专利名称：一种检测ⅱ型志贺毒素的elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种ELISA试剂盒，具体而言涉及检测II型志贺毒素(StxII)的ELISA试剂盒，还涉及该ELISA试剂盒中单克隆抗体S2D8和S2C6的制备和试剂盒的使用方法。
背景技术：
肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli, EHEC)感染是一种重要的人畜共患�。谑澜绺鞯匕ǚ⒋锛胺⒄怪泄叶加辛餍校涓腥揪哂斜┓⑿浴⑶苛业闹虏⌒杂胫滤佬缘忍氐悖殉晌蛐缘墓参郎侍猓匀死嘟】倒钩删薮笸�。EHEC感染可使人患腹湾(Diarrhea)、出血性结肠炎(Hemorrhagic Colitis, HC),还可引发溶血性尿毒综合征(Hemolytic Uremic Syndrome, HUS)、血栓性血小板减少性紫癒(ThromboricThromobocytopenic Porpura, TTP)等严重并发症,特别是HUS可对患者肾脏造成不可恢复性的功能损伤，病死率较高。我国江苏、安徽及河南三省交界部分地区于1999-2000年多次暴发了 EHEC0157:H7感染性腹泻病并发急性肾衰，先后共有230例患者发展成HUS，死亡205人，恢复者也造成了肾脏、神经系统功能损伤等后遗症。另外我国西部、中原、东北、华北也多次散在发生过EHEC疫情，且每年均有流行的报道。美国2006年夏季也发生了由于食用污染的菠菜而导致EHEC 0157:H7感染事件，先后波及26个州，共有183人发�。�29人引发HUS，3人死亡，引起世界广泛关注。目前对EHEC感染临床上缺乏有效的治疗和预防措施，临床研究表明:抗生素可 促使EHEC释放致死性志贺毒素，从而使患者并发HUS的危险性增加。研究表明，EHEC感染的主要致病机理可分为两个方面，一是由菌体基因组毒力岛LEE(Locus of Enterocyte Effacement)编码的多种致病因子所介导的粘附抹平机制(Attaching and Effacing, A/E),通过A/E机制,细菌可破坏肠上皮细胞,粘附并定植于肠道；二是分泌志贺毒素(Shiga toxin, Stx), Stx可以穿越破损的肠上皮细胞进入血液循环，与其受体-丙糖酰基鞘氨醇Gb3或丁糖酰基鞘氨醇Gb4结合，造成肠道、中枢神经系统等器官的损伤，特别是Gb3受体含量较高的肾脏，受损后易引发HUS，危及生命；该毒素分为StxI和StxII两个亚型，临床引起HUS的大多为StxII。临床对EHEC引起的前期腹泻和其他病原体所引起的腹泻在症状上不易区分，抗生素的武断使用一方面杀死大量的菌体，患者腹泻症状减轻，造成表观“康复”的假象，这就使得通过分离病原体进行诊断大多以结果阴性告终，贻误了治疗的最佳时机，另一方面，由于Stx是由整合到EHEC基因组中λ噬菌体基因编码，抗生素的使用容易使残存的细菌进入SOS应激状态，噬菌体从静止的溶源状态进入裂解状态，在肠道内产生大量的Stx毒素，并进入血液循环，使患者发生HUS。因此，如能在患者的血清、或腹泻的血便中检出毒素，则能及时采取免疫干预措施。所以对于EHEC感染的诊断，与其说是对病原体的分离，不如说对毒素的检出。与发达国家不同，我国疫情主要集中在卫生保健条件较差的农村地区，患者主要是农民，就医观念薄弱，大多具有群发性特点，等到卫生机构介入时，疫情已比较严重；目前，与人居住环境关系密切的家畜、家禽带菌情况较为普遍，并且菌群的毒力基因改变明显，从Stx1、StxII并存为主逐步演变为StxII为主，提示EHEC疫情不可能短期内消失。并且我国农村基层医疗卫生机构不同程度存在抗生素滥用的现象，也迫切需要一种以毒素分子为靶向的快速、易操作的诊断方法，作为传统依靠病原体分离进行确诊的补充。
发明内容
为解决上述问题，本发明制备了多株针对StxII的单克隆抗体，并从中筛选出非竞争性的两株单抗，分别为S2D8和S2C6，制备双抗体夹心法ELISA试剂盒，用于EHEC感染的毒素诊断。本发明还公开了上述ELISA试剂盒的使用方法，所述试剂盒能够准确检测出样品中StxII的含量。本发明公开了上述抗StxII的单克隆抗体S2D8，所述单克隆抗体包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID NO:U SEQ ID NO:2所示，其编码基因分别如序列表中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。本发明所述的单克隆抗体S2D8的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。