用于收集激光显微剖切物的试样收集器的制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于激光显微剖切装置的激光显微剖切物试样收集器(1)，其中该试样收集器包括用于收集剖切物(111)的收集室(10)，其特征在于，所述收集室(10)在试样侧具有向着环境敞开的、用于容纳剖切物(111)的开孔，所述收集室(10)具有第一阀门(102,122)，它在关闭状态形成收集室(10)的远离试样的封堵，用于滞留剖切物(111)，并且在第一阀门(102,122)下游设置毛细管线(107)，它与收集室处于连接以输送来自所述收集室(10)的剖切物(111)。
【专利说明】用于收集激光显微剖切物的试样收集器
【技术领域】
[0001]本发明涉及一个用于激光显微剖切装置的激光显微剖切物试样收集器和一个这种激光显微剖切装置。
【背景技术】
[0002]在激光显微剖切中为了继续分析，借助于聚焦的激光射线选择的组织范围或者细胞从显微镜的组织试样中分出来或者切下来(“剖切”)。
[0003]申请者的DE 100 18 253 C2，DE 10 2005 028 062 B4和DE 10 2005 008 925 Al
描述了用于在使用显微镜的条件下激光显微剖切的可能的方法和系统。
[0004]基于毛细管的分析仪已经发展到可以在小液滴或溶液中通过毛细系统输运、分选、分析从组织中分解出来单个细胞或者甚至染色体，并且在分析后也可以继续使用。以基于毛细管的分析技术例如由公司Fluidigm(http://www.fluidgim.com)和RainDanceTechnplogies (http://www.raindancetechnologies.com)应用和推广。
[0005]为了可以利用这种技术分析，必需首先分离试样和单个细胞；这可以通过基于荧光的流式细胞术、激光显微剖切和移液到相应的用于毛细系统的输送介质里面实现。
[0006]对于在激光显微剖切中切割的所谓的“剖切物”提供不同的收集器供使用，例如所谓的“tube-caps”，八联管条(8er streifen)，八联管条盖或者所谓的“口袋实验室”(英文也称为:Lab on a Chip)，例如AmpliGrid装置。在激光显微剖切过程以后从剖切机中物理地取出这个收集器，并且独立地继续处理。为此通常需要离心步骤和移液步骤，直到剖切物在相应的溶液中输送到分析方法，例如聚合酶-链反应(英文:Polymerase ChainReact1n, PCR),逆转译PCR (RT-PCR)或者即时或定量PCR(rt_、qPCR)或者质谱仪(MS)。
[0007]这些工作原理的缺陷是，明显地限制在利用激光显微剖切分离以后直接用于自动地继续处理试样的可能性。此外必需的费事的离心和移液步骤含有高的污染和试样损失隐串
■/Q1、O
[0008]由EP 2 083 257 Al已知一种用于传递显微的、分离的试样的方法和装置。在此微吸盘被定位在试样上面，试样从试样体上在物体台上切下来。在微吸盘偏转之前微吸盘主动地从物体台上吸住试样，并且接着将试样在另一位置再吹下来。由此可以将试样转移到反应罐里面。但是在抽吸前不可能或者至少不能足够地视觉地检查试样，因为它还被保留的试样体(试样从其上被切割下来)包围。
[0009]DE 10 2009 016 512 B4公开了一个激光切除腔，由一个容器组成，它可以从上面通过玻璃盖气密地封闭，要被检查的试样位于其底面上。该容器具有用于输送气体(例如氩气)的输入管和排出管。首先实现试样检查，且确定利用激光切除要去除的部位。通过激光显微剖切仪在充分利用这种仪器的高分辨率物镜的条件下进行这种检查。在确定相应的部位以后利用激光切除从试样上去除这个部位，并且通过输入输送气体从气密的容器例如输送到分析装置，例如质谱仪。根据分析结果可以分析其它试样部位。为此可以使用已知的激光显微剖切，它能够以高精度以亚微米范围剖切试样切片。为了激光显微剖切，所述激光切除腔被替换为常见的用于激光显微剖切的试样容器。
