专利名称：：用于体外检测生物人工肝功能性的组合物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物人工肝检测用医学试验配制品，具体涉及一种用于体外检测生物人工肝功能性的组合物。本发明还涉及上述组合物的制备方法。
背景技术：
：我国是重型肝炎、肝衰竭的高发国家，每年有数万例患者会发生该�。骄劳雎饰�3040%，晚期患者死亡率更高达7080%。因为病情进展很快，多数患者黄胆迅速加深，并出现出血、昏迷、腹水等严重并发症，而内科药物治疗效果差，预后不良。肝衰竭内科保守治疗效果较差，而肝移植目前受到供体严重短缺等因素的制约，因此非内科药物治疗成为当前研究的热点。人工肝支持系统已被国内外学者证明具有良好的临床治疗效果。人工肝支持系统可以分为非生物人工肝支持系统和生物人工肝支持系统。由于技术不断成熟和完善，疗效确切，非生物人工肝支持系统逐渐成为治疗肝衰竭的常规手段。随着新型材料的不断开发和技术的不断进步，非生物人工肝支持系统的血液净化效果不断提高，已成为体外人工肝支持的重要手段，.但非生物人工肝也存在着自身难以克服的缺陷，如血浆置换虽对肝衰竭具有较好的治疗作用，但存在诸如过敏反应、低血压等副作用，以及输血感染的风险；分子吸附再循环系统(MARS)系统价格昂贵，国内大多数肝功能衰竭病人为此而未能得到MARS的救治；非生物人工肝支持系统主要的功能是解毒，并不能改变患者的预后，即不能完成肝脏合成代谢后的转化的功能。随着肝细胞分离、培养和克隆技术以及生物反应器的日趋成熟，新一代以培养肝细胞为基础的现代生物人工肝被认为是目前治疗肝衰竭最有前途的手段。生物人工肝的研究过程中需要对其功能性(如有效性和安全性)进行体外评估，现有的做法是使用肝衰竭模型动物的血浆来模拟人类患者的血浆进行检测和评估。然而，形成动物肝衰竭模型的方法差异以及动物的个体差异，会使得肝衰竭血浆成分变化的不一致性，即使是使用的是人类患者的血浆，也会因发病地区、发病机制、患者个体和治疗方法的不同而使得血浆成分有所不同。因此，导致体外检测结果不准确，生物人工肝难以大规模使用。另外，作为检测用的血桨还必须对人工生物肝的生物反应器部分无不良反应，且无外源性污染和疾病传播的风险。所以有必要提供一种可模拟肝衰竭血浆并在同一基线水平检测生物人工肝的有效性和安全性的组合物。该组合物还应满足对反应器部分无不良反应且无外源性污染和疾病传播的风险的要求。而且，为可广泛应用，该组合物应可大规模制备。
发明内容本发明的目的之一在于提供一种用于体外检测生物人工肝的功能性的组合物，其包含浓度为171-342pmol/L的未结合胆红素或胆红素二钠、浓度为100-200^mol/L胆汁酸、浓度为240-400pmol/L的氨和细胞培养基。在本发明的一个实施方式中，细胞培养基可以为无血清培养基或者人血白蛋白浓度范围为5-10g/L的RPMI-1640或DMEM;优选为人血白蛋白浓度范围为5-10g/L的RPMI-1640或DMEM。在本发明的另一个实施方式中，胆汁酸为鹅去氧胆酸和胆酸，其中鹅去氧胆酸浓度为80-160pmol/L，胆酸浓度为20-40pmol/L。在本发明的另一个实施方式中，该组合物中的氨来源于非氧化性酸的铵盐，例如NH4Cl、NH4Br或(NH4)3P04，优选为氯化铵(NH4Cl)。本发明的另一个巨的在于提供上述组合物的制备方法，其包括(a)提供细胞培养基；(b)将未结合胆红素或胆红素二钠加入所述细胞培养基，使得组合物中胆红素的浓度为171-342pmol/L;(c)将胆汁酸加入所述细胞培养基，使得组合物中胆汁酸的浓度为腸-200拜ol/L;(d)将铵盐加入所述细胞培养基，使得组合物中氨的浓度为240-400jimol/L。在本发明方法的一个实施方式中，上述步骤(b)和步骤(c)的顺序颠在本发明方法的另一个实施方式中，步骤(a)中所述细胞培养基为无血清培养基，或者是人血白蛋白浓度范围为5-10g/L的RPMI-1640或DMEM;优选为人血白蛋白浓度范围为5-10g/L的RPMI-1640或DMEM。