出血性大肠杆菌o157:h7酶联免疫检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测出血性大肠杆菌O157:H7的酶联免疫试剂盒。所述的试剂盒含有两株能特异性地结合于出血性大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体，一株为专门作为捕捉抗体的单克隆抗体3A8F11B10E7，CGMCC?No.8458，另一株是作为检测抗体的单克隆抗体GS2-D3，CGMCC?No.6610。大量测试证实，本发明的试剂盒可特异、高效地检测出血性大肠杆菌O157:H7，但和其它76种常见病原细菌无交叉反应，是一种性能极好的病原细菌检测产品。
【专利说明】出血性大肠杆菌0157:H7酶联免疫检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和免疫学领域，具体涉及一种检测出血性大肠杆菌0157:H7的酶联免疫试剂盒。
【背景技术】
[0002]出血性大肠杆菌0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7)是肠道大肠杆菌的主要血清型，可通过牛肉及其制品、牛奶及其制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等传播。出血性大肠杆菌0157:H7可引起肠炎，受感染病人的典型临床症状为血便、腹痛、低热或不发热，约有10%的病人可发展成为溶血性尿毒症及血栓性血小板减少性紫癜，并且可对被感染病人的肠道、肝、脾、肾、淋巴、脑、呼吸系统和神经系统造成损伤。老人和儿童为高危人群，易发生溶血性尿毒症，死亡率高达30%以上。世界卫生组织已经将出血性大肠杆菌0157:H7肠炎列为新发传染病。出血性大肠杆菌0157:H7感染已经成为一个世界性的卫生问题。
[0003]目前出血性大肠杆菌0157:H7的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。分子生物学和免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定的快速检测手段，但是检测产品全部依赖进口，我国目前尚无拥有完全自主知识产权，且可运用于检测实践的快速检测产品，该专利以出血性大肠杆菌0157:H7为检测靶标，所要求保护的技术涉及出血性大肠杆菌0157:H7快速检测产品。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种检测出血性大肠杆菌0157:H7的试剂盒。
[0005]进而，本发明提供了一种用于检测出血性大肠杆菌0157:H7的酶联免疫试剂盒，所述的试剂盒含有:
[0006](a)固相载体，所述的固相载体上包被有作为捕捉抗体的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体3A8F11B10E7，所述的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体3A8F11B10E7 由小鼠杂交瘤细胞系 3A8F11B10E7，CGMCC N0.8458 产生；
[0007](b)容器a，所述的容器a中装有作为检测抗体的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体GS2-D3，所述的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体GS2-D3由小鼠杂交瘤细胞系GS2-D3, CGMCC N0.6610 产生。
[0008]在一优选例中,所述的固相载体为酶标反应板。
[0009]在另一优选例中，所述的检测抗体带有可检测的标记物。
[0010]在另一优选例中，所述的可检测的标记物为辣根过氧化物酶。
[0011]在另一优选例中，所述的试剂盒还含有阳性对照和阴性对照。
[0012]在另一优选例中，所述的阳性对照为灭活的出血性大肠杆菌0157:H7菌液，所述的阴性对照为灭菌的改良E.C新生霉素增菌肉汤。
[0013]本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1本发明的单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图
[0015]Lanel:GS2_D3，Lane2:3A8F11B10E7。
【具体实施方式】
[0016]本发明人的研究表明，以出血性大肠杆菌0157:H7作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，分离纯化得到两株抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体，即3A8F11B10E7，保藏号CGMCC N0.8458和GS2-D3，保藏号CGMCC N0.6610，上述两株单克隆抗体的抗体效价可达到1:100000，其能够特异性、高效地与出血性大肠杆菌0157:H7结合。以上述单克隆抗体3A8F11B10E7包被酶标反应板作为捕捉抗体，用辣根过氧化物酶标记的上述单克隆抗体GS2-D3作为检测抗体，制作酶联免疫检测试剂盒，结果显示，上述出血性大肠杆菌0157:H7检测试剂盒检测灵敏度达到105cfu/ml，具有重复性、准确性好的优点，孔间误差小于5%，板内CV小于3%。其与单增李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、蜡样芽孢杆菌、其他大肠杆菌等共计76种病原细菌均无交叉反应。
[0017]在此基础上，本发明人进而根据双抗体夹心酶联免疫法，经过反复测试，终于获得了一种可快速、高效检测食源性出血性大肠杆菌0157:H7的酶联免疫试剂盒。
[0018]抗体
[0019]本发明包括两株抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体。本发明的两株抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体可以利用小鼠杂交瘤细胞系3A8F11B10E7 (CGMCC N0.8458)和小鼠杂交瘤细胞系GS2-D3 (CGMCC N0.6610)分别分泌产生。
