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使用脂肪组织衍生的干细胞的神经发生筛选方法和系统的制作方法
【专利摘要】本发明提供的是用于鉴定神经发生-调节化合物的方法，包括：在候选化合物存在时培养脂肪衍生的干细胞(ADSC)，和确定ADSC中的神经发生程度；以及用于鉴定神经发生调节化合物的系统。还提供的是促进ADSC中的神经发生的方法。
【专利说明】使用脂肪组织衍生的干细胞的神经发生筛选方法和系统

【技术领域】
[0001] 本公开内容涉及用于鉴定神经发生-调节化合物（例如促进或抑制神经发生的化 合物）的方法。更具体地讲，本公开内容涉及使用脂肪衍生的干细胞（ADSC)、更尤其是人脂 肪衍生的干细胞（hADSC)鉴定神经发生-调节化合物的方法。

【背景技术】
[0002] 脑营养素在婴儿、儿童以及孕妇和哺乳期妇女的饮食中已经成为日益重要的添加 齐U，因为它们能够促进早期脑发育。另外，一直都在寻找用于治疗神经变性性疾病或脑损伤 的化合物。需要鉴定神经毒性化合物，例如环境毒素、工业毒素或饮食毒素，以便除去或减 少对这类化合物的暴露。发现这样的营养素和毒素的方法通常特别耗时和低效。因此，需 要提供用于鉴定具有神经学开发效益的化合物的可靠、稳定而快速的方法。另外，需要鉴定 对神经有害的化合物。
[0003] 已经证明了干细胞（例如脂肪衍生的干细胞（ADSC))可以以可复制的方式分化为 多种成熟细胞表型，包括神经元细胞。具体地讲，在人类脂肪衍生的干细胞（hADSC)中已经 证明了这一点。hADSC是特别有用的研究工具，因为它们容易得自商业来源或抽脂术，并且 它们并不牵涉使用胚胎干细胞所产生的相同可能的争议。此外，hADSC容易得自单个患者， 因而提供个性化医疗的机会。


【发明内容】

[0004] 本公开内容一方面提供使用ADSC来鉴定神经发生-调节化合物的方法。所述方 法用于鉴定可用于补充婴儿、儿童、孕妇和哺乳期妇女的饮食的潜在的脑营养素。本方法还 用于鉴定用于治疗神经病和神经损伤的潜在药物候选物。最后，本方法用于鉴定可能具有 神经毒性的化合物，例如对胎儿、婴儿和儿童的神经发育有害的化合物。神经毒性化合物还 可能促成神经病或可能干扰对神经病和损伤的治疗和康复。
[0005] 因此，在某些实施方案中，本公开内容提供用于鉴定神经发生-调节化合物的方 法，包括：在候选化合物存在时培养脂肪衍生的干细胞（ADSC);和确定ADSC中的神经发生 程度。前述方法可以进一步包括在所述候选化合物不存在时培养ADSC，确定在所述候选 化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度，并且将在所述候选化合物存在时培养的 ADSC中的神经发生程度与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度进行 比较。在某些实施方案中，所述脂肪衍生的干细胞是人脂肪衍生的干细胞（hADSC)。
[0006] 不受任何具体理论的束缚，认为与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的 神经发生程度相比，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度增加，表明所 述候选化合物是神经发生-促进化合物。另一方面，与在所述候选化合物不存在时培养的 ADSC中的神经发生程度相比，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度减 少，表明所述候选化合物是神经发生-抑制化合物。
[0007] 在某些实施方案中，所述方法进一步包括在已知神经发生-促进化合物例如 二十二碳六烯酸（DHA)存在时培养ADSC，确定在DHA存在时培养的ADSC的神经发生程度， 并且将在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度与在DHA存在时培养的 ADSC中的神经发生程度进行比较，其中与在DHA存在时培养的ADSC中的神经发生程度相 t匕，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度增加，表明所述候选化合物是 神经发生-促进化合物。
[0008] 在某些实施方案中，神经发生程度是通过观测ADSC的细胞形态学变化而确定。细 胞形态学的变化包括但不限于细胞质收缩、神经突形成、树突样突出的形成、轴突形成或其 任何组合。细胞形态学的变化可通过细胞分析或目测的任何方法而确定。例如，细胞形态 学的变化可通过显微镜例如相差显微术而观测。在其它实施方案中，神经发生程度通过观 测指示神经发生的细胞生物标记而确定。
[0009] 在任何前述方法中，在所述候选化合物存在时培养ADSC足以发生神经发生的一 段时间，例如大约1至大约5天。此外，可以在升高的温度例如大约25至大约45°C下培养 ADSC。