所述单克隆抗体S2D8的重链蛋白质分子可变区的互补决定区⑶R1XDR2、⑶R3的氨基酸序列分别如序列表中 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10 所示。本发明公开了上述抗StxII的单克隆抗体S2C6，所述单克隆抗体S2C6包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID N0:1U SEQ ID N0:12所示，其编码基因分别如序列表中SEQ ID NO:13, SEQ ID N0:14所示。本发明所述的单克隆抗体S2C6的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3 的氨基酸序列，分别如序列表中 SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示。所述单克隆抗体S2C6的重链蛋白质分子可变区的互补决定区⑶R1XDR2、⑶R3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ I D NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20所示。本发明还公开了上述单克隆抗体S2D8和S2C6的制备及钓取其基因的方法，主要包括如下步骤:1.抗StxII单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建首先，原核表达StxII蛋白A亚单位，免疫Balb/c小鼠，首次免疫，StxII蛋白与等体积的福氏完全佐剂混合，腹腔注射；第3周后用等量StxII蛋白与不完全佐剂混合后腹腔免疫；第5周第3次免疫，不加佐剂。取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞混合，用PEG融合上述细胞，用HAT选择培养基重悬，置于37°C，5% CO2培养箱中培养。用间接ELISA法筛选阳性细胞克隆再反复亚克�。钡剿性咏涣鱿赴嘌锨寮觳馕�100%阳性。2.杂交瘤细胞轻、重链基因的钓取提取分泌单克隆抗体S2D8和S2C6细胞的RNA，经RT-PCR，用特异性引物钓取抗体的轻重链基因。常规法连接入载体，转化感受态细菌，培养后挑取单个菌落，提取质粒PCR鉴定后进行DNA测序。3.单克隆抗体S2D8和S2C6可变区氨基酸序列和互补决定区氨基酸序列的分析用www.expasy.0rg在线软件将单克隆抗体S2D8和S2C6的轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列，单克隆抗体S2D8的轻、重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；单克隆抗体S2C6的轻、重链可变区氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO:12 所示；根据Kabat数据库确定单克隆抗体S2D8轻链可变区序列中的互补决定区⑶R1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；重链可变区序列中的互补决定区⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分别如序列表中SEQID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 所示；根据Kabat数据库确定单克隆抗体S2C6轻链可变区序列中的互补决定区⑶R1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示；重链可变区序列中的互补决定区CDRl、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中 SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19 和 SEQID NO:20 所示。基于本发明上述单克隆抗体S2D8和S2C6轻、重链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、单域抗体、嵌合抗体、Fab抗体、抗体融合蛋白等；基于上述基因所编码的多肽或蛋白质，可以交联上多种生物活性分子，制备用于StxII表达水平检测、诊断和治疗StxII所导致疾病的诊断或治疗药物。本发明通过杂交瘤技术共获得5株针对StxII A亚单位的单克隆抗体:S2D8，S2C6，4F5，1G7和11H5，应用双抗体夹心ELISA法，让上述5株抗体彼此配对，选出最佳组合以利于StxII毒素检出，从表I结果可以看出，只有S2D8/S2C6组合，并且只有当S2D8作为包被抗体，而S2C6作为检测抗体时，其检测毒素的OD值最高，达到1.764，而其它组合的OD值均较低。由于上述获得的5株单抗的表位均位于毒素的A亚单位，当两个抗体同时与该抗原结合时，存在着空间位阻。而只有当S2D8作为捕获毒素的抗体、且S2C6作为检测抗体时，由于其彼此之间的阻碍最�。虼讼允镜腛D值也最高，检测StxII效果最好。
