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一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法及基于该方法的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法，包括以下步骤：(1)制备待测品的样品溶液及河豚毒素标准品溶液；(2)取样品溶液0.4mL，加入0.2mLpH维持液，将溶液pH控制在11.6~11.9区间，然后加入0.1mL衍生试剂1和0.1mL衍生试剂2，混匀，水浴加热20min，冷却至室温，加入0.1mL终止液，使溶液pH呈中性，而后用超纯水定容；取样品溶液，加入河豚毒素标准品溶液混匀，然后进行本步骤操作进行荧光衍生；(3)采用配备荧光检测器的液相色谱仪对步骤(2)荧光衍生后的样品溶液和河豚毒素标准品溶液进行分析，对样品溶液中的河豚毒素进行定性和定量。本发明同时公开适用于该方法的试剂盒。该方法用于定性、定量检测水产品中河豚毒素，结果可靠、检测限低。
【专利说明】一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法及基于该方法的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及河豚毒素检测方法及试剂盒，具体涉及一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法及基于该方法的试剂盒。
【背景技术】
[0002]河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是日本学者 Dr.Yoshizumi Tahara 于 1909 年首次从河豚肝脏中提取并发现的一种氨基全喹啉化合物神经毒素，分子量约为319.3Da。普遍存在于河豚、织纹螺、蟹、海星、虾虎鱼等海生生物，蝾螈、蛙、蛇等陆栖动物，甲藻、红藻等藻类以及细菌等生物中。TTX毒性极强，I mg等于4500MU，对哺乳类静脉注射半致死剂量LD50为2?10 μ g/kg，皮下注射LD50为10?14 μ g/kg，对人类的最低急性中毒剂量约为
0.2mg，致死摄食剂量0.6?2mg/50kg体重。由于其热稳定性高，普通烹饪手段如在100°C加热难以破坏，常常引发吃食河豚、织纹螺等中毒。小鼠生物法、酶联免疫法(ELISA)、液质联用法(LC-MS)和高效液相柱后衍生荧光检测法(HPLC-FLD)等为河豚毒素检测常用方法，但由于均存在一定的缺陷，如小鼠法不能专一地检出TTX，ELISA容易出现假阳性，LC-MS检测成本昂贵，柱后衍生HPLC-FLD需要配备柱后衍生装置和昂贵联用质谱仪确证。荧光检测技术具有背景干扰低、灵敏度高、精确、成本相对低廉的特点，因此开发一种新型荧光检测手段，将有利于促进河豚毒素的检测工作。

【发明内容】

[0003]本发明的目的之一是提供一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法，该方法用于定性、定量检测水产品中河豚毒素(TTX)，结果可靠、检测限低。
[0004]本发明的目的之二是提供基于上述河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法的试剂盒。
[0005]本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现:一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法，包括以下步骤:
(1)制备待测品的样品溶液及河豚毒素标准品溶液；
(2)荧光衍生:取样品溶液0.4m L，加入0.2m L pH维持液，将溶液pH控制在11.6?11.9区间，然后加入0.1mL衍生试剂I和0.1mL衍生试剂2，混匀，水浴加热20min，冷却至室温，加入0.1mL终止液,使溶液pH呈中性,而后用超纯水定容；取样品溶液，加入河豚毒素标准品溶液混匀，然后进行本步骤操作进行荧光衍生；
(3)定性和定量检测:采用配备荧光检测器的液相色谱仪对步骤(2)荧光衍生后的样品溶液和河豚毒素标准品溶液进行分析，对样品溶液中的河豚毒素进行定性和定量。
[0006]本发明所述步骤(I)中待测品的样品溶液的提取和纯化采用已有技术即可，例如，将待测品均质，用乙酸溶液在水浴超声提取后，所得提取液上河豚毒素亲和层析柱或WCX固体萃取柱等洗脱，获得的洗脱液经水浴氮气吹干后再制成样品溶液。[0007]本发明所述步骤(1)河豚毒素标准品溶液中河豚毒素浓度为2(T10000ng/ml。
[0008]本发明所述步骤(2)中pH维持液为2mol/L碳酸钠溶液。
[0009]本发明所述步骤⑵中衍生试剂I的pH约为12，包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之间的体积比为5: 2: 3，具体地，所述a液为次溴酸钠贮备液:0.67g溴酸钠、3.0g溴化钠，用蒸懼水溶解并定容至IOmL ;所述b液为5mol/L盐酸；所述c液为4.81mol/L氢氧化钠。
[0010]本发明所述步骤⑵中衍生试剂2为20%尿素(w/v)。
[0011]本发明所述步骤⑵中终止液为15%磷酸(w/v)。
[0012]本发明所述步骤(3)中高效液相色谱检测条件为:色谱柱:反相C-18柱；流动相:50 mmoL/L磷酸二氢铵；检测信号:激发波长233 nm,发射波长370 nm。