[0020]本发明包括具有抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体3A8F11B10E7和GS2-D3的相应氨基酸序列的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性，较佳地至少95%同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括:药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
[0021]对于本发明的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体V链的超变区或互补决定区(complementarity determining region, Q)R)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其⑶R与抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体⑶R具有90%以上(较佳地95%以上)的同源性。本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab ‘)2片段；抗体重链；抗体轻链。
[0022]本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以用常规技术，利用小鼠杂交瘤细胞系3A8F11B10E7 (CGMCC N0.8458)和GS2-D3 (CGMCCN0.6610)获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
[0023]一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0024]此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0025]目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变弓I入本发明蛋白序列中。
[0026]本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0027]宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。
[0028]用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如出血性大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaClJi处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可运用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
[0029]获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0030]在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
口 ο
[0031]检测试剂盒
[0032]本发明人经过广泛的研究和试验，意外地发现，当采用小鼠杂交瘤细胞系3A8F11B10E7 (CGMCC N0.8458)所产生的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体作为捕捉抗体捕获出血性大肠杆菌0157:H7后，再用可检测的标记物标记的由小鼠杂交瘤细胞系GS2-D3 (CGMCC N0.6610)所产生的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体作为检测抗体，可以极其有效地结合于出血性大肠杆菌0157:H7，从而通过双抗夹心法高灵敏度地检测出血性大肠杆菌0157: H7。
[0033]如本文所用，所述的“样品”是指食品、人畜粪便、呕吐物等物质，包括但不限于:血清、血浆、粪便、食品等的增菌液。优选的，所述的样品是食品。
[0034]如本文所用，所述的“捕捉抗体”、“包被抗体”、“第一抗体”与“一抗”可互换使用，都是指所述的可特异性地结合于出血性大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体，其由小鼠杂交瘤细胞系 3A8F11B10E7，CGMCC N0.8458 产生。
[0035]所述的捕捉抗体可被包被在固相载体上。本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与捕捉抗体相偶联(连接)即可。例如，所述的固相载体为酶标反应板。
[0036]如本文所用，所述的“检测抗体”、“第二抗体”、“酶标抗体”与“二抗”可互换使用，都是指可特异性结合于出血性大肠杆菌0157:H7的另一株单克隆抗体，其由小鼠杂交瘤细胞系 GS2-D3, CGMCC N0.6610 产生。
[0037]如本文所用，所述的“特异性”是指抗体只能结合于出血性大肠杆菌0157:H7 ;更特别地，指那些能与出血性大肠杆菌0157:H7结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。
[0038]本发明人进而根据双抗夹心法的原理，制备了一种可用于检测样品中出血性大肠杆菌0157:H7的酶联免疫试剂盒。双抗夹心法常规的做法是将捕捉抗体固定于载体，然后捕捉抗体与抗原反应，洗涤后再与检测抗体反应(所述的检测抗体携带可检测标记物，或可与携带可检测标记物的物质结合)，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。并且，相对于单抗体的竞争法来说，双抗体夹心法的测定效果更为优良，因而测定时只需很少的样品量。所以采用双抗体夹心法无论在灵敏度、精确度、准确度、特异性及稳定性上更具有优势。