本发明还对单克隆抗体S2D8和S2C6重、轻链同种型(Isotype)进行了鉴定，结果显示:单克隆抗体S2D8和S2C6的重、轻链同种型分别为:重链的同种型为G1，而轻链的同种型为K。本发明基于单克隆抗体S2D8和S2C6制备了检测StxII的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括:单克隆抗体S2D8、HRP标记的单克隆抗体S2C6、辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品StXII(100ug/ml，0.1ml)、阴性对照样品BSA、洗液(PBS+0.05%Tween20)。本发明还公开了上述检测StxII的ELISA试剂盒的使用方法，具体步骤如下:I)用 0.1M 的 NaHC03/Na2C03 缓冲液(ρΗ9.6)稀释抗体 S2D8 至浓度为 10 μ g/ml，加入至96孔酶标板，100 μ I/孔，4°C包被过夜，用PBST (在PBS中加入0.05 %的Tween-20)洗I次，加入5%的牛奶4°C封闭过夜；2)按合适的稀释度(1: 2 1: 10)稀释待测样品，加入到包被有抗体S2D8的96孔酶标板中，37°C孵育I小时，用含0.2%吐温的PBS缓冲液洗涤5次；同时设置标准品用于标准曲线的制备，用含有1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBS倍比稀释纯化的 StxII (1000，500，250，125,62.5,31.3，15.6,7.8,3.9,2.0, 1.0)ng/ml,每孔加入100μ 1，同时设空白对照，每个稀释度设复孔；3)用含有I % BSA的PBS按照1: 1000稀释HRP酶标抗体S2C6，于相应孔中加入100 μ I酶标抗体，于37°C水浴孵育I小时，用PBST洗涤5次后；
4)每孔中加入100 μ I ΤΜΒ+Η202底物，室温孵育20分钟，每孔加入100 μ 12Μ的硫酸终止反应，于450nm处测定OD值；5)结果判定:当待测样品的OD值大于空白孔OD值的2倍的视为阳性，待测样品中StxII的具体浓度根据标准品制作的标准曲线确定。本发明还对检测StxII的ELISA试剂盒的灵敏性进行了检测，结果显示本发明的试剂盒能够灵敏的检测样品中StxII的含量，其灵敏度能够达到4ng/ml。本发明检测了上述试剂盒对StxII亚型的敏感性，结果显示本发明所述的试剂盒对StxIIc和StxIIvha亚型也能进行有效的识别。本发明试剂盒的有益效果:1、本发明的ELISA试剂盒，能有效的检测出样品中StxII的含量，其灵敏度达到4ng/ml。2、本发明的ELISA试剂盒，不仅能够识别StxII毒素，还能有效识别StxII毒素的亚型 StxIIc 和 StxIIvha。3、本发明的试剂盒使用方便，质量稳定，准确性高，特别有利于基层医疗卫生机构快速对EHEC的诊断，及时采取措施遏制疫情的蔓延。
图1从杂交瘤细胞中抽提的总 RNA ；图2S2D8重链和轻链基因PCR扩增的电泳图；图3S2C6重链和轻链基因PCR扩增的电泳图；图4检测StxII的ELISA试剂盒的灵敏性检测结果。
具体实施例方式通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。实施例一抗StxII单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建1.材料融合蛋白StxIIA-GST, protein G亲和层析柱,胎牛血清:北京元亨圣马生物技术研究所产品；无血清RPMI 1640 =Gibco公司产品；0ΡΤΙ_ΜΕΜ培养基，福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂，显色试剂TMB =Sigma公司产品；SP2/0细胞:ATCC引进；Balb/c以及C57BL/6小鼠:军事医学科学院实验动物中心提供；其余试剂均为市购。2.方法和结果(I)融合蛋白StxIIA-GST免疫5周龄雌性Balb/c小鼠，100 μ g/只，首次免疫，100μ g抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，腹腔注射；第3周后用等量抗原与不完全佐剂混合后腹腔免疫；第5周第3次免疫，不加佐剂。