检测尿液Clusterin含量试纸条的制备及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测尿液Clusterin含量试纸条的制备及应用，用于急性肾损伤和药物肾毒性安全性监测，属于疾病检测【技术领域】，本发明提供的Clusterin胶体金试纸条，基本原理为双抗夹心法，在硝酸纤维素膜的两端分别设有金标垫和吸收垫，金标垫上端为样品垫，金标垫包被有纯化的单克隆Clusterin抗体1胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的单克隆Clusterin抗体2，质控线包被有正常羊抗小鼠IgG抗体，质控线侧贴有吸收垫，该试纸条操作简单，无需仪器，结果易于判断，且检测手段无创，制备试纸条所用单克隆抗体为杂交瘤技术自行制备，费用低，适用于工业化生产。
【专利说明】检测尿液Cluster in含量试纸条的制备及应用
【技术领域】
[0001] 本发明是一种急性肾脏损伤疾病的检测方法，具体涉及一种应用免疫胶体金技术 研制的Clusterin检测试纸条，同时公开了其制备方法，属于疾病检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 急性肾损伤在临床是常见而严重的肾脏病变，其发病率和死亡率都很高，寻求 具有高敏感性、特异性、易检测的新的肾损伤标志物一直是研究热点之一。簇集蛋白 (Clusterin)是一种分子量为80KD的异二聚体糖蛋白，广泛存在于人类及动物的许多组织 中，急性肾损伤（acute kidney in jury, AKI)时，尿簇集蛋白表现出抗凋亡作用，并与脂肪 利用、细胞聚集及黏附有关。虽然它在多种组织广泛表达，但由于其相对分子质量较大，不 能从肾小球滤过，因此只有在肾损伤时才能在尿中检测。动物研究表明当肾毒素、肾切除术 后、多囊肝性肾病和肾细胞瘤引起的急性肾损伤时，Clusterin能在肾损伤后的去分化肾细 胞中表达增加，在鼠、狗和灵长类动物的尿中均可检测出来。因此检测尿中Clusterin水平 可以间接评价急性肾损伤和药物肾毒性的情况。
[0003] 目前国内外检测Clusterin的方法包括免疫组化、ELISA、Western blot、PCR等， 但用于临床则存在很多弊端，如有创、操作程序复杂、时间较长等。
【发明内容】
：
[0004] 本发明的目的是公开一种用于检测尿液Clusterin含量的胶体金试纸条及制备 方法，用于急性肾损伤和药物肾毒性安全性监测。
[0005] 本发明提供的Clusterin的胶体金试纸条，适用于工业化生产，基本原理为双抗 夹心法，具体安装方法参考了中国专利99203566. X、200510200394. 6等，在硝酸纤维素 膜的两端分别设有金标垫和吸收垫，金标垫上端为样品垫，金标垫包被有纯化的单克隆 Clusterin抗体1胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的单克隆Clusterin抗体2,质控 线包被有正常羊抗小鼠 IgG抗体，质控线侧贴有吸收垫。
[0006] 本Clusterin的胶体金试纸条的制备，包括以下步骤：
[0007] 1将自行制备的纯化单克隆Clusterin抗体1用胶体金标记，喷点于玻璃纤维膜 上制备成金标垫，将自行制备的纯化单克隆Clusterin抗体2和正�？剐∈� IgG抗体分别 包被在硝酸纤维素膜（NC膜）上的检测线处和质控线处，当被检样品中含有Clusterin抗 原时，则于金标垫与胶体金标记的Clusterin抗体结合，并在吸收垫的作用下，向前渗透泳 动，与检测线上的Clusterin抗体再次结合，出现肉眼可见的色带。
[0008] 本发明试剂盒的使用方法如下：取尿标本约0. 1-0. 5ml加入小试管中，然后插入 试纸条，待1-2分钟反应带清晰后观察结果（见图2)。出现1条红色（对照）沉淀线，为尿 检诊断阴性；出现2条红色（样品和对照）沉淀线，为尿检诊断阳性，未出现沉淀线则为无 效。