在本发明方法的另一个实施方式中，步骤(c)中所述胆汁酸为鹅去氧胆酸和胆酸。在本发明方法的另一个实施方式中，步骤(d)中所述铵盐为非氧化性酸的铵盐，例如NH4Cl、NH4Br或(NH4)3P04，优选为氯化铵。本发明提供的能够体外检测生物人工肝功能性的组合物，其是在以往对肝脏的生理功能和肝衰竭患者的血浆成分的变化的研究基础上研发出来的，该组合物能够很好地反映肝脏衰竭患者的肝脏代谢功能、分泌功能和合成功能的损害。将该组合物通过生物人工肝的生物反应器部分，通过检测混合液中可反映肝脏代谢、分泌和合成功能物质浓度的变化来检测生物人工肝的体外功能性(有效性和安全性)。本发明提供的组合物中反映肝衰竭的物质的浓度可以稳定在一个水平，不会具有因动物的个体差异和不同方法致动物肝衰竭模型时肝衰竭血浆成分变化水平的不一致性，其能够很好地在同一基线水平检测生物人工肝功能，而且本发明几乎对生物反应器部分无不良反应，更无外源性污染和疾病传播问题。本发明组合物所含的各组分来源丰富、成本低，且本发明组合物的制备方法简单，因此可以大规模制备。具体实施方式为更好地理解本发明，以下通过具体实施方式来进一步详细描述本发明。本发明所用试剂未结合胆红素、二甲基亚砜、RPMI1640培养基、鹅去氧胆酸、胆酸、铵盐均购于天津Alfa公司。浓度为20%的人血白蛋白购于上海莱仕血制品公司。仪器杜邦AR型全自动生化分析仪(购自美国杜邦公司)；血氨的测定试剂盒(购自长春汇力生物技术有限公司)。实施例1①将O.lg未结合胆红素在5(TC溶于10ml的二甲基亚砜，备用；②25ml的浓度为20%的人血白蛋白加入965mlRPMI1640培养基，边加白蛋白边振荡，使其浓度均匀；③溶解在二甲基亚砜中的未结合胆红素逐滴加入含人血白蛋白的RPMI1640培养基，边加边振荡；④将32mg的鹅去氧胆酸和10mg胆酸加入步骤③所得的混合物中，均匀振荡使其溶解。⑤在混合物温度降至室温时，将13mg氯化铵加入步骤④所得的混合物中，均匀振荡使其溶解。统计学处理采用Mean士SDSPSS13.0进行统计学分析。P<0.05表示差异显著。将配制好的组合物分别置于4t:和37'C的环境中，并在O、12和24小时时取样，每次取三个标本，用杜邦AR型全自动生化分析仪，血氨的测定试剂盒检测各时间点组合物所包含的各物质的浓度。结果发现在O、12和24小时的时间内，各物质浓度的变化无显著性差异(P>0.05，检测值见表l和表2)。表l——4'C时组合物中各物质的浓度变化(Mean士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2^37i:时组合物中各物质的浓度变化(Mean士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从上表可看出，在4。C和37-C时，以上述各物质浓度配制而成的组合物是可以稳定存在的。实施例2①将0.2g未结合胆红素在50'C溶于20ml的二甲基亚砜，备用；②将50ml的20%的人血白蛋白加入930mlRPMI1640培养基，边加白蛋白边振荡，使其浓度均匀；③将溶解在二甲基亚砜中的未结合胆红素逐滴加入含人血白蛋白RPMI1640培养基，边加边振荡；将60mg的鹅去氧胆酸和20mg胆酸加入步骤③所得混合物中，均匀振荡使其溶解；⑤在混合物温度降至室温时，将20mg氯化铵加入步骤④所得混合物中，均匀振荡使其溶解。统计学处理采用Mean士SD检验，用SPSS13.0软件进行统计学分析。P〈0.05表示差异显著。将配制好的组合物分别置于4'C和37"C的环境中，并在0、12和24小时取样，每次取三个标本用杜邦AR型全自动生化分析仪，血氨的测定试剂盒检测各时间点组合物所包含的各物质的浓度。结果发现在0、12和24小时的时间内，各物质浓度的变化无显著性差异(P>0.05，检测值见表3和表4)。表3^4。C时组合物中各物质的浓度变化(Mean士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>0.827结果说明在4T:和37"C时，以上述的各物质浓度配制而成的组合物是可以稳定存在的。