[0010] 用于培养ADSC的培养器皿可包含促进或支持神经发生的涂层（coating)，例如模 拟中枢神经环境的涂层。例如，培养器皿可包含包括多聚-L-鸟氨酸和牛纤连蛋白的涂层。 [0011] 在某些实施方案中，用于培养ADSC的培养基促进或支持神经发生。例如，所述培 养基可包含神经基础培养基、表皮生长因子（EGF)、碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF)、N2 补充物和L-谷氨酰胺。
[0012] 在某些实施方案中，所述方法包括在所述候选化合物存在时培养所述细胞之前， 在启动培养基（priming medium)中启动ADSC大约1至大约5天。所述启动培养基可包含 神经基础培养基、EGF、b-FGF和N2补充物。启动之后，ADSC可以在包含完全MesenPRO和 所述候选化合物的培养基中培养大约1至大约5天。
[0013] 本公开内容的另一方面提供促进ADSC中的神经发生的方法，包括：在神经发生促 进化合物存在时培养ADSC。在某些实施方案中，所述方法进一步包括确定ADSC中的神经发 生程度。
[0014] 本公开内容的再一方面涉及用于鉴定神经发生-调节化合物的系统，包括：ADSC ; 包含模拟中枢神经系统的涂层的培养器皿；和促进神经发生的培养基。用于培养器皿的涂 层可包含例如，牛纤连蛋白和多聚-L-鸟氨酸。所述培养基可包含神经基础培养基、EGF、 b-FGF、N2补充物和L-谷氨酰胺。在其它实施方案中，所述系统包括:ADSC、包含模拟中枢 神经系统的涂层的培养器皿、启动培养基和培养基。所述启动培养基可包含神经基础培养 基、EGF、b-FGF和N2补充物，而所述培养基可包含完全MesenPRO。
[0015] 附图简沭 图1是描绘根据本公开内容的实施方案的快速神经元分化平台（RNDP)的图解。将 hADSC在合适的培养基和合适量的候选化合物中（处理）培养24-72小时。然后评价hADSC 以确定神经发生程度。
[0016] 图2是描绘根据本公开内容的实施方案的扩展的神经元分化平台（ENDP)的图解。 将hADSC在合适的启动培养基中培养至多3天。然后将启动培养基更换为合适的培养基 (分化培养基）和合适量的候选化合物并培养1-5天。然后评价hADSC以确定神经发生程 度。
[0017] 图3A描绘了对照实验中的ADSC的相差图像。图3B描绘了脑营养素处理后的ADSC 的相差图像。
[0018] 图4A是来自细胞表达研究的对照图像，其中细胞用针对微管相关蛋白2 (MAP2) (一种神经元标记）的抗体染色。图4B是在MAP2表达研究中的脑营养素处理后图像。红 色荧光（用白色条纹指示）显示MAP2的表达。
[0019] 图5A是来自细胞表达研究的对照图像，其中细胞用针对巢蛋白（一种神经元标 记）的抗体染色。图5B是在巢蛋白表达研究中的脑营养素处理后图像。红色荧光（用白 色条纹指示）显示巢蛋白的表达。
[0020] 图6A是来自细胞表达研究的对照图像，其中细胞用针对胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)(-种神经元标记）的抗体染色。图6B是在GFAP表达研究中的脑营养素处理后图 像。红色荧光（用白色条纹指示）显示GFAP的表达。
[0021] 图7A是来自细胞表达研究的对照图像，其中细胞用针对β III微管蛋白（一种神 经元标记）的抗体染色。图7Β是在β III微管蛋白表达研究中的脑营养素处理后图像。红 色荧光（用白色条纹指示）显示β III微管蛋白的表达。
[0022] 实施本发明的最伴方式 本公开内容提供用于鉴定神经发生-调节化合物的方法，包括：在候选化合物存在时 培养脂肪衍生的干细胞（ADSC)，和确定ADSC中的神经发生程度。
[0023] "神经发生"是指在体外或体内自干细胞或祖细胞向神经细胞的分化、产生或增 殖。神经发生程度可通过本领域已知的多种技术来确定，例如通过观测细胞形态学变化。细 胞分析或目测的任何方法都适用于本方法。例如，可使用显微镜技术例如相差显微术观测 ADSC的形态学变化。指示神经发生的形态学变化包括但不限于细胞质收缩以及神经突、轴 突和树突的存在。在其它实施方案中，通过观测指示神经发生的细胞生物标记，例如通过使 用生物标记表达实验，确定神经发生程度。这样的生物标记的实例包括但不限于蛋白质例 如神经丝、髓鞘碱性蛋白、微管相关蛋白2(MP2)、巢蛋白、β-III微管蛋白、胶质纤维酸性 蛋白（GFAP)、S100 (-种钙结合蛋白）、CNPase和GABA受体。
[0024] "神经发生-调节化合物"是指通过促进或抑制神经发生而影响神经发生的化合 物。因此，在某些实施方案中，神经发生-调节化合物促进神经发生（"神经发生-促进化合 物"），而在其它实施方案中，神经发生-调节化合物抑制或减少神经发生（"神经发生-抑 制化合物")。鉴定为促进神经发生的化合物可以有利地用作婴儿、儿童、孕妇和哺乳母亲的 饮食补充物，以促进和支持早期脑发育。这些化合物也可用于治疗神经变性疾病或神经损 伤。鉴定为抑制神经发生的化合物可以是从婴儿、儿童、孕妇和哺乳期妇女的饮食和环境中 需要避免或去除的潜在毒素。这些化合物还可能干扰神经病或损伤的治疗和康复。因此， 在患有神经病或损伤的个体的饮食和环境中也可避免神经发生-抑制化合物。
