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一种分离颗粒物中浮游植物吸收系数的方法
【专利摘要】一种分离颗粒物中浮游植物吸收系数的方法，用WhatmanGFF滤膜过滤获得水环境样品中颗粒物并进行总颗粒物吸收系数测定以后，利用次氯酸钠吸附漂白提取颗粒物上浮游植物，经超纯水5-10次吸附清洗去除滤膜上次氯酸钠，重新测定得到非色素颗粒物吸收系数，总颗粒物和非色素颗粒物吸收系数差值即为浮游植物吸收系数。与现有的方法相比，该方法能很好消除高浓度非素颗粒物对低浓度浮游植物吸收系数测定的干扰，提高浮游植物吸收系数实验分离精度，且在处理过程中不造成非色素颗粒物的损失，操作简便，精度高，其优势十分明显。
【专利说明】一种分离颗粒物中浮游植物吸收系数的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及对颗粒物中浮游植物吸收系数进行分离的方法，尤其涉及用次氯酸钠吸附漂白浮游植物色素进而确定颗粒物吸收系数和分离浮游植物吸收系数的方法。
【背景技术】
[0002]浮游植物和非色颗粒物吸收很大程度上决定了水体光学特性变化，影响光辐射在水体内的传输分布，进而决定浮游植物和沉水植物的水平与垂直分布和迁移，浮游植物和非色素颗粒物对光谱吸收的竞争影响到浮游植物和沉水植物光合作用、初级生产力以及湖泊生态系统类型转换。同时浮游植物和非色颗粒物吸收是水体水色参数遥感反演基础，如目前叶绿素a生物光学模型的构建都是基于遥感反射率或者离水辐亮度反演出浮游植物吸收系数，再在假定比吸收系数不变的情况下计算获得。因此，如何有效而准确的分离颗粒物中浮游植物的吸收系数，关系到水下光场结构的定量识别，浮游植物等光学组分、初级生产力的定量遥感以及生态系统动力学模型的建立。
[0003]悬浮颗粒物的吸收系数测定采用滤膜富集的方法，通过将滤膜放到分光光度计检测器接受窗口校正由于多次散射造成的有效路径增加。而对于颗粒物浮游植物和非色素颗粒物吸收系数的分离目前已经发展了一些实验和数值分离的方法，其中实验方法主要有两类:(I)在总颗粒物吸收系数测定之后，用甲醇浸泡滤膜提取色素，从而将浮游植物吸收从总颗粒物吸收中分离出来；(2)在滤膜上直接滴加次氯酸钠溶液或者在原水样中添加次氯酸钠溶液对浮游植物色素进行漂白。
[0004]上述两种方法都有一定的应用，其中甲醇浸泡法在海洋水体应用比较多，而次氯酸钠漂白法在浑浊的内陆二类水体被零星使用，但两种均存在比较明显的缺陷或局限性。前一种方法，滤膜浸泡在甲醇溶液中进行色素萃取的同时，不可避免地造成部分非色素颗粒物的损失，尽管可以通过清洗重新富集到滤膜上，但颗粒物在滤膜上分布已发生明显变化。此外，当滤膜上浮游植物浓度非常高时，色素提取会不完全，并且对一些水溶性的或者不能溶于甲醇的色素无法被提取，如藻胆色素(phycobilins)和真核藻类色素等。因此往往造成分离的浮游植物吸收系数在长波675nm附近偏小，而在440nm以下的短波偏大。对颗粒物中非色素颗粒物占绝对主导的样品分离出来的浮游植物吸收系数往往会存在好几倍的误差。后一种方法，向滤膜上滴加次氯酸钠会破坏滤膜上颗粒物分布，造成其分布不均匀，而直接往原水样添加次氯酸钠为了保证水样中氯离子浓度往往需要大量的次氯酸钠溶液，而过滤后很难将滤膜上次氯酸钠清洗掉，致使短波部分非色素颗粒物吸收经常为负值，从而造成分离出来的浮游植物吸收系数不准确。
[0005]然而，对于浑浊的内陆水体，由于非色素颗粒物浓度很高，加之浮游植物色素组成差异很大，因此已有的方法无法准确分离颗粒物上浮游植物吸收系数。

【发明内容】

[0006]本发明目的是建立一种准确、快速的浮游植物吸收系数分离方法，适用于不同浮游植物浓度及比例的环境水体，同时操作方法简便，适用于推广和应用。
