特异性结合前列腺癌的短肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一系列利用噬菌体展示肽库技术筛选得到的具有靶向前列腺癌特性的多肽。本发明的结合多肽特异性高，可用于前列腺癌高危人群的普查及前列腺癌的早期临床诊断、以及治疗效果的评估。
【专利说明】特异性结合前列腺癌的短肽及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白质多肽【技术领域】，具体涉及一系列可特异性结合前列腺癌的短肽。
【背景技术】
[0002]前列腺癌是严重威胁中老年男性健康的恶性肿瘤之一，而且发病率逐年上升，死亡率高，仅次于肺癌，位居第二。50多年以来，雄激素阻断治疗一直是前列腺癌的标准疗法，然而，大多数患者最终会发展为激素抵抗性前列腺癌(hormone refractory prostateCancer，HRPC)。对于HRPC，目前尚无有效的疗法，而现有治疗手段包括放射治疗、化学治疗等均不能延长患者生命达一年以上。因此探索新型有效的前列腺癌治疗方法，一直是泌尿外科临床所面临的重要课题之一。[0003]目前我国对于前列腺癌的筛查率相对较低，这也是造成前列腺癌死亡率偏高的重要原因之一。因此，本领域迫切需要开发可用于前列腺癌诊断的相关蛋白。而多肽因分子量�。橹┩感院茫廾庖咴郧叶韵赴砻媸芴寰哂薪细咔缀土Χ晌邢虼菅芯恐械睦硐肱涮濉Ｈ欢阎奶烊皇芴�-配体对是非常有限的。
[0004]噬菌体展示肽库技术的发展则为发现和表征新的配体及对应受体提供了有力的工具，不仅有望实现临床应用于肿瘤的靶向治疗，也有助于解释疾病发生机制的理论研究。噬菌体展示技术通过将特定片段插入噬菌体DNA中而将相应的多肽表达在pill衣壳蛋白上，从而在噬菌体的DNA和衣壳蛋白之间搭建桥梁，使得各种靶分子的多肽配体可通过体外或体内筛选得以快速鉴定。发展至今，应用此技术已成功筛选得到针对肝癌、结肠癌、乳腺癌等多种人类肿瘤的靶向多肽，但是对于筛选前列腺癌靶向配体的相关报道则很少。
[0005]因此，本发明利用噬菌体展示肽库技术于前列腺癌肿瘤模型体内筛选得到16条可靶向前列腺癌的短肽，并对此多肽的靶向特性进行了鉴定，以考察其作为靶向配体用于传递药物至前列腺肿瘤部位的可行性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一系列利用噬菌体展示肽库技术筛选得到的具有靶向前列腺癌特性的多肽。
[0007]本发明的另一个目的是提供上述多肽在制备前列腺癌诊断试剂盒中的应用。
[0008]本发明的目的通过下述技术方案予以实现:
[0009]用噬菌体展示肽库减性筛选肿瘤细胞特异性结合多肽或靶肽的方法为:通常用两个细胞系进行筛�。删逭故舅婊目庀韧ü缓锌乖恼Ｏ赴秆。唇岷系纳锨逶偻ü锌乖南赴秆〕鍪删謇┰龊蠼邢乱宦稚秆。钪盏玫教匾煨越岷想�。
[0010]首先，采用上述噬菌体展示肽库减性筛选技术，以前列腺癌LNCaP和PC3细胞作为靶细胞，正常细胞为吸附细胞，对NEW ENGLAND Biolabs的Ph.D._7? Phage DisplayPeptide Library Kit进行四轮体外筛�。ü鹇衷銮肯吹恿Χ龋竦昧饲傲邢侔┨匾煨缘氖删蹇寺�。上述的筛选后，分别于第二轮、第三轮和第四轮筛选结果中随机挑取单克隆进行DNA的提取和测序。应用生物信息学工具分析筛选得到的多肽序列，同时酶联免疫吸附实验用于分析候选噬菌体单克隆对细胞的结合能力，从而鉴定出与前列腺癌细胞具有较强的亲和力的噬菌体16个克�。�16个克隆送去测序，并分别命名为PCP1-16，测序结果证实PCP1-16的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1_16所示。
[0011]本发明筛选得到的多肽经鉴定具有以下特性及优点:
[0012]多肽可有效地识别并特异性结合前列腺癌细胞系LNCaP和PC3，而对正常的前列腺细胞系RWPE-1，及其他肿瘤细胞H印G2、A549、SW480的结合能力弱，表现出针对前列腺癌特异的识别和结合能力；
[0013]该多肽具有分子量小，组织穿透性好，无免疫原性且对细胞表面受体具有较高亲和力的普遍特点，该多肽可用于制备前列腺癌诊断试剂药盒，该试剂盒诊断灵敏度高、特异性高，可用于前列腺癌高危人群的普查及前列腺癌的早期临床诊断、以及治疗效果的评价与病人病情转归、预后的判断。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为ELISA检测第四轮筛选噬菌体克隆与LNCaP和PC3的亲和力对比柱状图；