[0039]具体而言，本发明的酶联免疫试剂盒含有:
[0040]Ca)酶标反应板,所述的酶标反应板上包被有作为捕捉抗体的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体3A8F11B10E7，所述的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体3A8F11B10E7 由小鼠杂交瘤细胞系 3A8F11B10E7，CGMCC N0.8458 产生；
[0041](b)容器a，所述的容器a中装有作为检测抗体的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体GS2-D3，所述的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体GS2-D3由小鼠杂交瘤细胞系GS2-D3, CGMCC N0.6610 产生。
[0042]作为本发明的优选方式，所述的检测抗体带有可检测的标记物。
[0043]如本文所用，所述的“可检测的标记物”是指用于确定待检测样品中出血性大肠杆菌0157:H7的存在与否以及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所采用的捕捉抗体和/或检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中出血性大肠杆菌0157:H7的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。所述的标记物可直接被设置于检测抗体上；或者，所述的标记物也可被设置于特异性抗检测抗体的抗抗体上，本领域人员可根据所采用的抗体的种类和特性，选择适宜的标记物。例如，所述的标记物可以选自:辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸醋酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。
[0044]当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。如本文所用，所述的“与标记物相对应的底物”是指可被标记物所催化显色，用于显示检测抗体与出血性大肠杆菌0157:Η7发生结合的识别信号。所述的底物例如:用于辣根过氧化物酶的邻苯二肢(0PD)、四甲基联苯肢(TMB)、ABTS ;用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸醋(p_nitro phenylphosphate, p-NPP)等等。本领域人员可根据所采用的标记物的种类和特性,选择适宜的底物。
[0045]作为本发明的优选方式，所述的检测抗体与标记物直接相连接。更优选地，所述的标记物是HRP。与以生物素标记检测抗体、反应后再与链亲和素HRP反应相比较，直接在检测抗体上标记HRP、反应结束后直接加底物显色更为简单便捷。
[0046]为了获得定量结果，还可以在检测过程中设置含已知浓度的多个出血性大肠杆菌0157:H7的标准品。对于标准品的设置方法可采用常规的方法。
[0047]为了消除假阳性和假阴性，也可在检测过程中设置质控(对照)。作为本发明的优选方式，所述的阳性对照为灭活的出血性大肠杆菌0157:H7菌液，所述的阴性对照为灭菌的改良E.C新生霉素增菌肉汤。
[0048]此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如(但不限于):显色剂、洗涤液、终止液、增菌液、稀释液。
[0049]此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。
[0050]本发明的酶联免疫试剂盒的检测原理及有益效果如下:
[0051]本发明的试剂盒采用的是双抗体夹心酶联免疫法。当在酶标反应板上预包被有抗出血性大肠杆菌0157: H7单克隆抗体(捕捉抗体)，加入样品溶液或标准品后，再加入带有可检测的标记物如辣根过氧化物酶的另一株抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体(检测抗体)，样品或标准品中存在的出血性大肠杆菌0157:H7就会与酶标反应板上包被的捕捉抗体相结合，待加入检测抗体后，会形成“抗体一抗原一酶标抗体”复合物，经过TMB (四甲基联苯胺)显色后会形成黄色物质，从而可判断样品中出血性大肠杆菌0157: H7的存在与否以及存在的量。
[0052]用酶标仪于450nm下测定吸光度值。阴性对照≤0.1、阳性对照≤0.3，实验结果有效，否则结果判定为无效；检测孔OD值> 0.2时，判定为阳性；检测孔OD值介于0.1-0.2之间时，判定为弱阳性；检测孔OD值< 0.1判定为阴性。
[0053]试验表明，本发明的出血性大肠杆菌0157:H7酶联免疫试剂盒，有较高的灵敏度和准确度。板间误差小于5%，板内CV小于3%。与单增李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、蜡样芽孢杆菌、其他大肠杆菌等共计76种病原细菌均无交叉反应，此为本发明的最大创新点。
[0054]总之，本发明的试剂盒对样品的前处理要求低，操作简便，检测极限为105cfu/ml，特异性和稳定性好，并与大多数食源性致病菌都没有交叉反应。
[0055]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人,分子克隆:实验室指南(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0056]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0057]实施例1.抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体3A8F11B10E7和GS2-D3的制备
[0058]一、免疫原和阳性标准品的准备