[0010]DE 103 29 674 Al的目的是克服UV切除的缺陷，例如在生物组织中的UV射线吸收或者较低的切割质量。为了切割生物材料，在这里建议使用超短皮秒或飞秒范围的激光脉冲，在激光波长为大于400nm(近红外)时重复频率为至少1000Hz，其中激光聚焦在试样上，用于在那里产生至少1012W/cm2的高强度。由此实现所谓的非共振多光子吸收，它为了切割作用产生离子。在一实施例中切割下来的生物材料通过电离作用与周围的试样分开并且落到以赖氨酸覆层的玻璃盖上。在此例如将试样通过载有它的薄膜涂覆在玻璃窗的底面上。硅环连接玻璃窗与以赖氨酸覆层的玻璃盖。切下来的生物材料例如可以通过插入两个针管通过硅环或者吸出来或者利用流体动力流冲出来并且利用无菌过滤器收集。上玻璃窗、硅环和用于收集切下来的材料的玻璃盖一起形成封闭的无菌室。
[0011]因此本发明的目的是，在完成激光显微剖切以后实现自动的试样处理，尤其具有可视或者说观察剖切物的可能性。
【发明内容】
[0012]这个目的通过如独立权利要求所述的用于激光显微剖切装置的激光显微剖切试样收集器和这种装置得以实现。在各从属权利要求和下面的描述中公开了优选的实施例。
[0013]按照本发明的激光显微剖切物试样收集器具有能够检查的、用于容纳剖切物的收集室，其中所述收集室在试样侧具有向着环境基本敞开的、用于容纳剖切物的开孔。所述收集室还具有第一阀门，它在关闭状态形成收集室的远离试样的封堵(或底部)，用于尤其暂时滞留剖切物。在第一阀门下游设置毛细管线，它为了输送来自收集室的剖切物(在阀门打开时)与这个收集室处于连接。
[0014]下面的定义“下游”和“上游”涉及一流动方向，它从收集室的试样侧开孔通过第一阀门指向毛细管线方向，因此流动方向描述了剖切物的输运途径。
[0015]所述收集室的“向着环境基本敞开的开孔”要理解为，所述收集室不是气体或液体隔绝地密封。
[0016]本发明的优点是，按照本发明的试样收集器收集切下来的试样(剖切物)，首先在通过关闭的第一阀门形成的底部上滞留，并且接着再导送到且通过毛细管线，无需手动的工作步骤。在剖切物的收集与继续导送之间必要时可以视觉地检查或观察剖切物。在其继续导送以后剖切物可以输送到分析。所述试样收集器对于继续导送尤其无需手动地取出和/或倾斜。通过这种方式实现试样处理的自动化，这改善了工作舒适性并且减少工作时间。此外可以避免或者至少减少由于手动的工作步骤带来的污染和/或材料损失。所述试样尤其可以通过使用适合的缓冲剂或者溶剂为了冲洗直接在剖切过程以后被保护并且输送到分析。
[0017]所述收集室可以是试样收集器的内部表面的一部分。所述收集室与毛细管线的连接可以以直接接头的形式出现，该接头包括第一阀门。在此收集室和毛细管线可以作为公共的、单个零部件的分段制成，例如由玻璃或塑料制成。这种分段可以相互连接，或者该零部件可以具有(阀门)段，它设置在两个上述分段之间。备选地可以使所述收集室和毛细管线由独立的零部件或者独立零部件的一部分呈现，它们直接或者通过一个或多个连接部件(第一阀门)相互连接。独立的零部件可以由同一种材料制成。备选地可以使至少一个零部件含有至少一种材料，而在其它零部件中不含有它。
[0018]所述毛细管线可以是毛细管或管道。
[0019]收集室例如可以用于，收集多个剖切物，然后使它们共同地通过第一阀门穿过毛细管线导引并且从那里供其它反应过程使用。这种收集室还能够或易于添加输运/载体物质，例如液体，例如用于通过排出管冲出剖切物。
[0020]在此例如可以设有第二阀门，它有选择地关闭或打开收集室，只有在打开阀门时剖切物或其它材料才可以落入到收集室里面。由此尤其在收集剖切物以后通过关闭第二阀门防止外来物、如污物挤入收集室里面。因此第二阀门在关闭状态形成收集室的试样侧的封堵(“盖”)。
[0021]通过第一阀门可以控制来自收集室且通过毛细管线的剖切物的输运。因此可以控制剖切物通过毛细管线偏转并输送到其它试样处理或分析的时刻。例如剖切物可以在其切下来以后且在其从收集室输运前首先视觉地通过使用者检查。
[0022]在优选的实施例中，所述收集室和/或毛细管线可以具有至少一个注射器，通过它可以输入载体物质或其它输运物质。由此例如能够添加液体，用于通过毛细管线输运剖切物。备选或附加地可以实现适用于其它试样处理的物质添加，例如适合的缓冲剂、溶剂、形成胶束的液体或类似物质。下面关于定义“载体物质”，要包括两种输入的物质。
[0023]如果所述试样收集器如上所述包括具有两个阀门的收集室，有利的是，在两个阀门之间设置注射器。这能够在添加物质之前关闭收集室，由此例如不会排出物质的气味或蒸汽或者不会脏污物质。