[0025] "候选化合物"是指用本文所述的方法来测试神经发生-调节特性的任何化合物。 所述候选化合物包括但不限于天然存在的物质、合成的化合物或提取物，例如植物或动物 组织、真菌或细菌的提取物。可以单独测试所述候选化合物或可与其它候选化合物或已知 的神经发生-调节化合物组合测试，以观测协同效应或达到更高通量的化合物筛选。
[0026] 在某些实施方案中，所述方法进一步包括提供ADSC的阴性对照培养物，用于与候 选化合物进行比较。因此，所述方法进一步包括在所述候选化合物不存在时培养ADSC，确 定在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度，和将在所述候选化合物存 在时培养的ADSC中的神经发生程度与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发 生程度进行比较。与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度相比，在所 述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度增加，表明所述候选化合物是神经发 生-促进化合物。另一方面，与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度 相比，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度减少，表明所述候选化合物 是神经发生-抑制化合物。阴性对照培养物提供了所述候选化合物的神经发生调节性质的 额外的相关信息。
[0027] 在其它实施方案中，所述方法进一步包括提供阳性对照培养物。因此，所述方法进 一步包括在已知神经发生-促进化合物存在时培养ADSC，和确定在所述神经发生-促进化 合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度。例如，DHA已知能促进早期脑发育并且可用作 阳性对照。因此，所述方法可以进一步包括在DHA存在时培养ADSC。与在DHA存在时培养 的ADSC中的神经发生程度相比，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度 增加，表明所述候选化合物是优于DHA的神经发生-促进化合物。
[0028] 在神经发生期间，ADSC可以分化为神经元细胞、神经元细胞的祖细胞和具有神经 元性能的细胞。因此，神经发生程度可通过观测细胞形态学变化而确定。指示神经发生的 细胞形态学的变化包括但不限于细胞质收缩、神经突形成、树突样突出形成、轴突形成或其 组合。指示神经发生的细胞形态学的其它变化包括类似于两极、三极和多极神经元细胞的 形态学发育。
[0029] 前述细胞形态学的变化可通过显微镜技术例如通过相差显微术来观测。ADSC的相 差显微术图像可在ADSC培养期间多次采集。例如，可在与候选化合物培养之前、在加入候 选化合物之后一次或多次例如之后3小时、和此后每天一次采集图像。
[0030] 神经发生程度可以进一步通过测定显示神经元分化的ADSC百分率和细胞中的细 胞质突出例如神经突、轴突和树突的长度而确定。可使用具有合适插件的Image J开放软 件测定显示神经元分化的ADSC百分率和细胞质突出的长度。
[0031] 在神经发生期间发生细胞生物标记的变化。因此，在某些实施方案中，神经元标记 的细胞表达研究用于确定神经发生程度。这样的生物标记的实例包括但不限于蛋白质例如 神经丝、髓鞘碱性蛋白、巢蛋白、β-ΙΙΙ微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白（GFAP)、S100 (-种 钙结合蛋白）、微管相关蛋白2 (MAP2)、CNPase和GABA受体。确定神经元分化的其它技术 包括神经元标记的免疫组织染色、神经元兴奋性测定和用于神经蛋白表达的蛋白质印迹。
[0032] 在某些实施方案中，所述ADSC是人脂肪衍生的干细胞（hADSC)。hADSC可以有利 地维持在培养基中并且容易传代，以提供多个传代培养物。此外，hADSC容易得到，因为它 们可分离自在常规抽脂术期间采集的人脂肪组织并可冷冻保存。hADSC具有容易得自个体 患者的额外优势。这样获得的hADSC可用于本文所述的方法以筛选候选化合物，用于个性 化使用。因此，使用本公开内容的方法可以实现个性化和优化营养、药物治疗或对神经毒素 的敏感性的测定。
