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专利名称：胚胎干细胞特异性标志物GM-CSFRα及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学及免疫学领域，具体地说，涉及胚胎干细胞特异性标志物GM-CSFR a及其应用。
背景技术：
胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES cells)是指从胚胎内细胞团分离获得的，能在体外长期培养并保持自我更新能力和分化为所有三个胚层细胞潜能的正常二倍体细胞。胚胎干细胞的高度自我更新能力和分化全能性是它区别于其它细胞的重要特征，它的特异性分子标志，对于胚胎干细胞的鉴定、分离以及自我更新和分化机制的研究，有着十分重要的意义。目前常用的胚胎干细胞特异性标志包括转录因子0CT4、NAN0G、REX1等；表面标志物SSEA-l、SSEA-3、TRA-l-60、⑶9等；这些胚胎干细胞标志物相应抗体，已被广泛应用于干细胞检测试剂盒，用于干细胞的鉴定与分离。目前大量研究结果表明，大部分已应用于检测试剂盒的胚胎干细胞特异性标志物抗体并不是直接从胚胎干细胞获得的，例如SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60等抗体是由畸胎瘤细胞免疫获得的；SSEA-3抗体是从小鼠胚胎免疫获得；0CT4、NAN0G这些转录因子的抗体则直接使用蛋白作为免疫原免疫动物所获得的。而且这些标志物的特异性有一定的局限性:它们在一些成体干细胞、正常组织或癌细胞中也有一定表达，胚胎干细胞特异性的膜表面标志数量更是有限。因此，开发更灵敏、特异性更高的胚胎干细胞鉴定试剂意义重大。

发明内容
本发明的目的是提供一种新型的胚胎干细胞特异性标志物GM-CSFR a及其应用。为了实现本发明目的，本发明的一种胚胎干细胞特异性标志物GM-CSFRa (粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体a链)，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明直接以胚胎干细胞作为免疫原，免疫兔子，分离兔子脾脏细胞，与骨髓瘤细胞融合，筛选出产GM-CSFRa兔单克隆抗体的杂交瘤细胞，应用于干细胞的鉴定与分离。本发明提供的GM-CSFRa可作为胚胎干细胞功能性鉴定标志物。GM-CSFRa兔单克隆抗体识别天然构象表位，除鉴定胚胎干细胞全能性以外，可同时用于检测干细胞活性。本发明还提供胚胎干细胞特异性标志物GM-CSFRa在鉴定胚胎干细胞中的应用，用GM-CSFRa单克隆抗体或GM-CSFRa多克隆抗体通过检测抗原抗体相互作用来鉴定胚胎干细胞。所述GM-CSFR a单克隆抗体由杂交瘤细胞株ZJUESRMAB29(保藏号CGMCC N0.7302)产生。检测抗原抗体相互作用的方法，例如免疫细胞化学法ICC、IHC染色或免疫共沉淀等。还可以通过检测细胞中GM-CSFRa基因的表达量来鉴定胚胎干细胞。
本发明进一步提供一种胚胎干细胞检测试剂盒，所述试剂盒包含GM-CSFRa单克隆抗体和/或GM-CSFRa多克隆抗体。所述GM-CSFRa单克隆抗体由杂交瘤细胞株ZJUESRMAB29 (保藏号 CGMCCN0.7302)产生。
本发明还提供产GM-CSFRa单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZJUESRMAB29，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC N0.7302，保藏日期2013年2月5日。本发明还提供由所述杂交瘤细胞株产生的GM-CSFRa单克隆抗体在鉴定胚胎干细胞中的应用。本发明以胚胎干细胞直接作为免疫原，制备的兔单克隆抗体GM-CSFRa或GM-CSFRa多克隆抗体，作为干细胞鉴定试剂，检测的特异性和灵敏度更高，且可用于胚胎干细胞的分离和活性检测。本发明的胚胎干细胞检测试剂盒除了用于鉴定胚胎干细胞全能性以外，还可同时用于检测干细胞活性，拓展了检测试剂盒的功能。


图1为本发明实施例2中IHC染色结果示意图。图2为本发明实施例3中ICC染色结果示意图；其中，ZjuESrMab29为筛选到的GM-CSFRα兔单克隆抗体。图3所示为本发明实施例4中免疫沉淀(IP)实验结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1兔单克隆抗体的制备以小鼠胚胎干细胞(mES)作为免疫原，每次用I X IO8个mES免疫3月龄新西兰大白兔，免疫4次，每次免疫间隔3周。四次免疫后取血清，免疫细胞化学检测阳性后静脉注射I X IO8个mES细胞加强免疫，加强3天后，分离兔脾脏细胞，与骨髓瘤细胞240E-W2(购自Epitomics公司)融合，筛选出产生GM-CSFRa兔单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZJUESRMAB29(保藏号CGMCC N0.7302)，应用于干细胞的鉴定与分离。实施例2GM_CSFRa作为胚胎干细胞标志物的应用GM-CSFRa的表达随细胞分化减少，在成体组织中局限表达，可作为新的胚胎干细胞鉴定标志物。