[0024]所述试样收集器可以包括给料器，它最好设置在收集室与毛细管线之间。该给料器最好在收集室下游设置。
[0025]这种给料器能够使剖切物包括在液滴里面。各个液滴最好可以在排出管中分选。例如可以使含有剖切物的液滴与其它液滴分开。没有剖切物的液滴例如可以输送到再使用或其它应用(例如通过试样收集器的注射器重新注射)，而含有剖切物的液滴可以导引到分析运算。
[0026]通过毛细管线可以输运最小体积的液体。所述毛细管线可以具有分支。所述分支可以由分选交叉口构成，在其上含有剖切物的液滴自动地(例如利用电场梯度)与没有剖切物的液滴分开。由此可以提高剖切物在分析溶液中的浓度并由此改善例如利用DAN富集的分析。在使用分选交叉口时离开的毛细管线用于输运剖切物，而另一离开的毛细管线使载体物质导回到储罐，它随后可以利用泵例如通过注射器输入到收集室。
[0027]在适宜的实施例中，在所述收集室的开孔的上游设置能够检查的流出装置，其流出部与收集室的开孔处于连接。在这种情况下剖切物不直接落入到收集室里面，而是首先落入到流出装置，在其中例如可以视觉或通过相机检查。从流出装置流出的剖切物接着通过收集室的开孔进入到收集室。
[0028]在优选的实施例中，所述流出装置包括冲洗装置和/或排出或抽吸装置。所述冲洗和/或排出或抽吸装置可以用于，使剖切物可靠地从流出装置输送到毛细管线里面。由此也可以监控从收集室输运剖切物的时刻。
[0029]在冲洗装置情况下这个冲洗装置可以调整成，使流出装置已经在例如剖切物落入之前和/或连续地加湿，并由此易于输运落入的剖切物。备选地可以调整冲洗装置，只有在收集剖切物以后才馈入液体到收集装置里面，这能够实现剖切物的事先可视化。在此可以自动地在给定的时间间隔以后自动地或者手动地通过使用者激活馈入。通过这种方式一方面给使用者在剖切物冲洗到毛细管线里面之前视觉地检查剖切物的时间，另一方面可以首先收集多个剖切物到收集装置，在它们共同地冲洗到毛细管线里面之前。
[0030]在尤其具有冲洗装置的实施例中，所述流出装置由通过加大的侧面边缘限定的收集面构成。由此可以收集输入的液体并且通过收集面相对于水平面的倾斜控制液流方向。所述剖切物尤其可以有目的地冲洗到收集室的开孔。
[0031]在特别有利的实施例中，在第一阀门下游在这个阀门后面设置一过滤器，其中所述过滤器设置为能够使剖切物通过。所述过滤器尤其直接设置在毛细管线前面的第一阀门后面，或者设置在毛细管线本身里面。穿过过滤器的剖切物通过毛细管线继续输运。
[0032]所述过滤器尤其对于上述的载体物质是可透过的，而滞留其它尤其固态的剖切物之外的物质。尤其薄膜碎片属于这种剖切物之外的物质。在激光显微剖切时通常使用所谓的薄膜物体支架。要剖切的材料涂覆到适合的(通常吸收UV激光的)薄膜上，其中激光显微剖切系统的激光也一起切割试样与薄膜。因此所述剖切物物理地从薄膜与包围的试样的总复合中完全分开。其结果是，提取的试样(剖切物)还与同样提取的表面(表面碎片)连接。薄膜碎片可能堵塞试样收集器的毛细管线和/或影响下面的反应。
[0033]下面要假设，这种过滤器直接设置在在收集室的第一阀门后面毛细管线前面。为了分离剖切物与薄膜碎片可以使用下面的方法:在收集室里面收集剖切的试样，在那里必要时可以检查剖切物。通过注射器将裂解液给到收集室，它使剖切物与薄膜碎片分开。试样通过裂解液或者裂解液中的消化酶也完全裂解/消化，由此使以前固态的试样的组成部分位于溶液(裂解液)里面，而薄膜保持其初始的固态形状。通过打开第一阀门(裂解的)剖切物通过过滤器进入到毛细系统，而以前剖切的薄膜碎片被过滤器滞留。
[0034]为了净化过滤器的薄膜碎片存在不同的方法:首先可以换下整个收集室连同阀门和过滤器并且通过一个新的来替换。备选地只换下过滤器并且通过一个新的来替换。附加地或备选地能够在更换过滤器或全部收集室之前(或者也为了避免这种更换)，冲洗过滤器。为此例如在打开第一阀门时在相反方向上冲洗过滤器，由此使薄膜碎片进入到收集室里面。薄膜碎片例如可以利用注射器(或者利用已经设置在那里的注射器)吸出。
[0035]在优选的实施例中，按照本发明的试样收集器组合到激光显微剖切装置里面。这个装置还包括用于产生激光射线的激光源、用于偏转激光射线的偏转装置、作为聚焦透镜的显微镜物镜和用于容纳物体支架的显微镜台。所述激光射线利用显微镜物镜聚焦在位于物体支架上的试样上。利用偏转装置使激光射线沿着切割线在试样内部导引。所述试样收集器最好固定在物体支架下面并且这样对准，使被激光射线切下来的剖切物落到试样收集器的收集室(或者前置的流出装置)里面。