[0007]本发明上述目的通过以下技术方案实现:次氯酸钠吸附漂白浮游植物色素进而分离颗粒物吸收系数的方法，具体地，进行总颗粒物吸收系数测定以后，在GFF滤膜周边的定性滤纸上滴上1%的次氯酸钠3-5ml，让次氯酸钠溶液从定性滤纸上慢慢渗浸到GFF滤膜上，置于黑暗环境中进行次氯酸钠吸附漂白滤膜上浮游植物色素10-15分钟。利用超纯水进行5-10次吸附清洗去除滤膜上次氯酸钠，重新测定并计算得到非色素颗粒物吸收系数。
[0008]根据本发明的实施例，本发明提出了一种分离颗粒物中浮游植物吸收系数方法，其包括:(I)将GFF滤膜平铺在湿润的定性滤纸上，在滤膜周边的定性滤纸上滴加1%的次氯酸钠溶液3-5ml，使次氯酸钠溶液从定性滤纸上慢慢渗浸到所述GFF滤膜上，置于黑暗环境中进行次氯酸钠吸附漂白滤膜上浮游植物色素10-15分钟；(2)利用超纯水对步骤(I)中得到的GFF滤膜进行5-10次吸附清洗，以便去除滤膜上残留的次氯酸钠，并且测定非色素颗粒物吸收系数；(3)基于所述非色素颗粒物吸收系数以及将所述GFF滤膜的总颗粒物吸收系数，确定所述浮游植物吸收系数，其中，所述GFF滤膜的总颗粒物吸收系数是通过下列步骤确定的:利用GFF滤膜过滤获得水环境样品中颗粒物，并测定所述GFF滤膜的总颗粒物吸收系数。
[0009]在本发明的一个实施例中，所述1%次氯酸钠溶液是通过对8%的次氯酸钠溶液进行稀释而获得的。
[0010]在本发明的一个实施例中，具体地，包括(a)首先用GFF滤膜过滤水样，并且在分光光度计上测定吸光度，获得总颗粒物吸收系数，其中，所述过滤水样的体积是基于所述水样的浑浊度确定的，其中，利用比色皿测定所述水样的光束衰减系数，取550nm处吸收系数根据如下公式计算取整数后确定所述过滤水样的体积:V=500XC(550)_°_876，其中，V代表所述过滤水样的体积；(b)将在步骤(a)中确定总颗粒物吸收系数的GFF滤膜平铺在湿润的定性滤纸上，在滤膜周边的定性滤纸上滴上1%的次氯酸钠溶液3-5ml，使所述次氯酸钠溶液从定性滤纸上渗浸到GFF滤膜上；(c)将吸附了次氯酸钠的GFF滤膜置于黑暗环境中进行次氯酸钠吸附漂白滤膜上浮游植物色素10-15分钟；(d)将提取漂白后的GFF滤膜置于干燥的定性滤纸上，使得定性滤纸吸附掉GFF滤膜上的次氯酸钠，然后在GFF滤膜周边的定性滤纸上滴上5ml超纯水，让超纯水从定性滤纸上慢慢渗浸到GFF滤膜上，之后将滤膜置于另一张干燥的定性滤纸上，按上述操作反复5-10次，以完全吸附消除GFF滤膜上次氯酸钠；Ce)将步骤(d)得到的GFF滤膜用于非色素颗粒物吸收系数测定。
[0011]在本发明的一个实施例中，步骤(e)中测定的非色素颗粒物吸收系数在671-675nm处平均吸收系数大于676-680nm处平均吸收系数，但小于666-670nm处平均吸收系数。
[0012]在本发明的一个实施例中，如果步骤(e)中测定的非色素颗粒物吸收系数无法满足在671-675nm处平均吸收系数大于676_680nm处平均吸收系数，但小于666_670nm处平均吸收系数，则重复权步骤(a) - (d)，直至满足在671-675nm处平均吸收系数大于676-680nm处平均吸收系数，但小于666_670nm处平均吸收系数。
[0013]在本发明的一个实施例中，基于所述非色素颗粒物吸收系数以及将所述GFF滤膜的总颗粒物吸收系数，确定所述浮游植物吸收系数是通过将所述GFF滤膜的总颗粒物吸收系数减去所述非色素颗粒物吸收系数而确定的。[0014]由此，根据本发明的实施例，通过次氯酸钠吸附漂白浮游植物色素进而确定颗粒物中非色素颗粒物和浮游植物吸收系数的方法，具体可按以下步骤操作:
[0015](I)首先用GFF滤膜过滤适量水样在分光光度计上测定吸光度，以超纯水清洗浸泡的GFF湿润滤膜，获得总颗粒物吸收系数，过滤水样体积根据水体浑浊度确定，具体是用比色皿测定水样光束衰减系数，取550nm处吸收系数根据如下公式计算取整数后确定为过滤体积:V=500XC(550r。876。
