度(OD值)+3SD)的比较，得知血清样本抗心磷脂抗体为阴性还是阳性。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度。在这种半定量测定中，将标本作一系例稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度，根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，通过实验求出P/N的阈值。试验证实，本实用新型的抗心磷脂抗体检测试剂盒特异性与灵敏度高，试剂盒稳定性好，可用于定性与定量检测ACA。图l:48孔酶联板结构示意图图2:96孔酶联板结构示意图图3:下凹瓶位示意图具体实施方式实施例1心磷脂抗体ELISA检测试剂盒，包括盒体，盒体内设有放置试剂瓶的如图3所示下凹瓶位，盒体内置有一块如图l所示的48孔酶联板、8瓶设有密封盖的试剂瓶、一张封板膜、及使用说明书，多孔酶联板为用ACA抗原包被的多孔酶联板；8瓶试剂分别为样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、IgG酶标抗体溶液、显色液A液、显色液B液、浓縮洗涤液和终止液各l瓶，其中，样品稀释液为5ml，阳性对照液和阴性对照液均为0.5ml,IgG酶标抗体溶液为5ml，显色液A液和显色液B液均为2.5ml，浓縮洗涤液为20ml，终止液为2.5ml。48孔酶联板包括支撑架1，及放置在支撑架之上的6条可拆的微孔反应板条2，每个微孔反应板条设有8个可拆的反应孔3。下凹瓶位如图3所示，分别设有对应样品稀释液试剂瓶、阳性对照液、阴性对照液、IgG酶标抗体溶液、显色液A液、显色液B液、浓縮洗涤液和终止液的瓶位4、瓶位5、瓶位6、瓶位7、瓶位8、瓶位9、瓶位10和瓶位11。上述封板膜的大小与48孔酶联板的顶面大小一致。试剂盒中酶联板及各种试剂配制1.用心磷脂抗原包被的48孔酶联板的制备包被将心磷脂抗原(来源Sigma公司)至碳酸盐缓冲液(pH9.6，Na2C031.6g/L，NaHC03H203.2g/L配方)中混匀，加至酶联板孔内，每孔100微升，孵育过夜，用含有吐温的磷酸盐缓冲液(20X，Nacl85g/L,T-200.5ml/L,配方)洗涤酶联板，完成用ACA抗原包被的预包被酶联板的制备；封闭将预包被酶联板每孔加封闭液150微升，孵育过夜，弃封闭液，吹干。采用下表配方中所列封闭液封闭:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>酶标抗体稀释液的配制C6H1()CV(P04)2'HNa2g/L;Na2HP041.2g/L;NaCl0.5g/L;NaH2P040.2g/L，溶液的pH值为7.4。取鼠抗人IgG酶标抗体,用酶标抗体稀释液1:4500稀释，制得IgG酶标抗体溶液。3.浓縮洗漆液(20X)浓縮的0.01MPBS4.显色液A液Na2HP04.12H2018.5g/L;柠檬酸5g/L;H202l.ml/L;5.显色液B液TMB0.2g/L;柠檬酸lg/L;EDTA0.15g/L6.终止液2M硫酸7.样品稀释液10mM的磷酸盐缓冲液内含0.5。/。的BSA8.阴性对照含有〈0."/。NaN3的阴性人血清。9.阳性对照含有〈0.1。/。NaN3的人抗-心磷脂血清。实施例2心磷脂抗体ELISA检测试剂盒，包括盒体，盒体内设有放置试剂瓶的如图3所示下凹瓶位，盒体内置有一块如图2所示的96孔酶联板、8瓶设有密封盖的试剂瓶、一张封板膜、及使用说明书，多孔酶联板为用ACA抗原包被的多孔酶联板；8瓶试剂分别为样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、IgG酶标抗体溶液、显色液A液、显色液B液、浓縮洗涤液和终止液各l瓶，其中，样品稀释液为10ml，阳性对照液和阴性对照液均为lml，IgG酶标抗体溶液为lOml，显色液A液和显色液B液均为5ml，浓縮洗涤液为30ml，终止液为5ml。96孔酶联板包括支撑架1，及放置在支撑架之上的12条可拆的微孔反应板条2，每个微孔反应板条设有8个可拆的反应孔3。下凹瓶位如图3所示，分别设有对应样品稀释液试剂瓶、阳性对照液、阴性对照液、IgG酶标抗体溶液、显色液A液、显色液B液、浓縮洗涤液和终止液的瓶位4、瓶位5、瓶位6、瓶位7、瓶位8、瓶位9、瓶位10和瓶位11。上述封板膜的大小与96孔酶联板的顶面大小一致。试剂盒中酶联板及各种试剂配制同实施例17实施例3ACA的定性检测采用下列方法使用实施例2制备的试剂盒a、加样取用ACA抗原包被的预包被酶联板，每次实验设空白对照孔、阴性血清对照孑L、在各孔先加样品稀释液ioo微升，再依次加入阴性血清对照、阳性血清对照孔、和样品各100微升，混匀，贴上不干胶条，置37"温育30分钟；b、洗板弃取各孔内液体，将洗涤液用蒸馏水稀释20倍后，注满各孔，静置30秒，甩掉洗涤液，重复洗板，最后拍干；c、加酶加IgG酶标抗体lOO微升，空白对照孔不加，贴上不干胶条，置37'C温育30分钟；d、洗板方法同be、显色依次在各孔加显色剂A液、B液各50微升，混匀，置室温；f、终止；依次在各孔加50微升终止液，混匀；g、测定用酶标仪对空白孔调零，测定各孔的吸光度值(OD值)；根据对500个正常人的血样进行检测的结果Cutoff值=阴性对照平均0D值X2.1，血清样本的与阴性对照0D值的比值》2.1为阳性(+);血清样本的与阴性对照OD值的比值〈2.l为阴性(_)。