(2)脾细胞与骨髓瘤细胞的融合:融合前一周，复苏小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0至OPT1-MEM培养基(含10%的胎牛血清)，置于37°C，5% CO2培养箱中培养，融合前3天，将细胞传代一次。融合当天,收获骨髓瘤细胞,并计数,把5.0X IO7骨髓瘤细胞用无血清培养基洗涤2次备用。小鼠经第3次免疫后3-5天，摘除眼球放血、处死。无菌操作取出小鼠脾脏，置灭菌平皿中，分离脾细胞，计数，备用。把等同于小鼠1/2脾脏的脾细胞与骨髓瘤细胞混合，1300rpm离心5min，尽可能去除上清液。在1.5分钟内加入1.5md的50%的PEG，边加边摇匀；然后在8.5分钟内加入20ml的无血清培养基，边加边摇匀。 把经PEG融合的细胞IOOOrpm离心5分钟，除去上清液，加150ml的HAT选择培养基重悬，将融合细胞接种至无菌96孔板150 μ I/孔，置于37°C，5% CO2培养箱中培养4天，每孔补加100 μ I选择培养基。(3)杂交瘤细胞的筛选和克隆:融合后10天，从每孔中吸50 μ I上清，加到包被有StxIIA-GST的96孔ELISA板(用I %的BSA封闭)，室温孵育1.5小时；洗2次。稀释辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)标记的山羊抗小鼠1: 2000，每孔加50 μ I,室温孵育1.5小时；洗涤4次。每孔加入100 μ IHRP底物(Η202+ΤΜΒ)，室温孵育0.5小时，每孔加入100μ12Μ H2SO4，测A450nm值。对于阳性克�。瓷鲜龇椒觳馄涠訥ST标签蛋白的反应性，只有与StxIIA-GST融合蛋白结合而与GST不结合的抗体克隆才被保留，继续下面的实验。收集阳性孔细胞，重悬于HT选择培养基中，采用有限稀释法稀释细胞，并种植于96孔细胞培养板中，5天后观察，对确定只有一个细胞克隆生长的孔，作ELISA进行鉴定。对阳性孔细胞进行有限稀释，经过3-4次单细胞分离培养，直至获得稳定的杂交瘤细胞克隆。大量培养杂交瘤细胞，收集含有抗体的培养上清,用protein G亲和层析柱进行纯化，并透析到PBS中，测浓度，_20°C冻存备用。通过上述杂交瘤技术共获得5株针对StxII A亚单位的单克隆抗体，分别为S2D8，S2C6，4F5，1G7 和 11H5。实施例二应用双抗体夹心ELISA选择最佳抗体配对通过杂交瘤技术实施例1共获得5株针对StxII A亚单位的单克隆抗体:S2D8，S2C6，4F5，1G7和11H5，应用双抗体夹心ELISA法，让上述5株抗体彼此配对，选出最佳组合以利于StxII毒素检出。1.材料NaHC03/Na2C03缓冲液(pH9.6)，Tween-20,牛血清白蛋白，96孔酶标板，活化辣根过氧化物酶:北京泰天和生物科技有限公司；其余试剂均为市购。2.方法结果单抗的包被。用0.1M的NaHC03/Na2C03缓冲液(pH9.6)稀释抗体浓度至10 μ g/ml,加入至96孔酶标板，100 μ I/孔，4°C包被过夜，用PBST (在PBS中加入0.05 %的Tween-20)洗I次，加入5%的牛奶4°C封闭过夜，用PBST洗I次，-20°C冻存备用。单抗与辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)的偶联。把单抗透析至PBS中，调节浓度至lmg/ml。应用北京泰天和生物科技有限公司的产品活化辣根过氧化物酶进行偶联，具体操作参照其公司说明书。在HRP标记抗体中加入50%的甘油，-20°C冻存备用。不同抗体组合检测StxII步骤如下:用含有1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBS稀释纯化的StxII至浓度为10 μ g/ml，每孔加入100 μ 1，于37°C水浴孵育I小时，用PBST洗涤5次。用含有I % BSA的PBS按照1: 1000稀释HRP酶标抗体，按照5株抗体彼此配对的原则，于相应孔中加入100 μ I酶标抗体，于37°C水浴孵育I小时，用PBST洗涤5次后，每孔中加入100 μ IΤΜΒ+Η202底物，室温孵育20分钟，每孔加入100 μ 12Μ的硫酸终止反应，于450nm处测定OD
值。具体结果如表1:表I不同抗体组合检测StxII的效果
权利要求