[0036]这种激光显微剖切装置包括显微镜，其中设有用于耦入激光射线到显微镜光程里面的措施。在此它可以是分光器，它对于激光波长是反射的，而它对于显微镜的观察波长是可透过的。此外可以设有用于耦入激光射线的光学元件(透镜等)。总体上适宜地使用用于使激光射线通过显微镜物镜耦入并聚焦在试样上的照明装置。然后激光射线穿过设置在照明装置里面的偏转装置并且入射到作为聚焦透镜的显微镜物镜上。所述激光射线聚焦在试样上并且利用相应的通过偏转装置的偏转描绘试样上的切割线。沿着这个切割线切割试样，由此产生剖切物。这种布置是特别有利的，因为显微地(例如利用荧光显微镜)检查试样并且可以识别要剖切的试样部位。此外也可以视觉地或者利用照相机观察且必要时控制激光切割过程，因为显微镜台在激光切割期间不必运动。
[0037]关于上述激光显微剖切系统(它包括显微镜)的原理结构和工作方式请详细地参阅专利文献DE 100 18 253 C2。这种系统尤其结合按照本发明的试样收集器是有利的。为了避免重复，关于该系统的细节在本说明书中引用上述专利文献的相应公开内容。
[0038]在剖切物处理范围内可以确定，已经在收集室里面收集给定数量的剖切物。这可以包括获取已实施的剖切步骤的数量和将所获取的数量与给定数量比较。通过这种方式例如可以在溶液中达到对于分析运算所需的剖切物浓度。
[0039]当然，上述的和下面还要解释的特征不仅可以在各给定的组合中应用，而且可以在其它组合中或者单独地应用，而不离开本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]借助于附图中的实施例简示出本发明并且在下面参照附图详细地描述。附图中:
[0041]图1示例地示出按照本发明的试样收集器实施例和在其应用时的不同方法步骤，
[0042]图2A示出按照本发明的试样收集器的另一可选择的实施例和其应用，
[0043]图2B示出剖切物在图2A的方法延续中的继续过程，
[0044]图3A示出按照本发明的试样收集器的另一可选择的实施例和其应用的第一步骤，
[0045]图3B示出在图3A中所示的试样收集器应用的另一方法步骤，
[0046]图4示出具有过滤系统的试样收集器在不同的应用级别(图4A至4C)，
[0047]图5示出可能的过滤系统装置，
[0048]图6示出具有组合的试样收集器的激光显微剖切系统。
【具体实施方式】
[0049]图1示出方法的五个步骤，在其中应用按照本发明的试样收集器I的实施例。
[0050]试样收集器I包括收集室10，它在所示情况下具有两个阀门101和102。第一阀门102在关闭状态形成远离试样106的收集室10的封堵(底部)。在第一图示步骤Sll中打开第二阀门101(盖)，因此收集部位已经用于容纳落下的剖切物111。在其底面上在第一阀门102下游收集室10与毛细管线连接，毛细管线作为用于从收集区输运剖切物的排出管。通过阀门102监控剖切物从收集室10的收集区继续导引到排出管。在图示步骤Sll中阀门102关闭。
[0051]试样收集器I设置在固定试样106的物体支架103下方。利用通过显微镜物镜聚焦的激光射线9在步骤Sll中从试样106切割剖切物111。切下来的剖切物落入到试样收集器I的收集区(即收集室)10里面。图6详细解释可能的激光显微剖切装置。
[0052]如果剖切物落入到收集室里面(步骤S12)，上阀门101可以关闭(步骤S13)。通过重复步骤Sll可以继续切下其它剖切物并且容纳在收集室10里面，直到达到所期望的剖切物数量。下阀门102可以打开，使剖切物可以直接接触到排出管107 (步骤S14)，它例如可以衬入到微流体的毛细系统里面；在此上阀门101最好关闭。在步骤S15示例表示的剖切物111进入到分选交叉口 108，从那里可以输送到其确定地点，如同下面还要解释的那样。在所有步骤期间或者之前或之后可以通过可选的注射器104添加载体物质，例如适合的缓冲剂、溶剂、形成胶束的液体或类似物质。此外注射器104可以在步骤S14中用于冲出剖切物。
[0053]附加地对于上面简示的试样收集器实施例存在可能性，使收集室10与给料器109组合。这样的实施例在图2A和2B中示出:除了类似在图1中示出的特征以外，在图2A和2B中所示的试样收集器I包括给料器109。