[0016](2)将测定后的GFF滤膜平铺在湿润的定性滤纸上，根据滤膜上浮游植物浓度在滤膜周边的定性滤纸上滴上1%的次氯酸钠3-5ml，让次氯酸钠溶液从定性滤纸上慢慢渗浸到GFF滤膜上。
[0017](3)将吸附了次氯酸钠提取剂的GFF滤膜置于黑暗环境中进行次氯酸钠吸附漂白滤膜上浮游植物色素10-15分钟，避免过强光照条件对滤膜上浮游植物的影响。
[0018](4)将提取漂白后的GFF滤膜置于干燥的定性滤纸上，使得定性滤纸吸附掉GFF滤膜上的次氯酸钠，然后在GFF滤膜周边的定性滤纸上滴上5ml超纯水，让超纯水从定性滤纸上慢慢渗浸到GFF滤膜上，之后将滤膜置于另一张干燥的定性滤纸上，按上述操作反复5-10次，以完全吸附消除GFF滤膜上次氯酸钠。
[0019](5)步骤(4)得到的GFF滤膜用于非色素颗粒物吸收系数测定。
[0020](6)判断步骤(5)测定的非色素颗粒物吸收系数在671-675nm处平均吸收系数是否大于676-680nm处平均吸收系数，并小于666_670nm处平均吸收系数。
[0021](7)如果测定获得非色素颗粒物吸收系数满足不了 ad(676_680) < ad(671-675)
<ad (670-666)条件，重复权利要求3步骤(I) - (6)，直至满足要求。
[0022]本发明的优点及有益效果:
[0023](I)不会破坏滤膜上颗粒物的分配，保证颗粒物能均匀分布于GFF滤膜上，同时能完全漂白颗粒物中所有色素，避免甲醇浸泡法中水溶性色素无法萃取的缺陷。
[0024](2)在实施过程中不造成非色素颗粒物的损失，从而避免人为放大浮游植物吸收系数，能够完全消除非色素颗粒物对浮游植物吸收系数的干扰，即便颗粒物中非色素颗粒物浓度非常高也能准确获得浮游植物吸收系数。
[0025](3)操作十分简便，所需成本低:该方法仅需要1%次氯酸钠溶液滴加和超纯水清洗滤膜上次氯酸钠两个步骤，处理单一样品的时间不超过20分钟，同时可成批处理。次氯酸钠溶液价格十分低廉，处理费用低。
【专利附图】

【附图说明】
[0026]图1显示了根据本发明的一个实施例，90%微囊藻与10%非色素颗粒物配比下甲醇浸泡法提取获得的浮游植物、非色素颗粒物吸收系数与纯藻和非色素颗粒物本身吸收系数对比；
[0027]图2显示了根据本发明的一个实施例，90%微囊藻与10%非色素颗粒物配比下次氯酸钠吸附漂白提取获得的浮游植物、非色素颗粒物吸收系数与纯藻和非色素颗粒物本身吸收系数对比；
[0028]图3显示了根据本发明的一个实施例，10%微囊藻与90%非色素颗粒物配比下甲醇浸泡法提取获得的浮游植物、非色素颗粒物吸收系数与纯藻和非色素颗粒物本身吸收系数对比；
[0029]图4显示了根据本发明的一个实施例，10%微囊藻与90%非色素颗粒物配比下次氯酸钠吸附漂白提取获得的浮游植物、非色素颗粒物吸收系数与纯藻和非色素颗粒物本身吸收系数对比；
【具体实施方式】
[0030]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。下面以内陆富营养化水体中典型藻种微囊藻纯藻与非色素颗粒物不同比例配比混合后次氯酸钠漂白分离浮游植物吸收系数为实例，对本方法做进一步说明。
[0031 ] 本发明方法所需试剂和耗材:
[0032]I)有机提取剂:100%甲醇溶液，该溶液是海洋水体颗粒物中浮游植物吸收系数分离的最常用提取剂。
[0033]2 )含8%活性氯的次氯酸钠溶液:
[0034]3)超纯水(Millq Water):Millipore公司超纯水机制备而成；
[0035]4) 25mm 的 Whatman 公司 GFF 滤膜
[0036]所需设备:分光光度计、超纯水机、压力泵、过滤器。
