环境水中非挥发性有机物雌激素活性检测方法
【专利摘要】环境水中非挥发性有机物雌激素活性检测方法。本发明提供了一种检测环境水中非挥发性有机物雌激素活性的方法，用以评价环境水体中综合雌激素活性强度。本发明是通过固相萃取的方法，提取定量水样中的有机物，将所提取的有机物与重组酵母菌共同培养后，检测并评价水样中有机物的雌激素活性。本发明所用重组酵母菌的DNA序列整合有人的雌激素受体hER基因，当具有雌激素活性的物质与雌激素受体结合，可以分泌β-半乳糖苷酶，它能分解底物β-D半乳糖苷氯酚红，使其由黄色变为红色，通过检测波长540nm吸光度值，计算其雌激素活性的强度。同时，在水样有机物雌激素活性检测中，以17β-雌二醇作为阳性对照物，结合其与重组酵母菌的反应模型，可推算出水样有机物的雌激素活性强度。
【专利说明】环境水中非挥发性有机物雌激素活性检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境科学领域，涉及环境水样评价技术，具体涉及环境水样中非挥发 性有机物的雌激素活性检测与评价。
【背景技术】
[0002] 环境中存在多种能模拟、干扰动物及人类内分泌系统的物质，这些外源性化学 物进入机体后，干扰体内内分泌物质的合成、释放、运输、代谢、结合等过程，并且能够激 活或抑制内分泌系统的功能，从而破坏机体内环境的稳定。这一大类物质被统称为环 境内分泌干扰物(environmentalendocrine disrupters/environmental endocrine disrupting chemicals)。环境内分泌干扰物从来源上可以分为天然与人工合成两大类， 前者如植物激素异黄酮类（isoflavones)、木酚素类（lignans)等，后者如药用雌激素 DES(Diethylstilbestrol,己烯雌酚）、杀虫剂（Ο,ρ'-DDT、氯丹等）、除草剂（除草醚，甲草 胺等）、工业化学物（多氯联苯，二噁英，铅、汞、镉等重金属）、塑料工业原料（酞酸酯类，烷 基酚类）等。从作用效应上，环境内分泌干扰物有拟雌激素作用和拟雄激素作用，但大多数 化学物质是以雌激素效应为主，故大部分环境内分泌干扰物亦可称为环境雌激素 。Carlsen 在1992年撰文指出，近50年以来人类精子质量不断下降，成年男性精液量减少，精子数量 下降了 50%。同时，男性生殖系统发育异常与病变（隐睾、尿道下裂、睾丸和前列腺癌）增 加了近一倍。许多学者把这种现象的发生归因于环境雌激素的污染。研究表明，环境雌激 素对机体甲状腺素、儿茶酚胺、睾酮等有明显的干扰效应，临床上表现为畸型胎、性别畸型、 发育异常、生殖功能障碍、代谢紊乱，甚至癌症等。人群流行病学调查也显示人类的生殖障 碍，发育异常，以及某些癌症与内分泌干扰有关。环境雌激素的毒理学研究是目前的一大热 点。研究发现，在雄性小鼠性分化的关键时期，环境内分泌干扰物邻苯二甲酸二辛酯（DEHP) 可导致其隐睾发生，且其发生率与剂量存在一定的相关性。近来人们认为，环境内分泌干扰 物不仅对生殖系统有影响，对非生殖系统尤其是免疫系统也有直接的或者间接的影响。淋 巴器官尤其是能够分化出T细胞的胸腺可以影响生殖器官，免疫系统可以通过中枢神经系 统一胸腺一性腺轴影响到生殖系统，而性腺激素也可以通过影响淋巴器官而间接影响免疫 能力。由于自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮的发生与机体内性激素水 平的变化有关，而环境内分泌干扰物可以直接打破激素平衡，所以有人认为与后者的接触 增大了自身免疫病的发病风险。
[0003] 水污染作为一个世界性的难题在我国表现尤为突出。研究资料显示，我国各种水 体都已受到不同程度的环境内分泌干扰物的污染，甚至包括人们赖以生存的水源水。检测 评价这类物质在水中的存在意义十分重大。针对水体中存在多种微量具雌激素活性有机物 的现状，本专利旨在提出一套检测与评价水中非挥发性混合有机物雌激素活性的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的任务是提出一种环境水样中非挥发性有机物雌激素活性检测方法，用以 评价不同环境水体中多种、微量有机物（天然、人工合成）综合的雌激素活性强度及其变化 规律。与已有的检测与评价水中类雌激素污染物的方法相比，该方法快速简便，成本低廉， 所需样品量少，灵敏度高，能够反映水中混合有机物雌激素受体的诱导效应，并且通过标准 曲线计算得到样品中类雌激素污染物的毒性当量值。