[0054]第一图示步骤S21对应于图1的步骤Sll:在此剖切物111从试样106上切下来并落入到具有收集室10的试样收集器I里面。现在下阀门102(如同对于步骤S22a所示)可以关闭，或者(如同对于步骤S22b所示)打开。因此剖切物111固定在下阀门102(步骤S22a)上或者直接在给料器109头部与液体113混合(步骤S22b)。在两个步骤S22a和S22b中能够在收集过程之前、之后和/或期间有选择地通过注射器104有选择地添加载体物质(未示出)。如果剖切物对应于步骤S22a固定在下阀门102上或者上方，则阀门102紧接着打开，由此使剖切物(如同在步骤S22b中所示那样)进入到给料器109。
[0055]紧接着步骤S22b可以使下阀门102(如同在步骤S23a中所示那样)马上再关闭。备选地可以首先(如同在步骤S23b中所示那样)通过注射器104实现物质添加114。
[0056]按照图2B在下一步骤S24中剖切物111离开给料器109，由此使它包围在一个液滴115里面。在此在视图中下阀门102(又)关闭，但是它也可以选择打开，尤其当前面的步骤对应于步骤S23b的时候。液滴115进入到毛细管线107里面。
[0057]在步骤S25液滴115与包围在其中的剖切物111接近分选交叉口 108。在那里利用施加的电场梯度在步骤S26中使液滴与剖切物111分选，并且在单独的毛细管117中输送到所期望的分析，而没有剖切物的液滴可以在另一毛细管118中分选并回收。回收必要时通过注射器重新注射。在重复过程之前必要时必需使给料器109再充满(未示出)，例如通过注射器104。在此打开下阀门102，上阀门101同样可以打开或者也可以关闭。
[0058]图3A和3B示出可选择的实施例，其中在试样收集器I的收集室10的上开孔的上游前置一个通过加大的侧面边缘125限定的收集面124作为流出装置11。流出装置最好包括冲洗装置或排出装置或者说抽吸装置，借助于它们可以使收集的剖切物漂移到排出管107。
[0059]在此在第一步骤S31中，通过激光显微剖切从试样106上切下剖切物111。剖切物通过重力向下落。在步骤S32收集剖切物到试样收集器I的流出装置的收集面124上。收集面124与水平面相比倾斜。在所示实施例中，流出装置11包括注射器或者冲洗装置119，通过它们可以添加冲洗液体或者其它物质，一般是载体物质。收集面124的侧面边缘125加大，防止(冲洗)液体溢流并且导引到流出部126。
[0060]在所示情况下在步骤S32中还没有液体或其它物质导引到收集面124里面。因此可以实现收集面124和剖切物的检查。备选地可以使收集面124连续地利用冲洗或注射器119湿润。
[0061]通过以适合的冲洗溶液冲洗，使剖切物111在步骤S33中通过流出部126并且在步骤S34中通过一连接部被冲洗到收集室10，收集室10在所示情况下组合到毛细管腔120里面。对于冲洗备选地可以设想抽吸剖切物。
[0062]所示的毛细管腔120具有自身的收集室10。进入阀121、排出阀122以及可选择的注射器123。通过打开进入阀121使剖切物111在步骤S35进入到收集室10里面，收集室10的排出阀122关闭，如同在图3B中所示那样。
[0063]收集室10 (如同在步骤S36a中所示那样)直接或者(如同在步骤S36b中所示那样)通过给料器109连接在排出管107上。如果存在注射器123，可以通过它在两种情况下在关闭排出阀122时实现添加一种或多种物质。
[0064]从步骤S36a(即在收集室10不连接在给料器的情况下)开始，在步骤37a中打开排出阀122并且转移剖切物到排出管107里面，它在这里是毛细管。在步骤S38a中剖切物在包围的液体里面通过毛细管107 (如同例如在图1中所示的那样)输送到其后续分析。关于其它工作方式请参阅图1或图2A和2B。
[0065]在收集室10连接在给料器109的情况下(S36b)，剖切物在步骤S37b和S38b中与对于图2B描述的步骤S23b-S25类似地包括在一个液滴里面，它被与没有剖切物的液滴分开并且导引到用于分析剖切物的反应地点。
[0066]图4示出按照本发明的试样收集器I实施例的工作方式，如同基本已经在图1中所示的那样，具有过滤系统，用于分离剖切物111与剖切物之外的物质112，例如薄膜。为此在图4中对第一阀门102后置过滤器116，其中过滤器116还设置在毛细管线107前面。