[0037]操作步骤:
[0038](I)首先用GFF滤膜过滤适量水样在分光光度计上测定吸光度，以超纯水清洗浸泡的GFF湿润滤膜，获得总颗粒物吸收系数，过滤水样体积根据水体浑浊度确定，具体是用比色皿测定水样光束衰减系数，取550nm处吸收系数根据如下公式计算取整数后确定为过滤体积:V=500XC(550r。876。
[0039](2)将测定后的GFF滤膜平铺在湿润的定性滤纸上，根据滤膜上浮游植物浓度在滤膜周边的定性滤纸上滴上1%的次氯酸钠3-5ml，让次氯酸钠溶液从定性滤纸上慢慢渗浸到GFF滤膜上。
[0040](3)将吸附了次氯酸钠提取剂的GFF滤膜置于黑暗环境中进行次氯酸钠吸附漂白滤膜上浮游植物色素10-15分钟，避免过强光照条件对滤膜上浮游植物的影响。
[0041](4)将提取漂白后的GFF滤膜置于干燥的定性滤纸上，使得定性滤纸吸附掉GFF滤膜上的次氯酸钠，然后在GFF滤膜周边的定性滤纸上滴上5ml超纯水，让超纯水从定性滤纸上慢慢渗浸到GFF滤膜上，之后将滤膜置于另一张干燥的定性滤纸上，按上述操作反复5-10次，以完全吸附消除GFF滤膜上次氯酸钠。
[0042](5)步骤(4)得到的GFF滤膜用于非色素颗粒物吸收系数测定。
[0043](6)判断步骤(5)测定的非色素颗粒物吸收系数在671_675nm处平均吸收系数是否大于676-680nm处平均吸收系数，并小于666_670nm处平均吸收系数。
[0044](7)如果测定获得非色素颗粒物吸收系数满足不了 ad(676_680) < ad(671-675)
<ad (670-666)条件，重复权利要求3步骤(I) - (6)，直至满足要求。
[0045]微囊藻是内陆富营养化水体中典型藻种，除了含有溶于甲醇、乙醇等有机溶剂的叶绿素a和叶绿素b外,还富含丰富的藻蓝素。
[0046]图1显示了 90%微囊藻与10%非色素颗粒物配比下甲醇浸泡法提取获得的浮游植物、非色素颗粒物吸收系数与纯藻和非色素颗粒物本身吸收系数对比。通过此图可以确定，在颗粒物中浮游植物色素浓度较高时，甲醇浸泡提取颗粒物上浮游植物吸收不完全，表现在非色素颗粒物吸收系数在675nm附近存在弱吸收峰，提取的浮游植物吸收系数在此波段低于纯藻本身吸收系数。同时由于甲醇不能提取藻蓝素水溶性色素，使得非色素颗粒物在620nm附近存在弱吸收峰。甲醇浸泡过程中，由于色素浓度比较高，色素提取不完全，提取的浮游植物吸收系数明显低于纯藻本身吸收系数，引入明显误差。
[0047]图2显示了 90%微囊藻与10%非色素颗粒物配比下次氯酸钠吸附漂白提取获得的浮游植物、非色素颗粒物吸收系数与纯藻和非色素颗粒物本身吸收系数对比。通过此图可确定，当用次氯酸钠吸附漂白时，分离出来的浮游植物和非色素颗粒物光谱吸收系数与纯藻和非色素颗粒物本身吸收系数非常接近，说明即便在颗粒物中浮游植物色素浓度较高时，次氯酸钠能比较完全漂白掉颗粒物上浮游植物，不会造成浮游植物吸收系数偏低，用于分离颗粒物上高浓度浮游植物吸收系数比较理想。
[0048]图3显示了 10%微囊藻与90%非色素颗粒物配比下甲醇浸泡法提取获得的浮游植物、非色素颗粒物吸收系数与纯藻和非色素颗粒物本身吸收系数对比。通过此图可以确定，在颗粒物中浮游植物色素浓度非常低时，甲醇浸泡提取颗粒物上浮游植物吸收会造成非色素颗粒物损失，致使分离出来非色素颗粒物吸收系数明显低于非色素颗粒物实际吸收系数，从而造成分离的浮游植物吸收系数明显高于纯藻的实际吸收系数，引入明显误差。
[0049]图4显示了 10%微囊藻与90%非色素颗粒物配比下次氯酸钠吸附漂白提取获得的浮游植物、非色素颗粒物吸收系数与纯藻和非色素颗粒物本身吸收系数对比。通过此图可确定，当用次氯酸钠吸附漂白时，分离出来的浮游植物和非色素颗粒物光谱吸收系数与纯藻和非色素颗粒物本身吸收系数非常接近，说明即便在颗粒物中浮游植物色素浓度非常低时，次氯酸钠漂白不会造成非色素颗粒物损失和浮游植物吸收系数偏低，用于分离颗粒物上低浓度浮游植物吸收系数比较理想。