[0005] 实现本发明的技术方案是：通过固相萃取的方法，将水中的有机物进行吸附，然 后进行洗脱、浓缩，将浓缩的有机物样本与重组酵母菌共同培养，该酵母菌的DNA序列整 合有人的雌激素受体hER基因，当具有雌激素活性的物质与雌激素受体结合，可以分泌产 生一种生物酶（β-半乳糖苷酶），它能分解底物β-D半乳糖苷氯酚红（Chlorophenol red-β -dgalactopyranoside，CPRG)，使其由黄色变为红色，通过检测540nm吸光度值，计 算其雌激素活性的强度；同时，以雌二醇作为阳性对照物，结合其与重组酵母菌的反应模 型，推算出水样有机物样本的雌激素活性。
[0006] 本发明所使用的酵母菌株为雌激素受体重组酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)，可根据以下文献所提出的方法进行构建。
[0007] ① Benita S. Katzenellenbogen, Bhavna Bhardwaj, Henry Fang, B. Avery Ince, Farzad Pakdel，Joseph C. Reese, David Schodin and Carol K. Wrenn. Hormone binding and transcription activation by estrogen receptors:Analyses using mammalian and yeast systems. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology，1993， 47:39-48 ；
[0008] ②何世华，梁增辉，战威，贾凌志，晁福寰.环境雌激素重组酵母测评系统的建 立·环境与健康杂志，2002,19(1) :57-59 ;
[0009] ③李剑，饶凯锋，马梅，王子健.酵母双杂交技术构建重组雌激素受体相关受体 (ERR)基因酵母.环境科学学报，2011，31 (1): 33-39。
[0010] 本发明提供的环境水样中非挥发性有机物雌激素活性检测方法，包括以下步骤：
[0011] 步骤一：通过固相萃取的方法，对水中的微量有机物进行吸附、富集，然后进行洗 脱、浓缩，得到浓缩有机物样本。
[0012] 步骤二：酵母菌增殖培养基、测试培养基和酵母菌液的制备。
[0013] ①酵母菌增殖培养基为液体培养基，每升包括以下成分：
[0014] KH2P0411. 5 ?13. 5g ;
[0015] (NH4)2S041. 5 ?2. 0g ;
[0016] K0H3.5?4.2g;
[0017] MgS040. 12 ?0· 22g ;
[0018] Fe2 (S04) 30. 65 ?0· 80mg ;
[0019] L-白氨酸 31 ?50mg ;
[0020] L-组氨酸 40 ?6〇mg ;
[0021] 腺噪呤 33 ?50mg ;
[0022] L-精氨酸-HC1 15 ?22mg ;
[0023] L-甲硫氨酸15?22mg ;
[0024] L-酪氨酸 22 ?35mg ;
[0025] L-异亮氨酸22?35mg ;
[0026] L-赖氨酸-HC1 22 ?35mg ;
[0027] L_苯丙氨酸19?25mg ;
[0028] L-谷氨酸 85 ?92mg ;
[0029] L_ 缴氛酸 130 ?156mg ;
[0030] L-丝氨酸 310 ?350mg ;
[0031] L-天门冬氨酸90?llOmg ;
[0032] 维生素 ΒΙΟ. 3 ?0· 5mg ;
[0033] 维生素 Β60· 3 ?0· 5mg ;
[0034] 维生素 Β30· 3 ?0· 5mg ;
[0035] 内消旋肌醇 Myo-inositoll. 1 ?3. 3mg ;
[0036] Biotin 维生素 Η 0· 3 ?0· 5mg ;
[0037] L-苏氨酸 1· 9 ?2. 8g ;
[0038] 硫酸铜5?9mg ;
[0039] 葡萄糖18?22g ;