[0015]其中，图1A为PCP1-20这20个噬菌体克隆分别对LNCaP的亲和力，图1B为PCP1-20这20个噬菌体单克隆分别对PC3的亲和力，21为原库随机噬菌体克隆对LNCaP的亲和力，22为原库随机噬菌体克隆对PC3的亲和力。
[0016]图2为噬菌体克隆对不同细胞的体外靶向能力鉴定(噬菌体相对结合=TUit3ps菌体
克隆/ TU空白对照B旌菌体)。
[0017]其中，图2A为噬菌体PCP1-6分别对不同细胞的结合能力结果图，图2B为噬菌体PCP7-11分别对不同细胞的结合能力结果图，图2C为噬菌体PCP12-16分别对不同细胞的结合能力结果图。
【具体实施方式】
[0018]本发明通过以下实施例作进一步说明，但不作为本发明的限制。
[0019]实施例1前列腺癌特异性结合多肽的筛选
[0020]本实施例采用噬菌体展示随机12肽库减性筛选与前列腺癌细胞特异性结合的多肽，其具体步骤如下:
[0021]用胰酶消化人前 列腺癌细胞LNCaP和PC3后，调整细胞密度，接种于预先包被多聚赖氨酸的培养皿中，待细胞长至80% -90%融合度时进行筛选实验。
[0022]取上述LNCaP和PC3细胞，用无血清DMEM培养后，加入牛血清白蛋白BSA封闭，再加入20 μ I噬菌体肽库，孵育1.5h后，倾倒除去未结合噬菌体，倒置拍甩除去残余溶液。用洗涤液0.2% (v / v)TBST缓冲液冲洗4次，加入非特异性缓冲液0.2M甘氨酸-盐酸(pH2.2) 2ml，吸出洗脱液，加入250 μ 15MTris_HCl (pH9.0)中和后，将洗脱液转至RWPE-1细胞中，孵育3h后，收集上清，即为第一轮筛选得到的噬菌体，将得到的噬菌体取少量利用大肠杆菌通过滴定法确定噬菌体的浓度，其余的噬菌体感染大肠杆菌进行扩增，用于下一轮的筛选。
[0023]第二轮筛选时，洗涤液TBST中Tween-20浓度提高至0.5%，与LNCaP和PC3孵育时间为40min，洗涤次数增加至7次，其余条件、步骤与第一轮相同。
[0024]第三轮筛选时，洗涤液TBST中Tween-20浓度提高至0.8%，与LNCaP和PC3孵育时间减少至25min，并且洗涤次数增加至10次，其余条件、步骤与第一轮相同。
[0025]第四轮筛选时，洗涤液TBST中Tween-20浓度提高至1.0%，与LNCaP和PC3孵育时间减少至20min，并且洗涤次数增加至15次，其余条件、步骤与第一轮相同。
[0026]测定第四轮筛选获得的噬菌体的滴度后，在LB / IPTG / Xgal平板上随机挑取蓝色噬菌斑，制备噬菌体单克隆用于鉴定。
[0027]实施例2噬菌体的扩增
[0028]将实施例1中，每轮筛选获得的噬菌体用LB培养基进行100倍比稀释后，取20 μ I稀释后噬菌体与200 μ I对数生长早期的大肠杆菌菌液混匀，加入到于45°C保温的LB顶层琼脂后迅速倾倒于含有IPTG / Xgal的LB固体平板，处理24小时，计数平板上噬菌体可生长的斑数，然后用此数目乘以稀释倍数即得到每10 μ I噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。
[0029]前列腺癌细胞特异结合的噬菌体多肽的富集:如表1所示，与LNCaP和PC3结合的阳性噬菌体克隆经四轮筛选后噬菌体回收率提高1000倍。
[0030]表1经过四轮筛选后阳性噬菌体的回收率
[0031]
【权利要求】
1.一种短肽，其特征在于:能特异性结合前列腺癌细胞。
2.如权利要求1所述的短肽，其特征在于:其为PCP1-16，其氨基酸序列分别如SEQIDNO:1-16 所示。
3.如权利要求1-2所 示的短肽在制备检测前列腺癌细胞的制剂中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述前列腺细胞为LNCaP和PC3。
5.权利要求1-2任一项所述的短肽在制备前列腺癌诊断试剂盒中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK103897037SQ201410115439
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】华国光 申请人:华国光
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