[0067]图4A示出用于激光射线9的聚焦透镜105，它聚焦在被物体支架103固定的试样106上。切下来的剖切物在打开第二阀门101时落入到试样收集器I的收集室10里面。因此参阅对于图1的解释。
[0068]激光显微剖切通常通过所谓的薄膜物体支架进行。为此将试样106涂覆在适合的薄膜(例如由吸收UV激光的材料制成)上。激光显微剖切系统的激光9从试样106切下剖切物111，同时一起切下固定剖切物111的薄膜。结果是，提取的试样、即剖切物111还与同样提取的薄膜112连接。这个薄膜112可能堵塞毛细管线107的毛细管或者影响以后的反应。
[0069]图4B示出在第二阀门101已经关闭以后，剖切物111已经落入到收集室10里面以后，在试样收集器I里面的状况。通过注射器104已经将载体物质113给到收集室10的内部。因此在关闭第一阀门102时剖切物111与薄膜112—起位于载体液体里面。在按照图4B的状况中可以检查剖切的试样。作为载体物质113可以添加裂解液，它至少使剖切物111与薄膜碎片112分开，或者试样完全在薄膜碎片112保留的条件下溶解/裂解。
[0070]图4C示出在打开第一(下)阀门102以后的状况。因为过滤器116对于载体物质(裂解液)113以及对于剖切物111或者溶解的试样是可透过的，而对于薄膜112不可透过，剖切物111转移到毛细系统107里面，而一起剖切的薄膜碎片112保留在过滤器116里面。
[0071]图5以简示的形式示出净化过滤系统的方法。
[0072]原则上存在三种净化过滤系统的可能性。根据结构形式，或者可以更换全部收集室10与阀门101和102以及过滤器116，或者只更换过滤器116。为了尽可能避免或者至少只在较长的时间间隔以后需要时进行这种更换，可以有利地冲洗过滤器116。这个过程在图5A至5C中简示。首先通过载体物质或者其它过滤器净化液体冲洗过滤器116，由此在打开阀门102时使过滤下来的薄膜112或者许多位于那里的薄膜碎片冲洗到收集室10内部。接着再关闭下阀门102(图5B)。现在排空收集室10内部，其中这一点可以通过设置在那里的注射器、例如注射器104实现。也能够只抽吸薄膜碎片112，无需完全排空收集室10。图5C示出在过滤器系统净化以后的状态。通过打开上阀门101使用收集器又准备容纳剖切物。
[0073]图6简示出激光显微剖切装置，它如何可以应用于本发明。特别适用于本发明的激光显微剖切系统在德国专利文献DE 10 2005 028 062 B4中详细描述过。因此关于某些下面提及的这个系统的细节请参阅这个文献，因此在本申请中引用其公开内容。
[0074]激光显微剖切装置200包括显微镜204，具有可电动移动的χ-y台、用于容纳物体支架103的显微镜台205，在物体支架103上放置要检查和/或要切割的样本(试样)106。以209表示透光照明装置。试样106可以以透射光或者以入射光照明。以203表示相应的入射装置。这个入射装置203的相应光源可以与激光源201—起安置。也可以使用分开的布置，也具有分开光路。206表不光源,例如齒素灯或者白光LED,具有后置的(未详细不出的)照明光路，用于产生透射照明光程。这个照明光程利用偏转镜207和聚光镜211从下面对准试样106。显微镜204还包括物镜105以及未详细不出的显微镜部件,例如放大系统、管透镜和目镜。目镜本身以212表示。
[0075]透过试样收集器I和试样106的透射照明光程的光线进入到物镜105，它检测部分试样106，它可以由观察者以显微图形的形式通过目镜212观察。附加地使显微镜204与照相机217连接，它例如通过CCD芯片可以检测样本切片的数字图形。由照相机217摄取的图形数据传递到计算机220，它本身与显示面218 (在这里是显示器)连接，在其上可以显示摄取的样本切片图形。计算机220和照相机217也可以完全或者部分地形成集成单元。