[0009] 本发明的积极效果在于：应用免疫胶体金技术制备Clusterin试纸条，可以快速， 灵敏检测尿中Clusterin蛋白含量，避免了复杂的操作，无需特殊检测仪器，结果易于观察 判断，可以适应多种检测环境，无专业技术人员均可操作。样本用量小，对操作者无毒性，并 且检测手段无创，除可用于临床急性肾损伤的检测还可用于药物肾毒性安全性监测。制备 试纸条所用单克隆抗体为杂交瘤技术自行制备，费用低。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1.为Clusterin检测装置示意图；
[0011] 图2.为Clusterin试剂盒检测结果判定不意图；
[0012] 图中：1 -样品垫，2-金标垫，3-硝酸纤维素膜，4-吸水垫，5-PVC板，6-检测线， 7_质控线。
【具体实施方式】
[0013] 实施例lClusterin单克隆抗体的制备
[0014] 用Clusterin蛋白（美国BD公司）多次免疫Balb/c小鼠，最后一次加强免疫后 第3天取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞株X63-Ag8. 653杂交融合（融合剂为聚乙二醇）， 制备杂交瘤细胞，筛选能够稳定分泌Clusterin单克隆抗体的细胞株制备抗Clusterin的 单克隆抗体1、2,测定单克隆抗体1、2效价，ELISA验证2者混合后效价叠加，证明1、2是针 对Clusterin蛋白抗原上不同的抗原决定簇。
[0015] 实施例2Clusterin胶体金试纸条的制备：
[0016] 根据图1所示，试纸条在硝酸纤维素膜的两端分别设有金标垫和吸收垫，金标垫 上端为样品垫，金标垫包被有纯化的单克隆Clusterin抗体1胶体金偶联标记物，检测线包 被有纯化的单克隆Clusterin抗体2,质控线包被有正常羊抗小鼠 IgG抗体，质控线侧贴有 吸收垫。
[0017] (1)胶体金颗粒的制备：将1ml 1 %氯金酸溶液与99ml超纯水混匀得终浓度为 0.01 %的氯金酸溶液，煮沸；吸取1 %柠檬酸三钠1.6ml，将其一次并快速地加入煮沸的 氯金酸溶液中，溶液继续加热至淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热 5min，室温下冷却，补充失水至原体积（见流程图）。在透射电镜下观察，可见金颗粒大小基 本一致，分布均匀。测量100个胶体金颗粒直径，计算平均直径约20nm。
[0018] 胶体金颗粒的制备过程：
[0019]
【权利要求】
1. 一种检测尿液Clusterin含量试纸条的制备，在硝酸纤维素膜的两端分别设有金标 垫和吸收垫，金标垫上端为样品垫，其特征在于：金标垫包被有纯化的自制Clusterin单克 隆抗体1胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的自制Clusterin单克隆抗体2,质控线包 被有正常羊抗小鼠 IgG抗体。
2. 根据权利要求1所述的Clusterin单克隆抗体1和单克隆抗体2,其特征在于 Clusterin单克隆抗体1和Clusterin单克隆抗体2为分别针对Clusterin不同抗原决定 簇的抗体，即结合位点不同。
3. 根据权利要求1所述的Clusterin单克隆抗体1和Clusterin单克隆抗体2,其特 征在于Clusterin单克隆抗体1和Clusterin单克隆抗体2均为采用小鼠杂交瘤细胞法制 备。
4. 根据权利要求1所述的一种检测Clusterin含量的胶体金试纸条，其特征在于该试 纸条用于检测人或动物尿液样品。
5. 根据权利要求1所述的一种检测Clusterin含量的胶体金试纸条，其特征在于该试 纸条在临床急性肾损伤辅助诊断及药物研究中肾毒性安全性监测的应用。
【文档编号】G01N33/577GK104267187SQ201410549920
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】于晓艳, 耿嘉男, 邹颖刚, 石艳, 李相军, 孙波, 苗春生, 刘凯 申请人:吉林大学
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