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专利名称：基于抗体功能化磁性纳米材料和上转换荧光纳米材料检测癌胚抗原的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于纳米材料与生物技术领域，为一种基于抗体功能化磁性纳米材料和上转换荧光纳米材料并结合抗原-抗体特异性反应对癌胚抗原(CEA)进行检测的试剂盒。特点在于抗-CEA第一抗体(捕获抗体)功能化的磁性纳米材料对样本中抗原进行分离富集，使得检测灵敏度提高；同时利用抗-CEA第二抗体(检测抗体)修饰的上转换荧光纳米材料NaYa78F4: Yba2tl, Hoatl2作为标记物通过检测激光诱导上转换荧光信号进一步提高检测的灵敏度。
背景技术：
抗原，是指能够刺激机体产生特异性免疫应答，并能与免疫应答产物——抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生特异性反应的物质。肿瘤相关抗原指在多种肿瘤细胞中表达增加，而在正常细胞中仅微量合成的抗原分子。癌胚抗原(CEA)是最常用的肿瘤相关抗原，它是一种酸性糖蛋白，胚胎期在小肠、肝脏、胰腺合成，在正常人血清中仅微量存在。CEA最早被认为是大肠癌的标志物(60% -90%患者升高)，但以后发现胰腺癌( 80% )、胃癌( 60%)、肺癌( 75%)和乳腺癌( 60%)患者血清中也有较高的CEA表达。CEA作为一个广谱性肿瘤标志物，对消化道肿瘤和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计据均具有重要价值。血清CEA检测目前已经成为使用最为广泛的肿瘤辅助诊断及预后判断手段。利用抗原-抗体特异性反应原理开发抗原、抗体的检测方法是目前免疫学检测的基本思路，也是包括CEA在内的各种肿瘤相关抗原检测的基础。传统的CEA检测方法主要有酶联免疫分析(ELISA)、电化学发光免疫分析、放射免疫分析等方法。这些方法在光学性能、稳定性、敏感性、安全性、检测时间或者仪器要求等方面均存在各自不足。如ELISA分析灵敏度、稳定性和重复性均欠佳；电化学发光免疫分析尽管提高了检测灵敏度，但存在功能性电极制备困难及操作时间长等不足；而放射免疫分析则因为需辐射防护的缺陷限制了其大规模推广。所以有必要发展一种快速方便，稳定性好、灵敏度高、特异性强、使用成本低的新型检测方法。近年来纳米材料与免疫学技术之间的关系越来越紧密，新型纳米材料在生物医学检测中的发展前景也越来越广阔。其中上传换荧光纳米材料和磁性纳米材料其独特的特性备受人们关注。在稀土掺杂的无机纳米材料中，有一类特殊的发光材料，它能够通过多光子机制把长波辐射(近红外光)转换成短波辐射，发射出比激发光波长短的荧光(紫外可见光)，即上转换荧光。上转换材料具有如下诸多优点光化学稳定，检测背景低，穿透性强，并可以通过选择不同的基质材料和掺杂离子来调节纳米粒子发射不同的上转换荧光，真正实现单激发多发射，从而有利于同时检测多组分。鉴于上述优点，上转换纳米材料目前已成为一种优秀的生物标记材料。同时，在有些生物样品的检测中，由于被测目标物质含量很低，标记与检测中的分离步骤复杂，标记样品的分离与富集效率将直接影响检测的灵敏度和准确性。Fe3O4是应用最为广泛的磁性材料，在液体中以磁流体形式存在的Fe3O4磁性颗粒能够在外在磁场的作用下，发生定向移动。而且Fe3O4磁性磁性纳米粒子性能稳定，较易制备，经过表面修饰可以和多种生物分子连接，可在外加磁场的作用下，实现这些分子的固定化或富集浓缩。因此，利用磁性纳米材料和上转换纳米材料可快速有效地分离与富集目标物质，具有特异性高、分离快、重现性好等优点。本发明首先合成得到了表面生物功能化的Fe3O4磁性纳米材料和NaYa78F4 = Yba2tl,Ho0.02上转换荧光纳米材料，再通过磁性纳米材料结合的抗-CEA第一抗体(捕获抗体)利用抗原-抗体反应特异性捕获待测样本中的CEA，并通过磁分离加以富集分离，再与抗-CEA第二抗体(检测抗体)标记的上转换荧光纳米粒子结合形成CEA捕获抗体/CEA/CEA检测抗体三明治结构样的纳米颗粒复合物。以980nm激光激发诱导上转换荧光为检测信号，以不同浓度CEA标准品的建立标准曲线。在980nm激光诱导下，NaY0.78F4: Yb0.20, Hoatl2上转换荧光纳米材料产生的发光信号(波长为542nm)与CEA的量正相关，以达到对含CEA样品进行定量检测的目的。该发明可用于人血清样本中CEA含量的测定。