[0013]本发明的第二个目的通过以下技术措施来实现:基于上述河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法用试剂盒，包括以下试剂:
(1)衍生试剂1:pH约为12，包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之间的体积比为5:2: 3，所述a液为次溴酸钠贮备液:0.67g溴酸钠、3.0 g溴化钠，用蒸馏水溶解并定容至IOmL ;所述b液为5mol/L盐酸溶液，IOmL ;所述c液为4.81mol/L氢氧化钠溶液，IOmL ；
(2)衍生试剂2:20%尿素溶液(w/v)。 [0014](3) pH维持液:2mol/L碳酸钠溶液；
(4)河豚毒素标准品贮备液:100μ g/mL河豚毒素溶液，内含lmmol/L的柠檬酸盐，pH=5.0 ；
(5)终止液:15%磷酸溶液(w/v)。
[0015]本发明与现有技术相比具有以下优点:
(I)本发明首次使用次溴酸钠和尿素与河豚毒素反应，将其定量地转化为一种特定的荧光物质，与传统的使用高浓度碱碱解不同，反应在弱碱性条件下进行，反应条件比较温和。使用高效液相色谱检测时，采用柱前衍生方式，不需要配备柱后衍生装置，检测成本低。
[0016](2)本发明与已有的将河豚毒素与荧光物质(如邻苯二醛)相连接的柱前荧光衍生方法不同，不需要具有荧光信号的试剂参与反应，同时不易受其他物质的干扰，具有很强的特异性，可使用高效液相色谱检测。
[0017](3)本发明将河豚毒素衍生后，检测信号为激发波长233nm、发射波长为370nm。
[0018](4)以无毒的河豚鱼提取液加入TTX标准品0.0?μδ,荧光衍生处理后，定容至ImL，高效液相色谱测定，计算得出色谱峰信噪比为4.2，以3倍信噪比计算出本发明提供的方法的检测限，最低检测浓度可达0.008Pg/mL，灵敏度高于现有的河豚毒素检测方法。
[0019](5)本发明预制所需衍生试剂，形成试剂盒，方便了使用，同时可避免了因配制人员不同造成的试剂误差。
【专利附图】

【附图说明】
[0020]图1为河豚毒素荧光衍生反应后荧光扫描图谱:TTX经荧光衍生后，固定激发波长为233nm，扫描获得发射光谱，最大发射波长为370nm ;固定发射波长为370nm，扫描获得激发光谱，最大激发波长为232.9nm ；
图2为河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测色谱图:衍生物经高效液相色谱反相C-18柱分离，荧光检测器检测(激发波长233nm、发射波长370nm)，获得色谱图显示仅有一个主峰，次峰很小可忽略不计，说明荧光衍生物为一种单一物质。
【具体实施方式】
[0021]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施案例，对本发明所做的的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围内。
[0022]在本发明中，若非特指，所有设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。
[0023]以下实施例的河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法使用试剂盒，包括以下试剂:
(I)衍生试剂I φΗ约为12,包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之间的体积比为5:2:3，所述a液为次溴酸钠忙备液:0.67g溴酸钠、3.0 g溴化钠,用蒸懼水溶解并定容至IOmL ;所述b液为5mol/L盐酸溶液IOmL ;所述c液为4.81mol/L氢氧化钠溶液IOmL ；
衍生试剂I是现用现配，即使用时取5 mL a液，准确加入2 mL b液，密封混匀，静置5min后,准确加入3 mL c液,立即混勻，配制成衍生试剂I,其pH约为12。
[0024](2)衍生试剂2:衍生试剂2:20%尿素溶液(w/v) 12mL。
[0025](3) pH维持液:2mol/L碳酸钠溶液25mL ；
(4)河豚毒素标准品贮备液:100μ g/mL河豚毒素溶液2mL，内含lmmol/L的柠檬酸盐,pH=5.0 ；
(5)终止液:15%磷酸溶液(w/v)12mL。
[0026]TTX标准溶液:取一定量TTX标准品贮备液用蒸馏水稀释浓度在20?IOOOOng/mL之间。
[0027]实施例一结合C18固相萃取柱和WCX固相萃取柱纯化的待测样品中河豚毒素的检测
(I)样品的提取与纯化:称取均质后的河豚肉样品2g，加入10 mL0.1%乙酸，于85°C水浴超声提取10 min,再沸水浴5min,冷却后于4500 r/min离心5 min,取全部上清液过C18固相萃取柱(使用前依次用3mL甲醇、3mL0.1%乙酸活化)，再用2mL0.1%乙酸洗涤；收集全部滤过液，用氨水调节至pH=7.0，全部过WCX固相萃取柱(使用前依次用3mL10%氨甲醇、ImL水活化)，2mL水洗涤，抽干小柱，用5mL 2%乙酸-甲醇洗脱。洗脱液于80°C水浴氮气吹干后用I mL水溶解,得样品液。
[0028](2)荧光衍生:取样品液0.4mL，加入0.2mL pH维持液，混匀，使pH为11.7，再分别加入0.1mL衍生试剂1、0.ImL衍生试剂2，混匀，于75°C下水浴20min,冷却，加入0.1mL终止液使溶液PH为中性，加超纯水定容至lmL。另取0.4mL样品液，加入一定量TTX标准液后，按上述操作进行荧光衍生。