实施例3①将32mg的鹅去氧胆酸和10mg胆酸加入1000ml无血清培养基中，均匀振荡使其溶解；②将0.11g胆红素二钠加入上述混合液中，边加边振荡；③将24mg溴化铵加入步骤②的混合液中，均匀振荡使其溶解。统计学处理采用Mean士SDSPSS13.0进行统计学分析。P<0.05表示差异显著。将配制好的组合物分别置于4'C和37。C的环境中，并在O、12和24小时时取样，每次取三个标本，用杜邦AR型全自动生化分析仪，血氨的测定试剂盒检测各时间点组合物所包含的各物质的浓度。结果发现在O、12和24小时的时间内，各物质浓度的变化无显著性差异(P>0.05，检测值见表5和表6)。表5——4'C时组合物中各物质的浓度变化(Mean土SD)时间项目O小时12小时24小时P值未结合胆红素Ounol/L)174.50±0.36174.2±0.40174.4±0.350.722氨(pmol/L)243.33±1.53242.3±1.15242.6土2.080.889鹅去氧胆酸(Hmol/L)80.77±0.3880.53±0.2180.43±0.120.483胆酸(Hmol/L)21.17±0.1521.20±0.2021.23±0.150.679表6——37^时组合物中各物质的浓度变化(Mean士SD)时间项目o小时12小时24小时P值未结合胆红素(Hmol/L)174.1±0.35174.7±0.29174.6±0.170.207氨(拜ol/L)242.0±1.73243.0±2.00242.3±1.530.787鹅去氧胆酸(Hmol/L)81.20±0.3680.80±0.1080.73±0.060.079胆酸(拜ol/L)22.80±0.5022.33±0.2122.63±0.060.261实施例4①将60mg的鹅去氧胆酸和20mg胆酸加入1000ml无血清培养基中，均匀振荡使其溶解；②将0.23g胆红素二钠加入上述混合液中，边加边振荡；③将48mg溴化铵加入步骤②的混合液中，均匀振荡使其溶解。统计学处理采用Mean土SDSPSS13.0进行统计学分析。P<0.05表示差异显著。将配制好的组合物分别置于4'C和37匸的环境中，并在0、12和24小时时取样，每次取三个标本，用杜邦AR型全自动生化分析仪，血氨的测定试剂盒检测各时间点组合物所包含的各物质的浓度。结果发现在0、12和24小时的时间内，各物质浓度的变化无显著性差异(P>0.05，检测值见表7和表8)。表7~~4-C时组合物中各物质的浓度变化(Mean士SD)时间项目O小时12小时24小时P值未结合胆红素(Hmol/L)341.3±0.25340.9±0.35341.7±0.490.298氨(Hmol/L)398.0±1.53398.3±2.05398.7±1.670.557鹅去氧胆酸(啤ol/L)80.77±0.3880.53±0.2180.43±0.120.336胆酸(Hmol/L)21.17±0.1521.20±0.202L23土0.150.893表8——37'C时组合物中各物质的浓度变化(Mean士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例3和实施例4中的胆红素二钠可如以下方法制备将未结合胆红素(UCB)溶于氯仿中，逐滴加入甲醇和乙醇钠的混合液中(乙醇钠:甲醇=1:6(V:V))，乙醇钠与UCB的摩尔比为1.95:1。将混合液在5(TC真空中蒸发，得到的棕色粉末以氯仿洗两次，以去除未与乙醇钠反应的UCB，真空中去除氯仿，最后得到的胆红素二钠贮存于棕色瓶中备用。或者，实施例3和实施例4中的胆红素二钠可从生产商购买得到。本发明的组合物中胆红素的最低浓度约为正常人胆红素浓度高限的10倍左右，而组合中氨的最低浓度约为正常人血氨浓度高限的4倍左右，可以很好地模拟人肝衰竭患者的血清。所述的用于检测生物人工肝体外功能的组合物可以特异性地反映肝衰竭患者血浆成分的变化，并且各种试剂容易购得，经济便宜，且可大量制备。