[0040] 酵母菌增殖培养基的配制方法：在1升超纯水中依次加入以上各种成分，通过震 荡使先加入的成分溶解后，再加入后一成分，直至最后成分溶解，混匀；再加入显色底物 β -D半乳糖苷氯酚红（CPRG) 100mg，即得到酵母菌增殖培养基；酵母菌增殖培养基配制完 毕后应过滤除菌。
[0041] ②酵母菌液的制备：将雌激素受体重组酵母菌株接种至酵母菌增殖培养基后， 30°C振荡培养24h?48h得到酵母菌液，在此酵母菌液加入甘油，酵母菌液与甘油的体积比 85 :15,混匀后每2mL分装于1支无菌EP管中，保存于-80°C低温冰箱。
[0042] ③测试培养基的配制：取50mL酵母菌增殖培养基加至无菌三角瓶中，从一 80°C冰 箱取含酵母菌液的EP管一支，将其解冻后取0. 2mL加入到酵母菌增殖培养基中，30°C摇床 中培养12?36h，在每升新配制的酵母菌增殖培养基中加入15?25mL培养了 12?36h 的酵母菌液，形成测试培养基，所加酵母菌液浓度需至少满足以下一条：①显微镜下计数约 4X 107个/mL ;②波长640nm吸光度值为0. 8?1. 2。
[0043] 步骤三：以17β_雌二醇作为阳性对照物，将雌二醇、浓缩有机物样本分别与重组 酵母菌共同培养；即每次试验均设阳性对照（17 β-雌二醇）和阴性对照（即溶剂对照，丙 酮或无水乙醇）。每个受试水样至少设置三组平行对照。阳性对照、阴性对照和受试水样均 由所设置的浓度梯度进行倍比稀释，然后将其置于无菌环境中，待溶剂挥发干燥后各加入 200 μ L测试培养基，于30°C培养72h后，测量540nm和640nm吸光度值。
[0044] 步骤四：以阳性对照物17β_雌二醇浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制阳 性对照标准曲线，得到拟合曲线及其方程，各测试水样的吸光度值则带入所得方程计算得 出17 β-雌二醇当量水平；
[0045] 步骤五：对于具有雌激素活性的水样，采用水样量评价法和阳性物当量法来评价 和比较其中有机物雌激素活性的强度。
[0046] 水样量评价法：
[0047] 即产生与阳性物同等效应所需要浓缩的水样量。用EC25-E2表示各水样中非挥发 性有机物的雌激素活性相当于阳性对照物17 β -雌二醇产生效应最大值1/4 (l/4E2max)时 所需要的水样量（mL)，其值越�。硎舅蟹腔臃⑿杂谢衔锏拇萍に鼗钚栽礁�。将 540nm下的吸光度与640nm下的吸光度相除以消除菌液浓度的影响，取校正后的吸光度与 水样量进行曲线拟合，从所得的方程中求出产生与阳性对照物17 β -雌二醇最大效应相当 的25%活性的水样量，即EC25-E2，以mL表示。
[0048] 阳性物当量法：
[0049] 雌二醇当量（EEQs)表示一定体积水样的雌激素活性水平所对应的相当效应的阳 性对照物17 β -雌二醇浓度，值越大其雌激素活性越强。将540nm下的吸光度减去640nm 下的吸光度以消除菌液浓度的影响，取校正后的阳性对照组阳性对照物17 β-雌二醇吸光 度最大值作为100%雌激素效应，对校正后的阳性对照吸光度系列进行曲线拟合，从所得的 方程中求出50%雌激素效应的对应的阳性对照物17 β -雌二醇浓度（ng)，再对校正后的样 品吸光度系列进行曲线拟合，求出50%雌激素效应的水样的量（L)，由此计算得出各水样 的EEQs,结果以ng/L表示。
[0050] 本发明提供的检测方法可用于：①检测、评价与比较不同水体中有机物的雌激素 活性强度水平。②水环境中多种、微量混合有机物综合的雌激素活性检测与评价。③使水中 非挥发性有机物雌激素活性作为城镇自来水厂、污水处理厂评价水处理工艺效果的指标， 方便其选择适合去除环境内分泌干扰物的水处理工艺和方法。
[0051] 本发明方法具体操作：
[0052] 环境水样收集：收集容器：5L棕色玻璃瓶（预处理方法），玻璃器皿的预处理如 下：使用前需浸泡浓硫酸重铬酸钾洗液24h，取出以超纯水冲洗至少3次洗净，置于450°C烘 烤2h。
[0053] 环境水样中非挥发性有机物提取方法：
[0054] C18柱的活化
[0055] 活化：使用5mL甲醇（色谱纯）浸润lOmin后，以5mL/min的速率抽滤，重复两次； 再使用5mL超纯水浸润lOmin后，以5mL/min的速率抽滤，重复两次。
[0056] 水样过柱：各水样以约2mL/min的流速通过活化完毕的C18柱富集水样中的有机 物。全程监测TOC以确保吸附柱的未饱和。