[0059]出血性大肠杆菌0157:H7 (ATCC43895)接种在山梨醇麦康凯(SMAC)平板上，37°C培养24h，挑取单菌落于改良E.C新生霉素增菌肉汤，37°C、150r/min振荡培养17h，计数，加入0.3%甲醛溶液室温灭活I天。用生理盐水调整出血性大肠杆菌0157:H7(ATCC43895)浓度至5X109cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为108cfu/ml作为阳性对照标准品，改良E.C新生霉素增菌肉汤为阴性对照标准品。
[0060]二、单克隆抗体的制备
[0061]I)实验动物:选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。
[0062]2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。
[0063]3)采血:3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
[0064]4)细胞融合:取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下常规融合，分别接种于96孔培养板，置于37°C、5%C02培养箱培养。
[0065]5)杂交瘤细胞筛选:采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将其转移至24孔培养板。
[0066]6)克隆培养及抗体制备:用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克�。绱朔锤�3 — 4次，直至阳性率达到100%。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X IO6个杂交瘤细胞，7?10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化抗体。
[0067]三、单克隆抗体的效价测定
[0068]出血性大肠杆菌0157:H7培养基如下:国标:GB4789.38-2012
[0069]EC 肉汤(E.coli broth)
[0070]成分:胰蛋白胨或胰酪胨20.0g，3号胆盐或混合胆盐1.5g，乳糖5.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4) 4.0g,磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5g，氯化钠 5.0g,蒸馏水 1000.0mL ；
[0071]制法:将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH6.9±0.1，121°C高压灭菌15min。
[0072]单克隆抗体效价测定的步骤如下:
[0073](I)将饱和培养细菌抗原连同培养基在对应的孔中加入100μ 1，4°C过夜(约包板36h)。
[0074](2)倒空液体并拍干残留液体，用250 μ I洗涤液清洗3次。
[0075](3)每个孔中加 100 μ 11%BSA，37°C封闭 lh。
[0076](4)倒空液体并拍干残留液体，用250 μ I洗涤液清洗3次。
[0077](5)每个孔中加100μ I血清，37°C孵育lh。
[0078](6)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250 μ IPBST洗涤液洗涤3次。
[0079](7)每个孔中50μ I的HRP标记的二抗(sigma)，室温孵育lh。
[0080](8)用洗涤液浸泡5min，倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250 μ IPBST洗涤液洗涤3次。
[0081](9)每个孔中加100μ I底物，显色30min，加终止液100 μ I并立即在OD45tl读数。
[0082]表1.两株单克隆抗体效价测定结果(OD45tl)
[0083]
【权利要求】
1.一种用于检测出血性大肠杆菌0157:H7的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有: (a)固相载体，所述的固相载体上包被有作为捕捉抗体的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体3A8F11B10E7，所述的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体3A8F11B10E7由小鼠杂交瘤细胞系3A8F11B10E7，CGMCC N0.8458产生； (b)容器a，所述的容器a中装有作为检测抗体的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体GS2-D3，所述的抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体GS2-D3由小鼠杂交瘤细胞系GS2-D3, CGMCC N0.6610 产生。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的固相载体为酶标反应板。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测抗体带有可检测的标记物。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的可检测的标记物为辣根过氧化物酶。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有阳性对照和阴性对照。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为灭活的出血性大肠杆菌0157:H7菌液，所述的阴性对照为灭菌的改良E.C新生霉素增菌肉汤。
【文档编号】G01N33/577GK103792361SQ201410028098
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】刘箐, 郭慧琴 申请人:上海理工大学
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