本发明所述的组合物在4'C和37X:时，未结合胆红素、鹅去氧胆酸、胆酸和氨按上述比例溶解在细胞培养基中，各物质之间可以稳定存在，各成分浓度都稳定地维持在固定的范围内。当用于检测生物人工肝的体外功能，可以很好地在同一基线水平检测生物人工肝的体外功能。虽然本发明已经参考具体的实施方式进行描述，但是本领域技术人员通过阅读上述描述后，将可以对本发明做出显而易见的修改和修饰，而不违背本发明的意图和本质。本发明有意将这些修改和修饰包括在权利要求的范围内。权利要求1.一种用于体外检测生物人工肝的功能性的组合物，其包含浓度为171-342μmol/L的未结合胆红素或胆红素二钠、浓度为100-200μmol/L胆汁酸、浓度为240-400μmol/L的氨和细胞培养基。2.权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述细胞培养基为无血清培养基或者人血白蛋白浓度范围为5-10g/L的RPMI-1640或DMEM。3.权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述胆汁酸为鹅去氧胆酸和胆酸，其中鹅去氧胆酸浓度为80-160nmol/L，胆酸浓度为20-40|iimol/L。4.权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述氨来源于非氧化性酸的铵盐。5.权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述非氧化性酸的铵盐选自NH4C1，NH4B,(NH4)3P04。6.权利要求l所述的组合物，其特征在于，所述氨来源于NH4C1。7.权利要求1所述的组合物的制备方法，其包括(a)提供细胞培养基；(b)将未结合胆红素或胆红素二钠加入所述细胞培养基，使得组合物中胆红素的浓度为171-342|nmol/L;(c)将胆汁酸加入所述细胞培养基，使得组合物中胆汁酸的浓度为100-200拜ol/L;(d)将铵盐加入所述细胞培养基，使得组合物中氨的浓度为240-400Hmol/L。8.权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)和步骤(c)的顺序颠倒。9.权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中所述细胞培养基为无血清培养基或者人血白蛋白浓度范围为5-10g/L的RPMI-1640或DMEM。10.权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中所述胆汁酸为鹅去氧胆酸和胆酸，其中鹅去氧胆酸浓度为80-160pmol/L，胆酸浓度为20-40拜ol/L。11.权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(d)中所述铵盐为非氧化性酸的铵盐。12.权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)中所述铵盐为NH4C1。全文摘要本发明提供的组合物含有浓度为171-342μmol/L的胆红素或其衍生物、浓度为100-200μmol/L胆汁酸、浓度为240-400μmol/L的氨和细胞培养基。组合物中反映肝衰竭的物质的浓度可以稳定在一个水平，不会具有因动物的个体差异和不同方法致动物肝衰竭模型时肝衰竭血浆成分变化水平的不一致性，其能够很好地在同一基线水平检测生物人工肝体外功能，而且本发明几乎对生物反应器部分无不良反应，更无外源性污染和疾病传播问题。本发明组合物所含的各组分来源丰富、成本低，且本发明组合物的制备方法简单，因此可以大规模制备。文档编号G01N33/72GK101556275SQ20091003958公开日2009年10月14日申请日期2009年5月19日优先权日2009年5月19日发明者蒋泽生,颖郭,森高,毅高申请人:南方医科大学珠江医院
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