[0029](3)检测:采用配备荧光检测器的液相色谱仪对步骤(2)荧光衍生后的样品液和TTX标准品溶液进行分析，检测信号为:激发波长233nm，发射波长370nm ;使用标准加入法定量。
[0030]高效液相色谱检测条件为:色谱柱:反相C-18柱；流动相:50 mmoL/L磷酸二氢铵；检测信号:激发波长233 nm，发射波长370 nm。[0031]实施例二结合河豚毒素亲和层析柱纯化的待测样品中河豚毒素的检测
(I)样品的提取与纯化:称取均质后的河豚内脏样品2g，加入10 mL0.1%乙酸，于85°C水浴超声提取10 min,再沸水浴5min,冷却后4500 r/min离心5 min,取全部上清液,用
0.5mol/L磷酸氢二钠溶液调节pH至7.4,以2mL/min速度，全部过河豚毒素亲和层析柱(3mL规格)，分别用3mL PBS (0.0lmol/L，pH=7.4)，3mL去离子水洗涤，5mL 1%醋酸洗脱，抽干柱子。洗脱液于90°C水浴氮气吹干后用I mL水溶解，得样品液。
[0032](2)荧光衍生:取样品液0.4mL，加入0.2mL pH维持液，混匀，使pH为11.7，再分别加入0.1mL衍生试剂1、0.ImL衍生试剂2，混匀，于75°C下水浴20min,冷却，加入0.1mL终止液使溶液PH为中性，加超纯水定容至lmL。另取0.4mL样品液，加入一定量TTX标准液后，按上述操作进行荧光衍生。
[0033](3)检测:采用配备荧光检测器的液相色谱仪对步骤(2)荧光衍生后的样品溶液和TTX标准品溶液进行分析，检测信号为:激发波长233nm，发射波长370nm ;使用标准加入
法定量。
[0034]高效液相色谱检测条件为:色谱柱:反相C-18柱；流动相:50 mmoL/L磷酸二氢铵；检测信号:激发波长233 nm，发射波长370 nm。
【权利要求】
1.一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)制备待测品的样品溶液及河豚毒素标准品溶液； (2)荧光衍生:取样品溶液0.4m L，加入0.2m L pH维持液，将溶液pH控制在11.6?11.9区间，然后加入0.1mL衍生试剂I和0.1mL衍生试剂2，混匀，水浴加热20min，冷却至室温,加入0.1mL终止液,使溶液pH呈中性，而后用超纯水定容；取样品溶液,加入河豚毒素标准品溶液混匀，然后进行本步骤操作进行荧光衍生； (3)定性和定量检测:采用配备荧光检测器的液相色谱仪对步骤(2)荧光衍生后的样品溶液和河豚毒素标准品溶液进行分析，对样品溶液中的河豚毒素进行定性和定量。
2.根据权利要求1所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法，其特征在于，所述步骤(I)河豚毒素标准品溶液中河豚毒素浓度为2(Tl0000ng/ml。
3.根据权利要求1或2所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法，其特征在于，所述步骤⑵中pH维持液为2mol/L碳酸钠溶液。
4.根据权利要求3所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法，其特征在于，所述步骤⑵中衍生试剂I的PH约为12，包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之间的体积比为5:2:3，具体地，所述a液为次溴酸钠贮备液:0.67g溴酸钠、3.0 g溴化钠，用蒸懼水溶解并定容至IOmL ;所述b液为5mol/L盐酸；所述c液为4.81mol/L氢氧化钠。
5.根据权利要求4所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法，其特征在于，所述步骤⑵中衍生试剂2为20%尿素。
6.根据权利要求5所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中终止液为15%磷酸。
7.根据权利要求1所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中高效液相色谱检测条件为:色谱柱:反相C-18柱；流动相:50 mmoL/L磷酸二氢铵；检测信号:激发波长233 nm，发射波长370 nm。
8.一种基于权利要求1所述的河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法用试剂盒，其特征在于，包括以下试剂: (1)衍生试剂1:pH约为12,包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之间的体积比为5:2: 3，所述a液为次溴酸钠贮备液:0.67g溴酸钠、3.0 g溴化钠，用蒸馏水溶解并定容至IOmL ;所述b液为5mol/L盐酸溶液；所述c液为4.81mol/L氢氧化钠溶液； (2)衍生试剂2:20%尿素溶液； (3)pH维持液:2mol/L碳酸钠溶液； (4)河豚毒素标准品贮备液:100μ g/mL河豚毒素溶液，内含lmmol/L的柠檬酸盐，pH=5.0 ； (5)终止液:15%磷酸溶液。
【文档编号】G01N30/02GK103983706SQ201410181792
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月4日 优先权日:2014年5月4日
【发明者】岑剑伟, 李来好, 杨贤庆, 郝淑贤, 魏涯, 辛少平, 周婉君, 黄卉, 杨少玲, 邓建朝 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所