作为抗结核病药的吡啶并嘧啶化合物的制作方法
【专利摘要】一种作为抗结核病药的吡啶并嘧啶化合物。本发明涉及小分子化合物及其在治疗细菌感染、特别是肺结核中的应用。
【专利说明】作为抗结核病药的吡啶并嘧啶化合物
[0001]本申请是申请日为2009年6月17日、申请号为200980128440.2、发明名称为“作为抗结核病药的吡啶并嘧啶化合物”的发明专利申请的分案申请。
[0002]本发明涉及小分子化合物及其在治疗细菌感染、特别是肺结核中的应用。
[0003]发明背景
[0004]肺结核(TB)作为疾病每年持续导致数以百万计的死亡。化疗的不充分应用已经导致抗药性病例的数量逐步增加。这种情况可能恶化对所有目前已知药物的极端耐药性株的出现(Van Rie和Enarson，2006)。国际上推荐的TB控制策略、也称作直接观察到的短程化疗(DOTS)依赖于5种抗菌药的组合服用超过6个月的延长期限(http://www.wh0.1nt/tb/dots/en/)。由于使用了数学模型、考虑到了治疗期限和TB动力学，所以预测减少治疗期限的有益性是显著的并且能够极大地促进总体TB负担下降(Salomon等人，2006)。
[0005]目前化疗由通过中和一般信息途径和关键过程(例如RNA聚合和蛋白质合成抑制)或通过干扰分枝杆菌特异性细胞包膜合成直接祀向结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)杆状菌的化合物组成。最广泛使用的专用抗结核药异烟肼、乙硫异烟胺和吡嗪酰胺是第一种需要活化的前体药物。当活性成分形成时，它们显示对尚未完全得到表征的广泛分枝杆菌靶标的抑制活性。就其他慢性感染性疾病(如人免疫缺陷病毒)而言，迄今为止经证实多-疗法手段(包括靶向结核分枝杆菌广泛关键特征的药物)是最成功的策略。因此，可能的情况是具有对结核分枝杆菌不同作用机制的目前药物抑制剂的组合会解决控制疾病的问题。
[0006]用于研发新抗-TB药的最具有挑战性的手段依赖于筛选靶向杆状菌存活必需的关键特征的活性化合物。尽管仍然缺乏对在人体中结核杆菌持久性后面的生物学机制即潜在菌的位置和状态的理解，但是认为结核分枝杆菌居留于低氧条件下的初期肉芽肿中(Lenaerts等人,2007)并且隐藏于各种类型的细胞内(Houben等人,2006 ;Neyrolles等人，2006)。杆状菌主要位于吞噬细胞例如巨噬细胞和树突细胞内部，并且显然已经确立与胞外条件中的生长相比，结核杆菌采取了宿主巨噬细胞吞噬体内的不同表型(Rohde等人，2007 ;Schnappinger等人,2003)。在感染时,诱导炎症应答，由此开始募集释放白细胞介素和细胞因子的T淋巴细胞，由此活化感染的巨噬细胞以便能够破坏病原体。在适合的触发后，宿主巨噬细胞由此能够消除侵入的杆状菌。这一结果进一步得到如下事实的支持:吸入结核分枝杆菌的人有95%以上不发病，从而启示在大部分病例中人体宿主应答足以阻止结核分枝杆菌诱导的发病机制。这产生如下推定:小分子化合物可以模拟免疫细胞应答信号并且诱导宿主细胞清除分枝杆菌。
[0007]因此，本发明的一个目的在于研发适合于高流通量筛选的基于表型细胞的测定法，所述高流通量筛选能够搜索到可以预防结核分枝杆菌在宿主巨噬细胞内部繁殖的化合物。
[0008]迄今为止，这种类型的结核杆菌在宿主细胞内的生长研究依赖于宿主细胞裂解后的菌落形成单位(CFUs)测定、然后是系列稀释和细菌在琼脂板上生长所需的3-周温育期限。已经证实表达荧光素酶的分枝杆菌有效减少实验期限，不过，仍然需要细胞裂解和荧光素底物添加步骤(Arain等人，1996)。此外，这些类型的实验不易于进行大规模筛选。
[0009]本发明的另一个目的在于鉴定对细菌感染有效的化合物，特别是可以预防结核分枝杆菌在宿主巨噬细胞内繁殖的化合物。
[0010]本发明的描述
[0011]本发明在一个方面中涉及具有通式VIII的化合物:
[0012]
【权利要求】
1.筛选方法，其包括下列步骤: (a)用经荧光标记的结核分枝杆菌分批感染宿主细胞； (b)除去游离的未结合的分枝杆菌； (c)将待测试的化合物添加到多孔板上； (d)将感染了经荧光标记的结核分枝杆菌的所述宿主细胞接种入包含所述化合物的所述多孔板； (e)温育包含感染了经荧光标记的结核分枝杆菌的宿主细胞和所述化合物的所述多孔板； (f)荧光标记所述宿主细胞； (g)使用自动化共焦显微镜检查分析所述多孔板。
2.权利要求1的方法，其中所述筛选方法寻找干扰在所述宿主细胞内结核分枝杆菌繁殖的化合物。
3.权利要求1或2的方法，其中所述宿主细胞为巨噬细胞，优选地活巨噬细胞。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述自动化共焦荧光显微镜检查测量胞内分枝杆菌生长。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中步骤(g)包括，对于每一种化合物，测量: -总宿主细胞数目，例如总巨噬细胞数目； -被感染的宿主细胞的百分比；和/或 -感染抑制百分比。
6.权利要求5的方法，其中: (i)低的(总)细胞数目表明了所述化合物的毒性和/或在巨噬细胞内结核分枝杆菌的不受限制的生长； (?)高的(总)细胞数目表明了所述化合物是非毒性的并且阻止分枝杆菌生长。
7.前述权利要求中任一项的方法，其包括使用选自下列中的至少一个的对照: -替代步骤(C)中的化合物，添加具有已知的抗结核病活性的化合物(作为阳性对照)，例如异烟肼、利福平、乙硫异烟胺或莫西沙星； -替代步骤(c)中的化合物，添加DMSO或抗生素对照(作为阴性对照)。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述结核分枝杆菌用GFP进行标记。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述宿主细胞用SYT060进行标记。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤(b)之后，用抗生素，优选地阿米卡星进行温育。
11.前述权利要求中任一项的方法，其用于大规模化学品库的高流通量筛选(HTS)。
12.在权利要求1至11中任一项的方法之中鉴定出的化合物，其干扰在宿主细胞内，优选地在宿主巨噬细胞内结核分枝杆菌的繁殖。
13.权利要求12的化合物，其由下式所示:
N—Nο
【文档编号】G01N21/64GK103983627SQ201410219962
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2009年6月17日 优先权日:2008年6月17日
【发明者】P·布罗丹, T·克里斯托夫, 卢载成, 金在昇, A·热诺韦西奥, D·P·C·费尼斯坦, 全希暻, F·A·埃旺, 姜善姬, 李世渊, 徐旼廷, 朴垠铮, M·孔特雷拉斯多明格斯, 南芝娟, 金恩惠 申请人:韩国巴斯德研究所, 国家健康与医学研究院
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