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专利名称：一种检测苯乙醇胺a的直接竞争法酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶联免疫和兽药残留检测领域。具体而言，本发明涉及一种用于检测苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒。技术背景
苯乙醇胺A又称为克仑巴胺(clenrapmine CLRA),学名为2_4-(4_硝基苯基)丁基-2-基氨基-I-甲氧基苯乙醇，是一种人工合成的化学物质。克仑巴胺是福莫特罗的同分异构体，是美国礼来公司合成莱克多巴胺的副产物，具有同瘦肉精和莱克多巴胺相同的作用和效果，属于￠2-激动剂的一种。被农业部第1519号公告列为禁止在饲料和动物饮水中使用的物质。因此必须建立检测方法，禁止此类事件的发生，保障食品安全。
现有的苯乙醇胺A检测方法多为色谱法，但是这些方法的灵敏度受样品的净化、 浓缩等步骤的影响较大；再者这些方法需要复杂的仪器，且过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为苯乙醇胺A残留物的分析检测提供了筛查方法。该技术研究的关键是半抗原分子的设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。
因为苯乙醇胺A是小分子化合物，本身没有免疫原性，必须将其与大分子载体蛋白偶联得到具有免疫原性的人工抗原。目前苯乙醇胺A的ELISA方法尚未见报道。发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒。
本发明提供了一种快速检测苯乙醇胺A的直接竞争法酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括包被有苯乙醇胺A特异性抗体的酶标板、苯乙醇胺A-辣根过氧化物酶标记物。其中苯乙醇胺A特异性抗体为兔抗苯乙醇胺A的多克隆抗体，可用苯乙醇胺A与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物(例如兔、羊、鼠等)制得。所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、 人血清白蛋白、卵清蛋白或钥孔铜兰蛋白(KLH)。所述的苯乙醇胺A-辣根过氧化物酶标记物采用化学方法将苯乙醇胺A与辣根过氧化物酶偶联得到。
用于制备所述酶标板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。载体的形式是微量反应板凹孔。
为方便现场检测和大量样本筛查，所述试剂盒还可以进一步包括苯乙醇胺A-辣根过氧化物工作液、苯乙醇胺A标准溶液、显色剂、洗涤液、终止液和浓缩样品稀释液。
所述的洗涤液为0. 05% -0. 5%吐温-20磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂 A液和显色剂B液组成(例如，体积比为I : I)，显色剂A液为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺。所述的浓缩样品稀释液为含0. 1%吐温-20的磷酸盐缓冲液。
另一方面，本发明还提供了一种检饲料测样品中苯乙醇胺A含量的方法，包括步骤
(I)样品前处理；
(2)用权利要求1-7任一所述的试剂盒进行检测，向包被有苯乙醇胺A抗体的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入苯乙醇胺A-辣根过氧化物工作液，孵育后洗涤拍干，加入显色剂，孵育后终止，用酶标仪测定吸光度值；
(3)分析检测结果。
本发明试剂盒的检测原理为
将苯乙醇胺A抗体吸附于固相载体上，加入样本或苯乙醇胺A标准品溶液并加入苯乙醇胺A-辣根过氧化物工作液，待测样品中苯乙醇胺A和苯乙醇胺A-辣根过氧化物竞争酶标板上的苯乙醇胺A抗体，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中苯乙醇胺 A的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出苯乙醇胺A浓度范围。
有益效果
本发明检测苯乙醇胺A的试剂盒主要采用直接竞争酶联免疫测定法，定性或定量测定样品中苯乙醇胺A含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。
本发明该试剂盒采用高特异性的苯乙醇胺A多克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差， 本发明具有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动化程度高、无放射性同位素污染的等优点，可在饲料及动物源性产品检测中发挥重要作用。


附图为苯乙醇胺A抑制曲线。具体实施方案
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。
实施例I免疫原的合成及免疫血清的制备
I. I试剂与仪器
苯乙醇胺A (杭州迪恩科技有限公司惠赠)，琥珀酸酐(购自北京耀北生物技术有限公司)，吡啶(Pyridine，AR. WM = 79. 10，含量> 99. 5%，天津市科密欧化学试剂开发中心)，N，N- 二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF，美国新泽西州ACR0S0RGANICS公司生产，购自百灵威化学试剂公司)，EDC(购自百灵威化学试剂公司)，牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等(购自北京耀北生物技术有限公司)，其它试剂均为分析纯。
双光束紫外可见分光光度仪(TU-1909，北京普析通用仪器有限公司)，层析装置 (3057型便携式记录仪，重庆川仪四厂；SBS系列数控计滴器，恒流泵，自动部分收集器，层析柱，上海沪西分析仪器厂)，磁力搅拌器(上海东荣丰科学仪器有限公司)，台式离心机 (Minispin 最大转速 13400rpm 最大离心力 12100rcf, 2ml X 12)，