【权利要求】
1.一种分离颗粒物中浮游植物吸收系数的方法，其特征在于包括: (1)将GFF滤膜平铺在湿润的定性滤纸上，在滤膜周边的定性滤纸上滴加1%的次氯酸钠溶液3-5ml，使次氯酸钠溶液从定性滤纸上慢慢渗浸到所述GFF滤膜上，置于黑暗环境中进行次氯酸钠吸附漂白滤膜上浮游植物色素10-15分钟； (2)利用超纯水对步骤(I)中得到的GFF滤膜进行5-10次吸附清洗，以便去除滤膜上残留的次氯酸钠，并且测定非色素颗粒物吸收系数； (3)基于所述非色素颗粒物吸收系数以及将所述GFF滤膜的总颗粒物吸收系数，确定所述浮游植物吸收系数， 其中，所述GFF滤膜的总颗粒物吸收系数是通过下列步骤确定的: 利用GFF滤膜过滤获得水环境样品中颗粒物，并测定所述GFF滤膜的总颗粒物吸收系数。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述1%次氯酸钠溶液是通过对8%的次氯酸钠溶液进行稀释而获得的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括 Ca)首先用GFF滤膜过滤水样，并且在分光光度计上测定吸光度，获得总颗粒物吸收系数，其中，所述过滤水样的体积是基于所述水样的浑浊度确定的，其中，利用比色皿测定所述水样的光束衰减系数，取550nm处吸收系数根据如下公式计算取整数后确定所述过滤水样的体积:V=500XC(550)_°_876，其中，V代表所述过滤水样的体积； (b)将在步骤(a)中确定总颗粒物吸收系数的GFF滤膜平铺在湿润的定性滤纸上，在滤膜周边的定性滤纸上滴上1%的次氯酸钠溶液3-5ml，使所述次氯酸钠溶液从定性滤纸上渗浸到GFF滤膜上； (c)将吸附了次氯酸钠的GFF滤膜置于黑暗环境中进行次氯酸钠吸附漂白滤膜上浮游植物色素10-15分钟； (d)将提取漂白后的GFF滤膜置于干燥的定性滤纸上，使得定性滤纸吸附掉GFF滤膜上的次氯酸钠，然后在GFF滤膜周边的定性滤纸上滴上5ml超纯水，让超纯水从定性滤纸上慢慢渗浸到GFF滤膜上，之后将滤膜置于另一张干燥的定性滤纸上，按上述操作反复5-10次，以完全吸附消除GFF滤膜上次氯酸钠； Ce)将步骤(d)得到的GFF滤膜用于非色素颗粒物吸收系数测定。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(e)中测定的非色素颗粒物吸收系数在671-675nm处平均吸收系数大于676_680nm处平均吸收系数，但小于666_670nm处平均吸收系数。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，如果步骤(e)中测定的非色素颗粒物吸收系数无法满足在671-675nm处平均吸收系数大于676_680nm处平均吸收系数，但小于666-670nm处平均吸收系数 则重复权步骤(a)- (d)，直至满足在671-675nm处平均吸收系数大于676_680nm处平均吸收系数，但小于666-670nm处平均吸收系数。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于，基于所述非色素颗粒物吸收系数以及将所述GFF滤膜的总颗粒物吸收系数，确定所述浮游植物吸收系数是通过将所述GFF滤膜的总颗粒物吸收系数减去所述非色素颗粒物吸收系数而确定的。
【文档编号】G01N15/00GK103698253SQ201310675760
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】张运林, 刘笑菡, 施坤, 秦伯强 申请人:中国科学院南京地理与湖泊研究所