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专利名称：一种提高生物发光分析方法灵敏度的方法
技术领域：
本发明属于生物化学分析领域，更确切的说是一种新的提高荧光素酶生物化学分析灵敏度的方法。该发明也包含实施该生物化学分析方法所需的试剂包。
背景技术：
微生物的检测无论是在临床检测还是在工业应用领域都具有重要的意义。当前，对微生物的检测主要采用传统的平板培养计数法，该方法需要较长的时间对微生物在一定条件下进行培养，然后进行平板计数获取微生物的浓度。该方法步骤繁琐、耗时长，很多时候难以满足现场快速检测的要求。ATP生物荧光检测法是近几年发展起来的一种新的微生物检测方法，它具有快速、准确、灵敏等诸多优点。ATP(adenosine triphosphate,中文三磷酸腺苷)作为重要的能量分子存在于所有的生物体内，通过测定一定条件下ATP的数量，可以间接推断微生物的数量或浓度。ATP生物荧光检测法利用微生物细胞内的三磷酸腺苷(ATP)与荧光素-荧光素酶间的复杂生化反应，产生生物荧光，然后通过荧光测定仪或液闪测定仪测定荧光强度。在荧光素、荧光素酶、温度、PH等外界条件相同的情况下，上述荧光强度与ATP的数量成正比关系。
荧光素酶+Mg2+
ATP+荧光素+O2 - AMP+ PPi+氧化荧光素+光 在进行上述生光反应以测试ATP的数量之前，首先需要通过一定的物理、化学手段打破细胞壁和细胞膜以释放ATP。但是，物理方法如机械挤压、煮沸、超声等方法繁琐，有时还较为昂贵，因此，通常采用化学手段释放ATP。常用的化学手段包括各种释放剂，如表面活性剂、酸、碱，甚至有机溶剂等。上述释放反应中的释放液除了满足对ATP释放的目的外，还应具有如下两种作用:一是应迅速钝化释放过程中细胞ATP分解酶，减少或消除其对ATP的分解作用；二是不能对后续生光反应中的荧光素酶带来不利影响。上述对释放液满足生物酶所具有的两种截然相反效果的要求导致对释放液的选择很难两全，通常是兼顾二者要求妥协后的成分，从而降低了生物发光检测的灵敏度。迄今，已经提出了几种上述问题的解决方法。例如，常用的解决方法之一是对释放ATP后的溶液在反应前先稀释到一定浓度(如50倍稀释)，以降低释放剂的浓度，减轻释放液对荧光素酶的影响。但是，这种方法不能过分稀释，否则会减低ATP反应的检测灵敏度，导致两难。美国专利(U.S.Pat.N0.5，558，986)采用环糊精解决释放剂对荧光素酶的抑制作用。环糊精具有锥形结构，外表面亲水而内表面憎水，通过将微生物破壁后的释放剂收容于环糊精的空腔，可以有效减轻后续生光过程中对荧光素酶的活性抑制作用。但是，环糊精自身价格较高，效果有限，且需要额外的加入环糊精步骤，较为繁琐。美国专利(U.S.Pat.N0.7，829，280)采用不溶性树脂沉淀破壁后的释放剂以达到减低释放液对荧光素酶抑制作用的目的。但是，该方法仍然需要额外的加入步骤，此外，还存在需要添加量大，成本高，操作不易等缺点。因此，寻找一种更为简便易行、有效的兼顾ATPase抑制和荧光素酶保护的方法，将对生物发光分析方法的提高和推广具有重要意义。

发明内容
本发明的目的是针对现有ATP生物荧光检测中细胞释放液即离子型表面活性剂对细胞释放过程中对三磷酸腺苷分解酶的抑制和生光过程中对荧光素酶的保护发光反应中荧光素酶活性抑制的问题，提供一种有效的兼顾二者要求的检测方法和检测用试剂盒。本申请人发现，ATP释放用的离子表面活性剂(包括阳离子表面活性剂和阴离子表面活性剂)在过量的情况下形成胶束，可以与具有相反电荷的植物多糖衍生物形成单一相，其原理主要是通过表面活性剂与植物多糖衍生物憎水段的相互作用，达到植物多糖衍生物在表面活性剂胶束作用下溶解，从而形成均一相；上述均一相稀释到一定浓度下后，表面活性剂不能形成胶束，表面活性剂的亲水端(带有电荷)可以与植物多糖衍生物所具有的相反电荷作用，导致絮凝，从而极大地减低溶液中表面活性剂的浓度。