将实施例1的试剂盒用于检测504个正常人与204个经临床方法确认ACA为阳性的患者，测定结果见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>采用SPSS统计软件结果分析敏感性200/204=98%特异性500/504=99.2%正确率(200+500)/708=98.87%实施例4试剂盒稳定性试验试剂盒的稳定性实验,选择五批不同批次，每批次2盒作稳定性试验，其中将2批次试剂盒置于37。C-3天，三批次置于4。C-6个月避光保存表一、试剂盒的物理性能检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例5试剂盒分析灵敏度的确定(阈值的确定)定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出、"有"或"无"的简单回答，分别用"阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度。在这种半定量测定中，将标本作一系例稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度，根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，通过实验求出P/N的阈值。一.材料(1)同实施例2的试剂盒(2)阳性血清样品来自临床典型患者血清样品。二.检定程序按实施例3的方法1)将血清样品稀释液从1:10开始做对倍稀释至1:2560，每个稀释度做2孔，每孔加样100ul，同时做阳性，阴性对照各2孔，空白孔1孔，37r:温育30分钟，洗板4次。2)每孔滴加酶结合物(HRP-抗人IgGMcAb)2滴(100ul)，37。C温育30分钟，洗板4次。3)每孔滴加底物A、B各1滴(50ul)37。C温育15分钟，每孔滴加终止液1滴(50ul)。4)酶标仪波长450nm处测OD值。5)结果判定P/N>2.1，判为阳性(N〈0.1，按0.1计算，>0.1按实际值计算)。(阳性样品孔OD值/阴性对照孔OD值〉2.1,判为阳性)结果:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>四、结论:血清稀释至l:1280时，OD值为0.226，大于0.21为阳性，即试剂盒的灵敏度可达1:1280，典型患者血清0.008ul便可测出IgG抗体为阳性。权利要求1.一种心磷脂抗体ELISA检测试剂盒，包括盒体，盒体内设有放置试剂瓶的下凹瓶位，盒体内置有一块多孔酶联板、8瓶设有密封盖的试剂瓶、一张封板膜、及使用说明书，其特征在于，所述多孔酶联板为用ACA抗原包被的多孔酶联板，多孔酶联板为48孔酶联板或96孔酶联板，多孔酶标板包括支撑架(1)，及放置在支撑架之上的6或8条可拆的微孔反应板条(2)，每个微孔反应板条设有8个可拆的反应孔(3)；8瓶试剂瓶中的试剂分别为样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、IgG酶标抗体溶液、显色液A液、显色液B液、浓缩洗涤液和终止液各1瓶，下凹瓶位由泡沫塑料或纸板制成，下凹瓶位(4)、瓶位(5)、瓶位(6)、瓶位(7)、瓶位(8)、瓶位(9)、瓶位(10)和瓶位(11)分别对应放置样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、IgG酶标抗体溶液、显色液A液、显色液B液、浓缩洗涤液和终止液的试剂瓶，所述封板膜的大小与多孔酶联板的顶面大小一致。2.如权利要求1所述心磷脂抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为5ml或10ml，阳性对照液和阴性对照液均为0.5ml或lml，IgG酶标抗体溶液为5ml或10ml，显色液A液和显色液B液均为2.5ml或5ml，浓縮洗涤液为20ml或30ml，终止液为2.5ml或5ml。专利摘要本实用新型公开了一种心磷脂抗体ELISA检测试剂盒，包括盒体，盒体内设有放置试剂瓶的下凹瓶位，其特征在于，盒体内置有一块多孔酶联板、8瓶设有密封盖的试剂瓶、一张封板膜、及使用说明书，所述多孔酶联板为用ACA抗原包被的多孔酶联板；8瓶试剂瓶中的试剂分别为样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、IgG酶标抗体溶液、显色液A液、显色液B液、浓缩洗涤液和终止液各1瓶。本实用新型的抗心磷脂抗体检测试剂盒特异性与灵敏度高，试剂盒稳定性好，可用于定性与定量检测ACA。文档编号G01N33/543GK201421454SQ20092006898公开日2010年3月10日申请日期2009年3月17日优先权日2009年3月17日发明者崔贻芬申请人:上海尧浩生物技术有限公司
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