[0057] 有机物提取：有机物的提取按照以下步骤依次进行：
[0058] ①淋洗：使用5mL超纯水以5mL/min的速率抽滤；
[0059] ②冷冻干燥：将淋洗之后的C18柱放置于真空冷冻干燥机中冻干3h ;
[0060] ③洗脱：使用2mL甲醇（色谱纯）浸润lOmin后，以lmL/min的速率抽滤,重复一 次；再使用2mL二氯甲烷（色谱纯）浸润lOmin后，以lmL/min的速率抽滤；最后使用2mL 正己烷（色谱纯）浸润lOmin后，以lmL/min的速率抽滤。
[0061] ④将所得的洗脱液置于氮吹仪中，40°C，氮吹至干品；
[0062] ⑤溶剂定容，使用无水乙醇或者丙酮定容，定容后使得0. lmL溶液中含250mL水样 的有机物；
[0063] ⑥把定各后的样品放直于4 C冰箱中避光保存。
[0064] 培养基的配制
[0065] 每升酵母菌增殖培养基成分包括以下成分：
[0066] ΚΗ2Ρ0411· 5 ?13. 5g ; (NH4)2S041. 5 ?2. Og ;KOH 3. 5 ?4. 2g ;MgS040. 12 ?0· 22g ; Fe2(S04)30. 65 ?0· 80mg ;L_ 白氨酸 31 ?50mg ;L_ 组氨酸 40 ?60mg ;腺噪呤 33 ?50mg ; L_精氨酸-HC1 15?22mg ;L-甲硫氨酸15?22mg ;L-酪氨酸22?35mg ;L-异亮氨酸22? 35mg ;L-赖氨酸-HC1 22?35mg L-苯丙氨酸19?25mg ;L-谷氨酸85?92mg ;L-纟颜氨酸 130?156mg ;L_丝氛酸310?350mg ;L_天门冬氛酸90?llOmg ;维生素 B10. 3?0· 5mg ; 维生素 B60. 3 ?0· 5mg ;维生素 B30. 3 ?0· 5mg ;内消旋肌醇 Myo-inositoll. 1 ?3. 3mg ; Biotin维生素 Η 0· 3?0· 5mg ;L_苏氨酸1. 9?2. 8g ;硫酸铜5?9mg ;葡萄糖18?22g。
[0067] 在1升超纯水中依次加入以上各个物质，边加边震荡混匀。之后加入显色底物 β-D半乳糖苷氯酚红（CPRG)lOOmg。酵母菌增殖培养基配置完毕后应过滤除菌。
[0068] 测试培养基的配制：
[0069] 在每升增殖培养基中加入15?25mL培养了 12?36h酵母菌液形成测试培养基。 所加酵母菌液浓度（需至少满足以下一条）：①显微镜下计数约4X107个/mL;②吸光度值 (640nm)为 0· 8 ?1. 2。
[0070] 有机物的雌激素活性检测
[0071] 试验组设阳性对照物17 β_雌二醇、阴性对照（即溶剂对照，丙酮或无水乙醇）和 环境水样有机浓缩物待测组。在无菌96孔板中将阳性对照组、阴性对照组和受试水样组均 由设置浓度梯度进行倍比稀释。将96孔板置于无菌环境中待溶剂挥发干燥后每孔各加入 200 μ L测试培养基后置于生化培养箱中30°C培养72h后测量540nm和640nm吸光度值。
[0072] 结果计算：
[0073] 1. EC25_E2 :将540nm下的吸光度与640nm下的吸光度相除以消除菌液浓度的影响， 取校正后的吸光度与水样量进行多项式拟合：
[0074]
【权利要求】
1. 一种环境水中非挥发性有机物雌激素活性检测方法，包括以下步骤： 步骤一、通过固相萃取的方法，对待测水样中的微量有机物进行吸附、富集，然后进行 洗脱、浓缩，得到浓缩有机物样本； 步骤二、酵母菌增殖培养基、酵母菌液和测试培养基的制备： ① 酵母菌增殖培养基为液体培养基，每升包括以下成分： ΚΗ2Ρ0411· 5 ?13. 5g ; (NH4)2S041.5 ?2.0g; KOH 3· 5 ?4. 2g ; MgS040. 12 ?0· 22g ; Fe2 (S04) 30. 65 ?0. 80mg ; L -白氨酸31?50mg ; L -组氨酸40?60mg ; 腺嘌呤33?50mg ; L -精氨酸-HC1 15 ?22mg ; L -甲硫氨酸15?22mg ; L -酪氨酸22?35mg ; L -异亮氨酸22?35mg ; L -赖氨酸-HC1 22 ?35mg ; L -苯丙氨酸19?25mg ; L -谷氨酸85?92mg ; L -纟颜氨酸130?156mg ; L -丝氛酸310?350mg ; L -天门冬氨酸90?llOmg ; 维生素 B10. 