利用上述原理，在细胞释放段采用高浓度的表面活性剂，保证细胞释放过程中对ATP的有效释放和ATP分解酶的快速淬灭，细胞释放完毕后，对上述释放液进行稀释，利用多糖的离子电荷将表面活性剂絮凝减低其浓度，以极大降低表面活性剂对后续生光反应中荧光素酶的影响。上述方法可以极大地提高细胞样品荧光生物化学分析的检测灵敏度。本发明提供的高灵敏度生物发光检测方法的检测步骤是:I)制备细胞释放液，该释放液含有高浓度的离子表面活性剂和与表面活性剂具有相反电荷的离子植物多糖衍生物，获得第一种混合液；2)混合第一种混合液与细胞样品，释放ATP，获得第二种混合液；3)将第二种混合液稀释，直至出现絮凝，取上层清夜，获得第三种混合液；4)将第三种混合液与荧光素-荧光素酶混合进行生物发光检测；第一种混合液中所用的离子表面活性剂包括各种阴离子或阳离子表面活性剂以及各自之间的混合物。典型的阴离子表面活性剂包括羧酸盐表面活性剂、硫酸盐表面活性齐U、磷酸盐表面活性剂、磺酸盐表面活性剂以及它们的混合物；典型的阳离子表面活性包括胺盐表面活性剂、季铵盐表面活性剂、杂环类表面活性剂以及它们的混合物等。第一种混合液中所用的离子植物多糖衍生物中所指的植物多糖是植物细胞代谢产生的聚合度超过10个的聚糖，是由许多相同或不同的单糖以a —或β —糖苷键所组成的化合物；将上述植物多糖通过各种化学的或物理的手段衍生化，获得离子植物多糖衍生物。上述离子植物多糖衍生物可以通过市售或实验室合成获得。阳离子化或阴离子化的各种离子植物多糖衍生物均可以作为絮凝表面活性剂的有效成分，典型的离子植物多糖包括海藻胶、豆科植物胶、微生物代谢胶、果胶、蛋白质胶、纤维素胶、甘露胶、淀粉以及它们的混合物等；典型的阴离子植物多糖衍生物包括羧酸盐衍生物、硫酸盐衍生物、磷酸盐衍生物、磺酸盐衍生物以及它们的混合物；典型的阳离子植物多糖衍生物包括胺盐衍生物、季铵盐衍生物、杂环类阳离子衍生物以及它们的混合物等。上述离子植物多糖衍生物可以结合稀释剂、酶抑制中和剂、螯合剂、环糊精、糊精及它们的混合物使用。
在第一种混合液中，所用的离子表面活性剂的优先浓度为0.1% 10% ;离子植物多糖的优先浓度为0.01% 10%，更为优先浓度为0.05 I %，优先电荷密度为0.1 7meq/g。本发明还提供了执行上述高灵敏度生物发光检测方法的试剂盒，包括I)细胞释放液(1-1OOmL)，该释放液含有高浓度离子表面活性剂和与表面活性剂具有相反电荷的离子植物多糖衍生物；2)生物发光试剂(1-1OOmL) ；3)检测用缓冲液；4)ATP标准液(1-500 μ L) ；5)其它试剂。上述提到的化学试剂盒可以应用于生物化学分析，如荧光素酶分析、酶分析、核酸分析、免疫分析等。


图1示出了在细菌样品条件下释放试剂组中添加与未添加阳离子植物多糖衍生物(3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵瓜儿胶)对ATP荧光强度的影响。图2示出了在细菌样品条件下释放剂组中添加与未添加阴离子植物多糖衍生物(羧甲基纤维素)对ATP荧光强度的影响。图3示出了在ATP标准液样品条件下释放试剂组中添加与未添加阳离子植物多糖衍生物(3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵瓜儿胶)对ATP荧光强度的影响。