IHC染色实验:准备好各组织冷冻切片；将各组织冷冻切片置于3%过氧化氢中10分钟，使内源性过氧化物酶失活；冷冻切片用封闭液(含10%山羊血清和1%BSA的PBS)37°C封闭I小时；加入一抗(实施例1中制备的GM-CSFRa兔单克隆抗体)37°C孵育I小时；然后加入羊抗兔-HRP 二抗37°C孵育I小时；最后用新鲜配制的3，3' -diaminobenzidine (DAB)于37°C显色5分钟，观察读片。结果如图1所示。IHC染色结果显示=GM-CSFRa在小鼠睾丸中高表达，在肾脏和脾脏中弱表达，在脑、心、肝和肺中无表达，特异性高。实施例3GM_CSFRa作为胚胎干细胞标志物的应用ICC染色实验证明GM-CSFRa兔单抗可应用于胚胎干细胞的鉴定与分选。ICC实验:培养细胞用4%甲醛(Sigma)于37°C固定1.5小时；然后用封闭液(含10%山羊血清和1%BSA的PBS)37°C封 闭I小时；封闭后的细胞加入一抗(实施例1中制备的GM-CSFRa兔单克隆抗体)37°C孵育I小时；PBS洗涤；洗涤后的细胞加入二抗37°C避光孵育45分钟；最后用0.5 μ g/ml Hochest33258 (Sigma)核染色5分钟；突光显微镜(OlympusIX-70)下观察并拍照。结果如图2所示。GM-CSFRa兔单抗ICC染色结果显示:未分化的mES细胞与培养3天后分化的细胞对比，未分化的mES染色阳性，分化的mES染色阴性。实施例4GM_CSFRa作为胚胎干细胞标志物的应用活细胞结合一免疫沉淀实验证明GM-CSFRa兔单抗识别天然构象抗原。采用两种方法进行免疫沉淀(IP)实验:1.1 经典 IP (Classic IP)IO8个ES细胞采用RIPA裂解液裂解，与实施例1中制备的GM-CSFR α兔单抗充分混合，再使用ProA resin分离抗原抗体复合物,经SDS-PAGE分离蛋白，银染检测。1.2 活细胞 IP (Live cell IP)IO8个ES活细胞与实施例1中制备的GM-CSFR α兔单抗充分混合，然后采用RIPA裂解液裂解，再使用ProA resin分离抗原抗体复合物，经SDS-PAGE分离蛋白，银染检测。结果显示:只有在活细胞IP条件下可以获得特异性条带，证明GM-CSFRa兔单抗识别天然构象表位。(图3)虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之 作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.胚胎干细胞特异性标志物GM-CSFRa，其氨基酸序列如SEQID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.胚胎干细胞特异性标志物GM-CSFRa在鉴定胚胎干细胞中的应用，其特征在于，用GM-CSFR a单克隆抗体或GM-CSFR a多克隆抗体通过检测抗原抗体相互作用来鉴定胚胎干细胞。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述GM-CSFRa单克隆抗体的制备方法为:直接以胚胎干细胞作为免疫原，免疫实验动物，分离动物脾脏细胞，与骨髓瘤细胞融合，筛选出产GM-CSFRa单克隆抗体的杂交瘤细胞。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，产GM-CSFRa单克隆抗体的杂交瘤细胞株为 ZJUESRMAB29，保藏号 CGMCC N0.7302。
5.根据权利要求2-4任一项所述的应用，其特征在于，检测抗原抗体相互作用的方法为免疫细胞化学法ICC、IHC染色或免疫共沉淀。
6.胚胎干细胞特异性标志物GM-CSFRa在鉴定胚胎干细胞中的应用，其特征在于，通过检测细胞中GM-CSFRa基因的表达量来鉴定胚胎干细胞。
7.胚胎干细胞检测试剂盒，其特征在于，包含GM-CSFRa单克隆抗体和/或GM-CSFR a多克隆抗体。
8.根据权利要求7所述 的试剂盒，其特征在于，所述GM-CSFRa单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.7302的杂交瘤细胞株ZJUESRMAB29产生。
9.产GM-CSFRa单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZJUESRMAB29，其保藏号为CGMCCN0.7302。
10.由权利要求9所述杂交瘤细胞株产生的GM-CSFRa单克隆抗体在鉴定胚胎干细胞中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种新型的胚胎干细胞特异性标志物GM-CSFRα(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体α链)及其应用。本发明以胚胎干细胞直接作为免疫原，制备的GM-CSFRα多克隆抗体或兔单克隆抗体GM-CSFRα，作为干细胞鉴定试剂，检测的特异性和灵敏度更高，且可用于胚胎干细胞的分离和活性检测。包含GM-CSFRα多克隆抗体或兔单克隆抗体GM-CSFRα的胚胎干细胞检测试剂盒除了用于鉴定胚胎干细胞全能性以外，还可同时用于检测干细胞活性，拓展了检测试剂盒的功能。
文档编号G01N33/68GK103193882SQ20131015588
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月26日 优先权日2013年3月29日
发明者宋秀丽, 谭舟, 张铭, 顾斌, 张佳蓉, 侯倩女 申请人:浙江大学