专利名称：苍耳子药材uplc指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明设计中药材指纹图谱的构建方法，尤其是苍耳子药材超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱，属于药物分析技术领域。
背景技术：
指纹图谱技术可通过不同的特性共有峰来标示，可基本上反映中药的化学成分以及含量分布情况。美国、英国、印度、德国、加拿大等国家均已接受色谱指纹图谱的质控方法，他们对指纹图谱中的各峰，并不要求每个组分的化学结构都清楚，也不需要对呈现在图谱中的每个组分都清楚地定量，仅需不同批号的同一种药品的指纹图谱保持基本一致。如德、法对联合开发的银杏叶标准制剂EGb761制定的标准，不仅控制了总黄酮和总内酯的含量、指标成分间的比例，而且设置了内控的色谱指纹图鉴别；美国食品药品监督管理局在1996年制定的《FDA关于植物物制品的指南》中，要求对植物原料、植物药中间体和植物药产品提供相应的指纹图谱；中国国家食品药品监督管理局于2000年发布了《中药注射剂的指纹图谱研究的技术术要求(暂行)》，明确要求对新申报的中药注射剂和已上市的中药注射剂实行指纹图谱控制其标准；《中国药典》2010版项下也有多个药材和制剂要求用指纹图谱控制其质量。中药是通过多成分、多途径、多层次、多靶点在人体内发挥整合作用，这些都给中药的深入研究和质量控制带来很大困难。长期以来，中药存在质量控制水平低、不能进行定性和定量分析，质量不稳定，等问题。中药指纹图谱特指中药样本经光谱或色谱等现代分析技术得到的中药各组分群体的特征图谱和图像，目前已成为国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的最有效手段之一。中药指纹图谱主要包括色谱法(如薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)及超临界流体色谱(SFC)等)、光谱法(如紫外、红外光谱等)、核磁共振谱(NMR)和联用技术(如GC-MS (质谱)、LC -MS,LC-NMR和LC-DAD ( 二极管阵列检测)-MSn)等[8，9]得 到的谱图，其中色谱指纹图谱是主流方法_。HPLC给出的是高分辨率的轮廓图谱，操作相对容易，由于是封闭系统，外界影响因素少，稳定性好，很适合作指纹图谱的实验研究和应用；而UPLC在HPLC基础上又有所提高，相比HPLC，UPLC具有分辨率高、分离度高、重现性好、出峰迅速节省溶剂等优点。苍耳子来源为菊科植物苍耳Xanthium sibiricum Part.的成熟带总荀的果实。苍耳子味辛苦、性温、有毒，具有散风热、通鼻窍之功效，是中医临床上散热、解疮毒、通鼻窍、痹症的要药；其含有大量的酚酸类化合物，包括绿原酸、新绿原酸、咖啡酸和多种咖啡酰奎宁酸类等，这类化学成分被证实是苍耳子发挥临床疗效的重要药效组分，具有良好的抗菌、抗病毒、消炎、镇痛作用、止咳和抗肿瘤等生物活性。《中国药典》2010版项下关于苍耳子的质量控制是以性状鉴别和对照药材薄层色谱为指标进行的。由于我国幅源辽阔，不同的气候条件、生态环境对其地域内所产的药材质量有很大的影响，仅靠性状鉴别和含量测定不能全面控制苍耳子的质量，需要有全面反映苍耳子药材质量控制的手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种苍耳子的UPLC指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的苍耳子药材标准指纹图谱。为达到此目的，本发明通过对苍耳子的超高液相色谱指纹图谱的研究，提出了一种苍耳子药材的质量控制方法，弥补了现有质量控制技术的不足，使苍耳子药材的质量控制更加全面和科学。
本发明的苍耳子UPLC指纹图谱建立方法，包括如下步骤:
(I)供试品溶液制备:精密称取过40目筛苍耳子药材粉末0.3 3 g，置于棕色容量瓶中，加入10 IOOmL甲醇称定重量，超声提取30min (150ff,40Hz)，放冷，称定重量，加甲醇补足损失质量，摇匀，再次静置，临用前用0.22 μ m滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。(2)超高液相色谱分析:采用超高液相色谱系统，色谱分离柱为UPLC色谱柱，填料为BEHC18柱(2.1 mmX 100 mm, 1.7 μ m);流动相为乙腈-0.1%磷酸水；采用梯度洗脱方式:0 2min ；3%:97% ；2 2.5min ；5%:95% ；2.5 8min ； 10%:90% ；8 8.5min ；15%:85% ；
8.5 14min ； 20%: 80% ； 14 17min ；24%:76% ；17 20 min ；35%:65% ；20 22 min ；50%:50%; 22 23; 50% 3% ；，检测波长 220nm,流速 0.20 0.45mL.mirT1，柱温 25。。 40 °C ；在此条件下分析供试品溶液，得到苍耳子药材的超高液相指纹图谱。
标准指纹图谱确定:按照本发明方法，对26批不同产地苍耳子药材建立了 UPLC指纹图谱，通过分析比较确定了 19个共有特征峰,其保留时间分别为:4.6 mi n、5.2 mi η、
5.5 mi η、5.8 mi η、6.4 mi η、6.9 mi η、7.2 mi η、7.7 mi η、8.I mi η、11.3 mi η、11.5mi n> 12.2 mi n> 12.5 mi n> 13.5 mi n> 14.3 mi n> 14.8 mi n> 19.7 mi n、20.0 mi n、20.8mi n，这些共有UPLC特征峰构成了苍耳子药材的指纹特征，作为苍耳子药材的标准指纹图