发明内容
本发明为一种基于抗体功能化磁性纳米材料磁分离-上转换荧光纳米材料标记检测CEA的试剂盒，所述试剂盒包括作为抗原捕获和磁分离试剂的抗-CEA第一抗体(捕获抗体)功能化的磁性纳米材料；表面修饰了抗-CEA第二抗体(检测抗体)的上转换荧光纳米材料构成的荧光探针；阳性对照；阴性对照；抗原标准品。CEA标准品为已知质量的CEA抗原冻干粉，阳性对照为含有一定浓度(1-lOng/mL) CEA的人血清，阴性对照为PBS缓冲液(pH = 7. 4)。分别制备得到NaYa78F4 = Yba2t^Hoatl2上转换荧光纳米材料和氨基化的Fe3O4磁性纳米球，对纳米粒子进行表面功能化修饰，随后将氨基化的Fe3O4磁性纳米球与抗-CEA第一抗体结合，用作捕获和磁分离试剂，而将NaYa78F4 = Ybtl, Ho0.02上转换荧光纳米材料与抗-CEA第二抗体(检测抗体)结合，构成标记的检测探针。当向CEA捕获抗体功能化磁性纳米材料体系中加入CEA时，两者通过抗原-抗体反应发生特异性结合，经洗涤和磁分离步骤并除去上清后,加入CEA检测抗体标记的上转换荧光纳米材料，CEA检测抗体标记的磁性纳米材料通过抗原-抗体反应与CEA检测抗体标记的荧光探针结合形成CEA捕获抗体/CEA/CEA检测抗体三明治结构样的纳米颗粒复合物，经洗涤和磁分离后，再以980nm激光诱导NaY0.78F4:Yb0.20,Ho0.02上转换荧光纳米材料发光。在一定范围内发光信号强度与CEA含量相关，基于此对CEA标准品进行检测，建立标准曲线，以达到对含CEA样品进行定量检测的目的。有益效果(I)本发明利用980nm激光诱导上转换荧光为检测信号，无背景光及自发荧光干扰，解决了 FITC、RB200标记抗体的免疫学分析技术的背景光干扰及选择性不佳的缺点，大大减低了信噪比，提高了检测稳定性和特异性。(2)本发明利用CEA抗体功能化的磁性纳米球对样品中目标抗原进行分离富集浓缩，检测灵敏度高、检测周期短，且操作简单。


图I :基于抗体功能化磁性纳米材料磁分离-上转换荧光纳米材料标记检测CEA的实验原理2 : (a) =NaY0.78F4: Yb0.20，Ho0.02 上转换荧光纳米材料电镜图；(b) NaY0.78F4: Yb0.20，Ho0.02, SiO2上转换荧光纳米材料电镜图。图3 : (a):抗-CEA—抗(0. lmg/mL)及其修饰后磁性纳米材料的紫外吸收光谱,其中A为抗-CEA —抗，B为抗-CEA —抗修饰后磁性纳米材料；(b):抗-CEA 二抗(0. 15mg/mL)及其修饰后上转换荧光纳米材料的紫外吸收光谱，其中A为抗-CEA 二抗，B为抗-CEA 二抗修饰后上转换荧光纳米材料。图4 :抗体与纳米颗粒结合后的紫外吸收光谱。a :抗-CEA —抗与磁性纳米颗粒(2mg mL—1)结合，b :抗-CEA 二抗与上转换突光纳米材料(2mg mL—1)结合。图5 :CEA检测标准曲线图，浓度范围在2. 5 X IO^12-I X IO^8g mL_具体实施例方式实施例I :表面修饰的磁性纳米材料和上转换纳米颗粒的制备(I)运用水热-溶剂热技术制备NaYa78F4 = Yba2tl, Hoatl2上转换纳米颗粒，并对其做表面修饰。称取 0. 18g Y2O3 (28% ),0. 788g Yb2O3 (70% )和 0. 022g Er2O3 (2% )混合物加入硝酸中加热溶解，挥发掉多余硝酸后得到稀土元素的硝酸盐粉末，将其溶解在SmL去离子水中，再加入I. 0635g二水合乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)，并调节pH至弱碱性，形成澄清透明的EDTA-Ln溶液。取25mL乙二醇，加入3mL HF和0. 4g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，边搅拌边加入8mL上述EDTA-Ln溶液，得到白色乳状胶体。最后加入5. 5mL浓硝酸，搅拌均匀后，转移到50mL带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，195°C反应24h。