[0076]所示的激光显微剖切装置200还包括激光装置(在这里入射装置203)，用于通过激光切刀切割试样106的激光显微切割部位。为此使激光源201与显微镜204例如通过激光源201的连接耦联在显微镜物镜208上。由激光源201产生的激光射线9通过还要解释的部件216，219，214，202和213耦入到显微镜204的光轴210里，并且通过显微镜物镜105聚焦在试样106上用于切割。通过激光射线9与试样106之间的相对运动可以使相应的剖切部位从样本上沿着给定的标记(切割线)切下来。尽管这个相对运动可以在激光射线9静止时通过显微镜台205和相关的物体支架103的相应运动实现，但优选且在这个实施例中反过来，在显微镜台205静止或者物体支架103静止时在激光切割期间使激光射线9运动。其最大优点是，在激光显微切割期间可以直接观察试样106。
[0077]为此，使激光射线9通过(可选择的)削弱单元216 (衰减器)、聚焦光路219以及光圈单元214导引。利用这些元件以公知的方式(详见已经提过的DE 10 2005 028 062B4)在试样106中所期望的位置上以所期望的强度和几何形状产生激光射线焦点。偏转元件213用于耦入激光射线9到显微镜204的光轴210中。例如UV激光适合于作为激光。
[0078]在图6中以215表示控制装置。它可以包括相互分开的单元，如同在图6中图示的那样，但是在实践中控制装置通常是一个单元，它尤其也可以集成到计算机220里面。在这个实施例中控制装置215与激光源201、削弱单元216、聚焦光路219、光圈单元214以及与还要解释的偏转装置202连接，用于可以适合地控制这些元件。与显微镜台205的连接(在这里未示出)也是有意义的，可以移动到或驶过试样106的不同部位。与照相机217的连接同样是适宜的，可以调整拍摄参数。其它细节请再次参阅DE 10 2005 028 062 B4。
[0079]为了使激光射线沿着给定标记或切割线运行以切割试样部位(剖切物)，存在偏转单元202，它包括成对楔板，其各个楔板相互间以变化的方式对准。通过这种方式可以以公知的方式使来自光轴的激光射线以一偏移量偏转，由此使它相应偏移地入射试样106,其中激光射线对于所有的偏转角穿过物镜105的物镜光瞳中心延伸。关于偏转装置202的结构和工作原理的细节请参阅德国专利文献DE 100 18 253 C2。通过适合地控制偏转装置202能够使激光射线焦点沿着任意给定的切割线移动。
[0080]在这里涉及的激光显微切割装置200能够在不同的显微方法下获得试样切片，尤其在物体支架103的静止的固定位置。能够实现的透射照明在上面已经解释了。这里只针对激光装置解释的入射装置203也代表性地用于其它入射照明方法，例如反差方法或者入射荧光方法。适宜地可以使一个样本切片通过(至少)两种不同的显微方法表示，以叠加成显微图形并且在叠加图形中(自动或手动地)定义切割线。计算机220然后通过控制装置215控制偏转装置202，用于以相应的方式由试样106产生剖切物111。剖切物111进入到按照本发明的试样收集器1，尤其进入到收集室10内部。
[0081]如上借助于图1和2详细解释的那样，位于收集室10内部的剖切物111被转移到毛细管线107里面。为此也可以设有给料器109 (参见图2)。此外如图3所示，可以使用流出装置11。通过分选交叉口 108 (参见图1)可以分选剖切物111并且输送到分析装置(在这里未示出)。多余的载体物质可以通过毛细管系统的另一管线再输送到其起点(例如也可以是储罐，从那里可以利用泵再将载体物质送回到其初始的使用地点)。
[0082]为了可以显微地观察剖切过程，要注意位于透射照明光程中的试样接收器I部件尽可能是透光的。否则可以选择照射观察。也可以设想可选择的透射照明和入射照明。
[0083]附图标记清单
[0084]I试样收集器
[0085]9激光射线
[0086]10收集室
[0087]11流出装置
[0088]101 第一阀门
[0089]102 第二阀门
[0090]103物体支架
[0091]104注射器
[0092]105聚焦透镜，显微镜物镜
[0093]106 试样
[0094]107排出管，毛细管线
[0095]108分选交叉口，分支
[0096]109给料器
[0097]111剖切物
[0098]112 薄膜
[0099]113载体物质
[0100]114添加物质
[0101]115 液滴
[0102]116过滤器
[0103]117毛细管
[0104]118毛细管
[0105]119冲洗装置
[0106]120毛细管腔
[0107]121第二阀门，进入阀
[0108]122第一阀门，排出阀
[0109]123注射器
[0110]124收集面