3?0· 5mg ; 维生素 B60. 3?0· 5mg ; 维生素 B30. 3?0· 5mg ; 内消旋肌醇 Myo - inositoll. 1 ?3. 3mg ; Biotin 维生素 Η 0· 3 ?0· 5mg ; L -苏氨酸9?2. 8g ; 硫酸铜5?9mg ; 葡萄糖18?22g ; 通过震荡使先加入的成分溶解后，再加入后一成分，直至最后成分溶解，混匀，再加入 显色底物β -D半乳糖苷氯酚红（CPRG)lOOmg，即得到酵母菌增殖培养基，酵母菌增殖培养 基配制完毕后应过滤除菌； ② 酵母菌液的制备:将雌激素夸体重纟目酵母菌株接种至酵母菌增葙培养某后，30°C振 荡培养24h?48h得到酵母菌液，在此酵母菌液加入甘油，酵母菌液与甘油的体积比85 : 15,混匀后每2mL分装于1支无菌EP管中，保存于-80°C低温冰箱； ③ 测试培养基的配制：取50mL酵母菌增殖培养基加至无菌三角瓶中，从一 80°C冰箱取 含酵母菌液的EP管一支，将其解冻后取0. 2mL加入到酵母菌增殖培养基中，30°C摇床中培 养12?36h ;在每升新配制的酵母菌增殖培养基中加入15?25mL培养了 12?36h的酵母 菌液，形成测试培养基，所加酵母菌液浓度需至少满足以下一条：①显微镜下计数约4X 107 个/mL ;②波长640nm吸光度值为0· 8?1. 2 ; 步骤三：以17β -雌二醇作为阳性对照物，将雌二醇、浓缩有机物样本分别与重组酵母 菌共同培养；即每次试验以17β -雌二醇为阳性对照，以丙酮或无水乙醇为阴性对照，每个 受试水样至少设置三组平行对照，阳性对照、阴性对照和受试水样均由所设置的浓度梯度 进行倍比稀释，然后将其置于无菌环境中，待溶剂挥发干燥后各加入200 μ L测试培养基， 于30°C培养72h后，测量波长540nm和640nm吸光度值； 步骤四：以阳性对照物17β -雌二醇浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制阳性 对照标准曲线，得到拟合曲线及其方程，各测试水样的吸光度值则带入所得方程计算得出 17 β -雌二醇当量水平； 步骤五：对于具有雌激素活性的水样，采用水样量评价法或/和阳性物当量法来评价 和比较水样中有机物雌激素活性的强度。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的采用水样量评价法来评价和比较 水样中有机物雌激素活性的强度的具体方法是：用EC25 -Ε2表示各水样中非挥发性有机物 的雌激素活性相当于阳性对照物17 β -雌二醇产生效应最大值1/4 (l/4E2max)时所需要的 水样量（mL)，其值越小，表示水样中非挥发性有机化合物的雌激素活性越高。将540nm下的 吸光度与640nm下的吸光度相除以消除菌液浓度的影响，取校正后的吸光度与水样量进行 曲线拟合，从所得的方程中求出产生与阳性对照物17β -雌二醇最大效应相当的25%活性 的水样量，即EC25 - Ε2,以mL表示。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的采用阳性物当量法来评价和比较 水样中有机物雌激素活性的强度的具体方法是：雌二醇当量（EEQs)表示一定体积水样的 雌激素活性水平所对应的相当效应的阳性对照物17 β -雌二醇浓度，值越大其雌激素活性 越强，将540nm下的吸光度减去640nm下的吸光度以消除菌液浓度的影响，取校正后的阳 性对照组阳性对照物17 β -雌二醇吸光度最大值作为100%雌激素效应，对校正后的阳性 对照吸光度系列进行曲线拟合，从所得的方程中求出50%雌激素效应的对应的阳性对照物 17β -雌二醇浓度（ng)，再对校正后的样品吸光度系列进行曲线拟合，求出50%雌激素效 应的水样的量（L)，由此计算得出各水样的EEQs，结果以ng/L表示。
【文档编号】G01N21/78GK104267025SQ201410476553
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月18日 优先权日:2014年9月18日
【发明者】唐非, 鲁翌, 吕学敏 申请人:华中科技大学
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