反应结束后，让其在空气中自然冷却至室温，弃上层液体，釜底的固体用热水冲洗到烧杯中，超声10分钟，然后静置数分钟，弃去上层液体，再加入热水超声，重复3次。然后加乙醇超声分散，最后离心所得固体置于70°C烘箱干燥10h，固体粉末储存备用。(2)利用改进的StSber法对上转换纳米粒子进行表面氨基化修饰。将60mg处理后的上转换荧光纳米材料加入盛有60mL异丙醇的250mL锥形瓶中，超声40min达到完全分散。在快速磁力搅拌下依次加入20mL蒸懼水、2. 5mL 25%的氨水，封口。在35°C下,磁力搅拌IOmin后加入逐滴加入20mL异丙醇和50 y L正娃酸乙酯的混合溶液。反应3h后，再逐滴加入30mL异丙醇和200 y L的3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合溶液，继续反应Ih后停止搅拌，室温下陈化2h。最后将产物离心分离，水洗多次，60°C烘干12h，得到表面有氨基修饰的上转换荧光纳米材料NaYa78F4 = Yba2tl, Hoatl2t5(3)采用一步法制备表面氨基化的磁性纳米颗粒。向30mL乙二醇中，加入6. 5gl，6_己二胺、2. Og无水醋酸钠(CH3COONa)和l.Og六水合三氯化铁(FeCl3. 6H20)。然后加热至50°C，搅拌形成均匀的胶体溶液。将所得溶液转移到50mL带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，在198°C件下反应6h。取出反应釜后，在室温下自然冷却，弃釜内上层液体，下层黑色固体用去离子水冲洗至烧杯中，然后利用磁分离收集。超声条件下，再用水分散，然后磁分离收集，按上面方法再用乙醇洗涤2次，所得黑色固体在50°C条件下干燥5-1 Oh。(4)磁性纳米颗粒与抗-CEA第一抗体(捕获抗体)的结合。将IOmg表明氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒加入到5mL IOmM PBS缓冲液(pH7. 4)，超声分散20分钟后，加入I. 25mL 25%戊二醛和IOOmg NaBH40将混合溶液在室温下缓慢摇晃lh，反应结束后磁性纳米材料经过磁分离，得到的固体粉末用IOmM PBS洗3次以彻底去除戊二醛。粉末再用IOmM PBS溶解，超声分散开，加入5mL 0. Img -m^1的抗-CEA—抗，此溶液在室温下缓慢摇晃6h，反应结束后清洗多次，弃上清。所得沉淀物，即磁性纳米颗粒/抗-CEA —抗复合物(捕获探针)，用5mL0. OlM PBS缓冲液重悬，在4°C条件下保存备用。(5)上转换纳米颗粒与抗-CEA第二抗体(检测抗体)的结合。将IOmg氨基修饰的上转换荧光纳米材料加入到5mL IOmM PBS缓冲液(pH7. 4)，超声分散20分钟后，加入1.25mL 25%戊二醛和IOOmg NaBH4。将混合溶液在室温下缓慢摇 晃lh，反应结束后磁性纳米材料经过磁分离，得到的固体粉末用IOmM PBS洗3次以彻底去除戊二醛。粉末再用IOmM PBS溶解，超声分散开，加入5mL 0. 15mg mL—1的抗-CEA 二抗，此溶液在室温下缓慢摇晃6h，反应结束后清洗多次，弃上清。所得沉淀物，即上转换纳米颗粒/抗-CEA 二抗复合物(捕获探针)，用5mL IOmM PBS缓冲液重悬，在4°C条件下保存备用。实施例2 :标准曲线的建立用PBS 缓冲液配制不同浓度(lX10_12、5X10_12、lX10_n、5X10_n、lX10_1C1、5X10_1Q、lX10_9、5X10_9、lX10_8g .rnL-1)的 CEA 标准品，分别取 IOOy L 不同浓度 CEA 标准品与等体积0. Img ^mL-1CEA抗体标记的磁性纳米颗粒充分混合,磁分离5分钟去除上清液，重悬磁性纳米颗粒并用PBS缓冲液洗涤、磁分离3次以彻底去除未结合的CEA分子。再加入上转换纳米颗粒/抗-CEA 二抗复合物，充分混匀并孵育30min后再经过磁分离弃上清，清洗3遍以保证彻底去除未结合的检测探针。用100 u L0. OlM PBS缓冲液重悬沉淀，在980nm激光激发下得到542nm处的上转换荧光信号，荧光信号(I)随着CEA浓度的增加而逐步增强。