1.一种抗StxII的单克隆抗体或其片段，包括轻链⑶R1-3和重链⑶R1-3，其特征在于，所述轻链⑶R1-3的氨基酸序列为: CDRl:如序列表中SEQ ID NO:15所示； CDR2:如序列表中SEQ ID NO:16所示； CDR3:如序列表中SEQ ID NO:17所示； 所述重链⑶R1-3的氨基酸序列为: CDRl:如序列表中SEQ ID NO:18所示； CDR2:如序列表中SEQ ID NO:19所示； CDR3:如序列表中SEQ ID NO:20所示。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示。
3.如权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区的编码序列如序列表中SEQ ID NO:13的核甘酸序列所示，所述重链可变区的编码序列如序列表中SEQ ID NO:14的核甘酸序列所示。
4.权利要求1-3中任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备检测StxII或其亚型StxIIc和StxIIvha中的应用。
5.权利要求1-3中任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备治疗StxII或其亚型StxIIc和StxIIvha所引起疾病的药物中的应用。
6.—种检测StxII的ELISA试剂盒,所述试剂盒包括如权利要求1_3任意一项所述的单克隆抗体或其片段。
7.如权利要求6所述的一种检测StxII的ELISA试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒还包括单克隆抗体S2D8，其中单克隆抗体S2D8的轻、重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQID NO:1 和 SEQ ID NO:2 所示。
8.如权利要求6或7任意一项所述的一种检测StxII的ELISA试剂盒，还包括:辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品StxI1、阴性对照样品BSA、洗液(PBS+0.05% Tween20)。
9.一种检测StxII或其亚型StxIIc和StxIIvha的方法,包括以下步骤: 1)用0.1M的NaHC03/Na2C03缓冲液(ρΗ9.6)稀释上述抗体S2D8至浓度为10 μ g/ml,加入至96孔酶标板，100 μ l/孔，4。1:包被过夜，用PBST洗I次，加入5%的牛奶4。°〇封闭过夜； 2)按合适的稀释度(1: 2 1: 10)稀释待测样品，加入到包被有抗体S2D8的96孔酶标板中，37°C孵育I小时，用含0.2%吐温的PBS缓冲液洗涤5次；同时设置标准品用于标准曲线的制备，用含有1%牛血清白蛋的PBS倍比稀释纯化的StxII，标准品StxII倍比稀释后的浓为 1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml、3.9ng/ml、2.0ng/ml、1.0ng/ml，度每孔加入 100 μ I,同时设空白对照,每个稀释度设复孔； 3)用含有10ABSA的PBS按照1: 1000稀释HRP酶标记的上述单克隆抗体S2C6，于相应孔中加入100 μ I酶标抗体，于37°C水浴孵育I小时，用PBST洗涤5次后； 4)每孔中加入100μ l ΤΜΒ+Η202底物，室温孵育20分钟，每孔加入100 μ 12Μ的硫酸终止反应，于450nm处测定OD值； 5)结果判定:当待测样品的OD值大于空白孔OD值的2倍时视为阳性，待测样品中StxII的具体浓度根据 标准品制作的标准曲线确定。
全文摘要
本发明公开了一种检测StxII的ELISA试剂盒，本发明还公开了所述ELISA试剂盒中单克隆抗体S2D8和S2C6的序列信息及制备过程。本发明所述的ELISA试剂盒包括单克隆抗体S2D8、HRP标记的单克隆抗体S2C6、辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品StxII(100ug/ml，0.1ml)、阴性对照样品BSA、洗液液(PBS+0.05％Tween20)。本发明的试剂盒能够灵敏的检测样品中StxII的含量，其灵敏度能够达到4ng/ml，本发明所述的试剂盒还对StxII的亚型StxIIc和StxIIvha能进行有效的识别。
文档编号G01N33/68GK103235140SQ20131013700
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月19日 优先权日2013年4月19日
发明者焦永军, 曾晓燕, 郭喜玲, 史智扬, 汪华, 周明浩 申请人:江苏省疾病预防控制中心
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