-1'TfeP曰。本发明有以下优点和用途:
(I)将苍耳子药材作为整体 对待，通过比较其共有峰，可以找出不同产地、批次药材之间的细微差异。(2)供试品溶液制备方法简单，色谱条件容易实现。(3)方法的稳定性，重现性较好，采样时间短。(4)适用于苍耳子药材真伪，质量、产地等鉴别和控制。
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图1是本发明提供的苍耳子药材的标准指纹图谱，从左到右分别标示出其19个共有色谱峰。
具体实施方式
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本发明的具体实施方式
如下:
(I)仪器和药品:采用Waters超高液相色谱仪；苍耳子药材共26批，采于全国不同产地，其他试剂均为色谱纯或分析纯。(2)供试品制备:精密称取苍耳子药材粉末0.3g左右，置于IOmL棕色容量瓶中，加入甲醇定容，超声提取30min (150W, 40Hz)，放冷，称定重量，加甲醇补足损失质量，摇匀，再次静置，临用前用0.22 μ m滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。(3)超高液相色谱分析:色谱分离柱填料为BEHC18柱(2.1 mmX 100 mm, 1.7 μ m)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水；采用梯度沈脱方式:0 2min ；3%:97% ；2 2.5min ；5%:95% ；2.5 8min ； 10%:90% ；8 8.5min ； 15%:85% ；8.5 14min ； 20%: 80% ； 14 17min ；24%:76% ；17 20 min ；35%:65% ；20 22 min ；50%:50%;22 23; 50% 3% ;检测波长 220nm，流速0.25 mL.mirT1，柱温30°C ;在此条件下分析供试品溶液，得到苍耳子药材的超高液相指纹图谱。(4)按照本发明方法，对26批不同产地苍耳子药材建立了 UPLC指纹图谱，通过分析比较确定了 19个共有特征峙，其保留时间分别为:4.6 mi n、5.2 mi n、5.5 mi n、5.8 min、6.4 mi n、6.9 mi n、7.2 mi n、7.7 mi n、8.1 mi n、11.3 mi n、11.5 mi n> 12.2 mi n、12.5 mi n> 13.5 mi n> 14.3 mi n> 14.8 mi n> 19.7 mi n、20.0 mi n、20.8 mi n,这些共有峰构成了苍耳子药材的色谱·指纹特征，可以作为苍耳子药材的标准指纹图谱。
权利要求
1.供试品溶液的制备:精密称取过40目的苍耳子药材粉末0.3 3g，置于IOmL棕色容量瓶中，加入甲醇10 IOOmL称定重量，超声提取30min (150ff,40Hz)，放冷，称定重量，加甲醇补足损失质量，摇匀，再次静置，临用前用0.22 μ m滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.指纹图谱的制备:采用超高液相色谱系统，色谱分离柱为UPLC色谱柱，填料为BEHC18柱(2.1 mmX 100 mm, 1.7 μ m);流动相为乙腈-0.1%磷酸水；采用梯度洗脱方式:O 2min ；3%:97% ；2 2.5min ；5%:95% ；2.5 8min ； 10%:90% ；8 8.5min ； 15%:85% ；8.5 14min; 20%:80% ;14 17min ;24%:76% ;17 20 min ;35%:65% ;20 22 min ；50%:50%; 22 23; 50% 3% ;检测波长220nm，流速0.25 mL.mirT1，柱温30°C ;在此条件下分析供试品溶液，得到苍耳子药材的超高液相指纹图谱。
3.标准指纹图谱的确定:确定了19个共有特征峰，其保留时间分别为:4.6 mi n、5.2mi η、5.5 mi η、5.8 mi η、6.4 mi η、6.9 mi η、7.2 mi η、7.7 mi η、8.I mi η、11.3 mi n、·11.5 mi Πλ 12.2 mi n、12.5 mi n、13.5 mi n、14.3 mi n、14.8 mi n、19.7 mi n、20.0 min、20.8 mi n，这些共有UPLC特征峰构成了苍耳子药材的指纹特征，作为苍耳子药材的标准指纹图谱。
全文摘要
本发明提供苍耳子药材超高效液相色谱指纹图谱的建立方法，属于药物分析技术领域其特征在于(1)供试品溶液的制备苍耳子药材粉末过40目筛，甲醇超声提取30min(150W，40Hz)，放冷，称定重量，加甲醇补足损失质量，摇匀，再次静置，临用前用0.22μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。(2)指纹图谱的制备采用超高液相色谱系统，色谱分离柱为UPLC色谱柱，填料为BEHC18柱；流动相为乙腈-0.1%磷酸水；采用梯度洗脱方式；检测波长220nm；在此条件下分析供试品溶液，得到苍耳子药材的超高液相指纹图谱。(3)标准指纹图谱的确定通过比较，确定了19个共有特征峰，这些共有UPLC色谱峰构成了苍耳子药材的指纹特征，作为苍耳子药材的标准指纹图谱。
文档编号G01N30/06GK103235064SQ201310179579
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月16日 优先权日2013年5月16日
发明者韩燕全, 夏伦祝, 高家荣 申请人:韩燕全
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