根据荧光强度与对应的CEA标准品浓度建立标准曲线。实验结果表明，本检测方法在2. 5X 10_12-1 X 10_8g Hir1CEA浓度区间内得到良好线性关系。实施例3 血清样品中CEA的检测取7例临床血清标本及CEA抗原标准品，血清标本用PBS缓冲液稀释10倍，CEA标准品用 PBS 缓冲液配成不同浓度(I X 1(T12、5X 10-12、1 X l(Tn、5X l(Tn、l X 1(T10、5 X 1(T10、IX 1(T9、5X 10'1X l(T8g mr1)。利用本试剂盒和电化学发光试剂盒(Roche诊断公司产品)分别测定这些标本中CEA的含量，结果见表一，将得到的数据进行相关性比较，两者无显著差异，结果具有很高相关性(R = 0. 9929，P < 0. 0001)。说明本发明的CEA检测试剂盒与国外知名厂家生产的类似产品相比，技术指标大致相当，但本试剂盒检测快速可靠，灵敏度更高，稳定性更好，适合用于临床血清样品中CEA的检测。表一临床血清样品CEA检测，本发明方法与电化学发光方法对比
权利要求
1.一种癌胚抗原(CEA)检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括 作为抗原捕获和磁分离试剂的捕获抗体功能化的磁性纳米材料；表面修饰了检测抗体的上转换荧光纳米材料构成的荧光探针；阳性对照；阴性对照；抗原标准品。
2.如权利要求I所述的癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于所述抗原捕获和磁分离试剂是Fe3O4磁性纳米微球与抗-CEA第一抗体共价结合组装得到的CEA捕获抗体功能化的磁性纳米材料。
3.如权利要求I所述的癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针是NaY0.78F4: Yb0.20, Ho0.02上转换荧光纳米材料和抗-CEA第二抗体结合组装得到的表面修饰了CEA检测抗体的上转换荧光纳米材料。
4.如权利要求I所述的癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于所述检测抗体标记的荧光探针是以980nm激光诱导NaYa78F4 = Yba2tl, Hoatl2上转换荧光获得检测信号。
5.如权利要求I所述的癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于，抗-CEA第一抗体浓度为O.Img · πι Λ其与Fe3O4磁性纳米微球的质量比例为I 100。
6.如权利要求I所述的癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于，抗-CEA第二抗体浓度为O. 15mg · mL-1，与NaYa78F4: Yb0.20，Hoa02上转换荧光纳米材料的质量比例为3 200。
7.如权利要求I所述的癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于抗原标准品CEA抗原冻干粉；阳性对照为含有一定浓度CEA的人血清；阴性对照为PBS缓冲液，pH = 7. 4。
全文摘要
本发明涉及一种利用抗体功能化磁性纳米材料和上转换荧光纳米材料及抗原-抗体反应对癌胚抗原(CEA)进行检测的试剂盒。本发明利用抗-CEA第一抗体(捕获抗体)功能化的磁性纳米材料对样本中的CEA进行富集和分离；同时利用上转换荧光纳米材料激光诱导荧光的高灵敏度和有效避免样本生物背景荧光干扰的特点，用抗-CEA第二抗体(检测抗体)标记上转换荧光纳米材料NaY0.78F4:Yb0.20，Ho0.02作为检测探针，并将这两种纳米材料与抗原-抗体特异性反应原理相结合建立一种高度灵敏、稳定、快速的CEA检测方法。该试剂盒可用于临床或科研中检测CEA的含量，用以肿瘤的辅助诊断、指导治疗及提示预后。
文档编号G01N33/68GK102636649SQ20121006266
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月4日 优先权日2012年3月4日
发明者华东, 吴世嘉, 王周平, 黄朝晖 申请人:无锡市第四人民医院, 江南大学