[0111]125侧面边缘
[0112]126流出部
[0113]200激光显微剖切装置
[0114]201激光源
[0115]202偏转装置
[0116]203入射装置
[0117]204显微镜
[0118]205显微镜台
[0119]206 光源
[0120]207偏转镜
[0121]208显微镜支架
[0122]209透光照明装置
[0123]210 光轴
[0124]211聚光器
[0125]212 目镜
[0126]213偏转元件
[0127]214光圈单元
[0128]215控制装置
[0129]216削弱单元
[0130]217照相机
[0131]218显示面
[0132]219聚焦光路
[0133]220计算机
[0134]SI1-S15 方法步骤
[0135]S21-S26 方法步骤
[0136]S31-S38b 方法步骤
【权利要求】
1.一种用于激光显微剖切装置的激光显微剖切物试样收集器(I)，其中该试样收集器包括用于收集剖切物(111)的收集室(10)， 其特征在于， 所述收集室(10)在试样侧具有向着环境敞开的、用于容纳剖切物(111)的开孔，所述收集室(10)具有第一阀门(102，122)，它在关闭状态形成收集室(10)的远离试样的封堵，用于滞留剖切物(111)，并且 在第一阀门(102，122)下游设置的毛细管线(107)，它与所述收集室处于连接以输送来自所述收集室(10)的剖切物(111)。
2.如权利要求1所述的试样收集器，其特征在于，所述收集室(10)具有第二阀门(101，121)，它在关闭状态形成收集室(10)的试样侧的封堵。
3.如权利要求1或2所述的试样收集器，其特征在于，所述收集室(10)和/或毛细管线(107)具有至少一个注射器(104)，用于输入载体物质(113)。
4.如权利要求1或2所述的试样收集器，其特征在于，在所述收集室(10)的两个阀门(102，122 ;101，121)之间设置注射器(104)，用于输入载体物质。
5.如上述权利要求中任一项所述的试样收集器，其特征在于，所述毛细管线(107)具有分支(108)。
6.如上述权利要求中任一项所述的试样收集器，其特征在于，在所述收集室(10)与毛细管线(107)之间设置给料器(109)。
7.如上述权利要求中任一项所述的试样收集器，其特征在于，在所述收集室(10)的开孔上游设置流出装置(11)，其流出部(126)与收集室(10)的试样侧的开孔处于连接。
8.如权利要求7所述的试样收集器，其特征在于，所述流出装置(11)包括冲洗装置(119)和/或排出或抽吸装置。
9.如权利要求7或8所述的试样收集器，其特征在于，所述流出装置(11)由通过加大的侧面边缘(125)限定的收集面(124)构成。
10.如上述权利要求中任一项所述的试样收集器，其特征在于，在所述第一阀门(102，122)下游在这个阀门后面设置过滤器(116)，其中所述过滤器被设置成能够使剖切物(111)通过。
11.如权利要求10所述的试样收集器，其特征在于，所述过滤器(116)在流动方向上设置在所述毛细管线(107)前面。
12.如权利要求10或11所述的试样收集器，其特征在于，所述过滤器(116)被设置成使得剖切物之外的物质(112)被滞留。
13.如权利要求10至12中任一项和如权利要求3或4所述的试样收集器，其特征在于，所述过滤器(116)对于载体物质(113)是可透过的。
14.一个激光显微剖切装置(200)，它包括用于产生激光射线(9)的激光源(201)、用于偏转激光射线的偏转装置(202)、用于使激光射线通过显微镜物镜(105)聚焦在试样(106)上的入射装置(203)、用于容纳用于固定要剖切的试样(106)的物体支架(103)的显微镜台(205)和设置在物体支架(103)的试样侧的、如上述权利要求中任一项所述激光显微剖切试样收集器(I)。
【文档编号】G01N1/04GK104321632SQ201380026810
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2013年5月22日 优先权日:2012年5月24日
【发明者】F·施劳德拉夫 申请人:莱卡微系统Cms有限责任公司
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