具体实施例方式下面结合具体的实施例进一步阐述本发明的特点和优点。但是，应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明的优点在于:针对现有的生物发光分析方法中，细胞释放液不能兼顾钝化细胞ATP释放酶和保护荧光素酶的缺点，利用释放液中离子表面活性剂与相反电荷的离子植物多糖衍生物间在不同浓度下相互作用及结果的不同，既实现了对三磷酸腺苷释放酶(ATPase)的抑制又减低了对荧光素酶的负面作用，无需采用妥协方法；本发明的优点还在于实现上述兼顾优点可以在不增加额外操作步骤的情况下实现。实施例1采用大肠杆菌样品(lxl08CFU/mL)进行离子植物多糖衍生物有效性的验证。首先构建生物发光试剂盒，如下:细胞ATP释放试剂组(LY-Ol)由以下成分组成:Tricine (pH7.8): IOmM脱氧胆酸钠:2%EDTA:0.15mMATP发光试剂组(L L-Ol)由以下成分组成::虫突光素酶:5mg/mL虫突光素:1.5mM
Tricine (pH7.8):20mMMg2+:20mM牛血清蛋白:0.5%EDTA:50mMDTT:1mM取大肠杆菌样品50 μ L，分别加入含有O %、0.4%的阳离子植物多糖衍生物(3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵瓜儿胶，简称“阳离子瓜儿胶”)的三磷酸腺苷释放试剂组(LY-Ol) 50 μ L，释放时间4min，稀释10倍，取上清液100 μ L，加入三磷酸腺苷发光试剂组(LL-Ol) 100 μ L，用微量荧光检测仪(北京滨松光子股份的9504型荧光检测仪)立即检测荧光强度，记录荧光值。结果如图1示。检测结果显示了添加阳离子瓜儿胶的三磷酸腺苷释放试剂在同等发光试剂条件下具有远高于未添加阳离子瓜儿胶的发光强度，证明了其对ATP分解酶的抑制作用。实施例2
细胞ATP释放试剂组(LY-02)由以下成分组成:Tricine (pH7.8): IOmM十六烷基三甲基溴化铵(CTAB):1.5%EDTA:0.15mMATP发光试剂组(LL-02)由以下成分组成::虫荧光素酶:3mg/mL虫荧光素:3mMTricine (pH7.8):20mMMg2+:20mM牛血清蛋白:0.5%DTT: ImMEDTA:50mM取大肠杆菌样品50yL，分别加入含有0%、0.4%的羧甲基纤维素钠(CMC)的三磷酸腺苷释放试剂组(LY-02) 50 μ L，释放时间4min，稀释10倍，取上清液100 μ L，加入三磷酸腺苷发光试剂组(LL-02) 100 μ L，用微量荧光检测仪(北京滨松光子股份的9504型荧光检测仪)立即检测荧光强度，记录荧光值。结果如图2示。检测结果显示了添加羧甲基纤维素钠的三磷酸腺苷释放试剂在同等发光试剂组条件下具有远高于未添加羧甲基纤维素钠的发光强度，证明了其对ATP分解酶的抑制作用。实施例3配制ATP 标准液:lxl(T7mol/L。细胞ATP释放试剂组(LY-03)由以下成分组成:Tricine (pH7.8): IOmM脱氧胆酸钠:2%EDTA:0.15mMATP发光试剂组(LL-03)由以下成分组成::
虫荧光素酶:lmg/mL虫突光素:2mMTricine (pH7.8):20mMMg2+:20mM牛血清蛋白:0.5%DTT:1mMEDTA:50mM取ATP标准液50 μ L，分别加入含有O %、0.4 %的阳离子瓜儿胶的三磷酸腺苷释放试剂组(LY-03)50yL，稀释10倍，取上清液100 μ L，加入三磷酸腺苷发光试剂组(LL-03) 100yL，用微量荧光检测仪(北京滨松光子股份的9504型荧光检测仪)立即检测荧光强度，记录荧光值。结果如图3示。检测结果显示了添加阳离子瓜儿胶的三磷酸腺苷释放试剂在同等发光试剂组条件下具有远高于未添加阳离子瓜儿胶的发光强度，证明了其对荧光素酶抑制的减低作用。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种提高生物发光分析方法灵敏度的方法，其特征在于执行生物发光分析过程中，在含有离子表面活性剂的细胞释放液中添加带有相反电荷的离子植物多糖衍生物，利用离子表面活性剂与相反电荷的离子植物多糖衍生物间在不同浓度下相互作用及结果的不同，同时实现细胞释放过程中对三磷酸腺苷分解酶的抑制和生光过程中对荧光素酶的保护作用，提高生物发光分析方法的灵敏度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于细胞释放液中离子表面活性剂与相反电荷的离子植物多糖衍生物指的是:阴离子表面活性剂与阳离子植物多糖衍生物体系，或者阳离子表面活性剂与阴离子植物多糖衍生物体系。