[0033] 可以培养ADSC足以发生神经发生的时间。神经发生可在不同时间观测，这取决于 所测的脑营养素。因此，在某些实施方案中，神经发生可以在培养数小时后观测，而在其它 实施方案中，神经发生可以在培养若干天后观测。例如，ADSC可以培养大约1小时至大约5 天、大约1小时至大约3天、大约3小时至大约36小时、大约12小时至大约24小时、或大 约24至大约36小时。此外，ADSC的培养可以持续1、2、3或4周，以达到更完全的神经元 分化。ADSC的培养可以进一步在升高的温度例如高于室温的温度下进行。这样的温度包括 大约25至大约45°C、大约30至大约40°C、或大约37°C。
[0034] 在前述方法中，ADSC可以在支持或促进神经发生（例如通过引导ADSC分化为神 经元细胞）的培养基中有利地培养。在某些实施方案中，所述培养基包含神经基础培养基、 表皮生长因子（EGF)、碱性成纤维细胞生长因子b-FGF、N2补充物和L-谷氨酰胺。培养基 的成分是市售来源可得的。例如，神经基础培养基可以是Neurobasal?培养基，其可得自 Invitrogen。神经基础培养基?可包括下表1所列出的成分： 表 1 :Neurobasal? 培养基

【权利要求】
1. 用于鉴定神经发生-调节化合物的方法，包括： 在候选化合物存在时培养脂肪衍生的干细胞（ADSC);和 确定ADSC中的神经发生程度。
2. 权利要求1的方法，进一步包括： 在所述候选化合物不存在时培养ADSC， 确定在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度，和 将在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度与在所述候选化合物不存 在时培养的ADSC中的神经发生程度进行比较。
3. 权利要求2的方法，其中与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生 程度相比，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度增加，表明所述候选化 合物是神经发生-促进化合物。
4. 权利要求2的方法，其中与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生 程度相比，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度减少，表明所述候选化 合物是神经发生-抑制化合物。
5. 权利要求1的方法，进一步包括： 在二十二碳六烯酸（DHA)存在时培养ADSC， 确定在DHA存在时培养的ADSC的神经发生程度；和 将在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度与在DHA存在时培养的 ADSC中的神经发生程度进行比较，其中与在DHA存在时培养的ADSC中的神经发生程度相 t匕，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度增加，表明所述候选化合物是 神经发生-促进化合物。
6. 权利要求1的方法，其中神经发生程度通过观测ADSC的细胞形态学变化而确定。
7. 权利要求6的方法，其中细胞形态学的变化是细胞质收缩、神经突形成、树突样突 出的形成、轴突形成或其组合。
8. 权利要求6的方法，其中细胞形态学的变化通过显微镜术观测。
9. 权利要求8的方法，其中细胞形态学的变化通过相差显微术观测。
10. 权利要求1的方法，其中所述脂肪衍生的干细胞是人脂肪衍生的干细胞（hADSC)。
11. 权利要求1的方法，其中所述ADSC在所述候选化合物存在时培养大约1至大约5 天。
12. 权利要求1的方法，其中所述ADSC在包含神经基础培养基、EGF、b-FGF、N2补充物 和L-谷氨酰胺的培养基中培养。
13. 权利要求1的方法，进一步包括：在所述候选化合物存在时培养所述细胞之前，在 启动培养基中启动ADSC大约1至大约5天。
14. 权利要求13的方法，其中所述启动培养基包含神经基础培养基、EGF、b-FGF和N2 补充物。
15. 权利要求13的方法，其中所述ADSC在所述候选化合物存在时培养大约1至大约 5天。
16. 权利要求15的方法，其中所述ADSC在包含完全MesenPRO的培养基中培养。
17. 权利要求1的方法，其中所述细胞在包被有多聚-L-鸟氨酸和牛血浆纤连蛋白的 培养器皿中培养。
18. 促进ADSC中的神经发生的方法，包括： 在神经发生促进化合物存在时培养ADSC。
19. 用于培养干细胞的系统，包括： 干细胞； 干细胞的培养器皿，所述培养器皿上已包被包含多聚-L-鸟氨酸和牛纤连蛋白的涂 层；和 培养基。
20. 权利要求19的系统，进一步包含启动培养基。
【文档编号】G01N33/50GK104285147SQ201380011780
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年1月25日 优先权日:2012年2月29日
【发明者】C.邝, Y.肖, Z.朱尼, E.K.佩尔斯, D.洪曼 申请人:Mjn 美国控股有限责任公司