3.权利要求1所述的离子表面活性剂与相反电荷的离子植物多糖衍生物间在不同浓度下相互作用及结果的不同指的是:离子表面活性剂在一定浓度下形成胶束，离子表面活性剂与离子植物多糖衍生物间通过表面活性剂的胶束作用以及它们间憎水段的相互作用，使得植物多糖衍生物溶解而形成均一相；上述均一相稀释到一定浓度后，表面活性剂的浓度不足以形成胶束，表面活性剂亲水端带有的电荷与离子植物多糖衍生物所带有的相反电荷作用，产生絮凝和沉淀。
4.权利要求1中所述的同时实现细胞释放过程中对ATP分解酶的抑制和生光过程中对荧光素酶的保护作用指的是:利用权利要求1和3中所述的离子表面活性剂与相反电荷的离子植物多糖衍生物间在不同浓度下相互作用及结果的不同，在细胞释放阶段，细胞释放液为高浓度的均一相，实现对ATP分解酶的强烈抑制作用；待细胞释放完毕后，对上述释放后溶液稀释，絮凝其中的释放剂及其它杂质，减低释放剂及其它杂质对生光过程中荧光素酶的抑制作用。
5.权利要求1和2所指的离子表面活性剂指的是所有适用于细胞释放用的离子表面活性剂，包括阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂。阴离子表面活性剂包括但不限于羧酸盐表面活性剂、硫酸酯盐表面活性剂、磷酸酯盐表面活性剂、磺酸盐表面活性剂以及它们的混合物；阳离子表面活性剂包括但不限于季铵盐表面活性剂、胺盐型表面活性剂、杂环类表面活性以及它们的混合物。
6.权利要求1和2中所述的离子植物多糖衍生物中的植物多糖指的是植物细胞代谢产生的聚糖，是由许多相同或不同的单糖以α —或β —糖苷键所组成的化合物，包括但不限于海藻胶、豆科植物胶、微生物代谢胶、果胶、蛋白质胶、纤维素胶、甘露胶、淀粉以及它们的混合物；该出所指的衍生物指的是通过对上述植物多糖进行各种衍生化反应而获得的各种衍生植物多糖，包括阴离子植物多糖和阳离子植物多糖。阴离子植物多糖包括但不限于羧酸盐植物多糖、硫酸酯盐植物多糖、磷酸酯盐植物多糖、磺酸盐植物多糖以及它们的混合物；阳离子植物多糖包括但不限于季铵盐植物多糖、胺盐型植物多糖、杂环类表面活性以及它们的混合物。
7.本发明还提供了一种实现权利要求1所述方法配套构建的细胞释放液试剂，其特征在于该释放液含有权利要求5中所指的离子表面活性剂和权利要求6中所指的带有相反电荷的离子植物多糖衍生物。
8.按权利要求书7所述的试剂中离子表面活性剂的浓度为0.1% 10%。
9.按权利要求书7所述的试剂中离子植物多糖的浓度为0.01 % 99%，所带电荷密度为 0.1 7meq/g。
全文摘要
本发明涉及一种新的提高生物发光分析方法灵敏度的方法。本方法针对现有的生物发光分析方法中，细胞三磷酸腺苷(ATP)释放剂(离子表面活性剂)不能同时有效地钝化细胞ATP分解酶(ATPase)和保护荧光素酶(luciferase)的缺点，在ATP释放液中添加带有与离子表面活性剂相反电荷的离子植物多糖衍生物，利用离子表面活性剂与相反电荷的离子植物多糖衍生物间在不同浓度下相互作用及结果的不同，同时实现ATP释放过程中对三磷酸腺苷分解酶的抑制和对荧光素酶的保护作用，提高生物发光分析方法灵敏度。本发明还包括了实现上述方法所配套构建的化学试剂。
文档编号G01N21/76GK103175826SQ201310047919
公开日2013年6月26日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者万冬云 申请人:万冬云