1.2苯乙醇胺A人工抗原的合成
称取苯乙醇胺A 3. 4mg (0. Olmmol)溶于0. 4ml卩比唳溶液中，加入琥拍酸酐4mg室温搅拌反应过夜。
吹干吡啶，用0. 2mlDMF溶解酸酐活化的苯乙醇胺A，活化的苯乙醇胺A溶液逐滴加入到0. IM pH 7. 5冰冷载体蛋白(BSA、OVA或KLH)PBS溶液中，加入EDC 20mg，搅拌反应过夜。
将偶联物过S印hadexG_25M凝胶层析纯化，用0. OlM pH 7. 4PBS三倍柱床体积平衡，调节流速至3ml/min，样品浓缩至5ml加入到平衡好的层析柱中层析提纯偶联物，洗脱液用 pH 7. 4 0. OlM PBS0
I. 3苯乙醇胺A辣根过氧化物酶标记物的合成
称取苯乙醇胺A 3. 4mg (0. Olmmol)溶于0. 4ml卩比唳溶液中，加入琥拍酸酐4mg室温搅拌反应过夜。
吹干吡啶，用0. 2mlDMF溶解酸酐活化的苯乙醇胺A，活化的苯乙醇胺A溶液逐滴加入到0. IM pH 7. 5辣根过氧化物酶(HRP)PBS溶液中，加入EDC 20mg，搅拌反应过夜。
将偶联物过S印hadexG_25M凝胶层析纯化，用0. OlM pH 7. 4PBS三倍柱床体积平衡，调节流速至3ml/min，样品浓缩至5ml加入到平衡好的层析柱中层析提纯偶联物，洗脱液用 pH 7. 4 0. OlM PBS0
I. 4免疫及特异性抗体的制备
将上述苯乙醇胺A-BSA偶联物用生理盐水稀释成lmg/ml溶液备用。
选取6只体重2 2. 5Kg健康雄性新西兰大白兔。将偶联物与等量弗氏完全佐剂通过注射器对抽法混合成油包水的乳浊液,按lmg/Kg体重的量进行首次免疫，采取背部皮下多点注射。每隔两周加强免疫一次，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，剂量及方法同首次免疫。从第三次免疫开始，每次免疫后10天，耳缘静脉取血1ml，进行抗体效价检测，当抗体效价不再升高时，不加佐剂进行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后颈动脉放血，室温凝固2h后4°C过夜，8000r/min离心10分钟，除去血块,血清部分用50%饱和硫酸铵溶液沉淀，离心去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，再用33%饱和硫酸铵溶液沉淀两次，沉淀物用尽可能少的磷酸缓冲液溶解，经透析后用SephadeXG-25M层析，即得多克隆抗体。
实施例2免疫检测方法的建立
2. I ELISA方阵法确定最佳反应浓度
将1000 u g/ml、100 u g/ml> 10 u g/ml>5 u g/ml> I u g/ml、0. 25 u g/ml 系列浓度的苯乙醇胺A抗体按每孔IOOii I包被酶标板，4°C包被过夜，洗涤3次，拍干，按每孔200 ii I封闭液4°C下封闭过夜，洗涤3次，拍干。加入从I : 100开始倍比稀释的苯乙醇胺A辣根过氧化物酶标记物50ul，室温作用45分钟，洗涤三次，加50 ill底物A液和50 yl底物B液， 室温避光作用15min，50 U I终止液终止反应，酶标仪检测A值(450nm)。同时设置两个平行，取OD值为I. 5左右时的包被浓度为最佳浓度。试验数据列于表3。
表I方阵法OD值
权利要求
1.一种检测苯乙醇胺A的直接竞争法酶联免疫试剂盒，其中包括苯乙醇胺A特异性抗体、苯乙醇胺A标准品和苯乙醇胺A辣根过氧化物酶标记物。
2.根据权利要求I所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括包被了苯乙醇胺A辣根过氧化物酶标记物、包被有苯乙醇胺A特异性抗体的酶标板、苯乙醇胺A标准溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、浓缩样品稀释液以及酶标物稀释液。
3.根据权利要求I或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述苯乙醇胺A特异性抗体为多克隆抗体。
4.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的洗涤液为含有 0. 05% -0. 5%吐温-20磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的显色剂由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺。
6.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的浓缩样品稀释液为含 0. I %吐温-20的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的酶标物稀释液为含0.01%吐温-20的磷酸盐缓冲液。
8.—种检测样品中苯乙醇胺A含量的方法，包括步骤(1)样品前处理；(2)用权利要求1-7任一所述的试剂盒进行检测，向包被有苯乙醇胺A抗体的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入苯乙醇胺A辣根过氧化物酶标记物，孵育后洗涤拍干，加入显色剂、终止，用酶标仪测定吸光度值；(3)分析检测结果。
全文摘要
本发明公开了一种检测苯乙醇胺A的直接竞争法酶联免疫检测试剂盒。本发明所提供的苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒包括苯乙醇胺A特异性抗体包被的酶标板、苯乙醇胺A辣根过氧化物酶标记物。本发明的检测苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒灵敏、快速、准确，主要用于大批样品的筛查；盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特异性、高灵敏性、高精确性、高准确性等特点，可快速检测饲料及畜产品中残留的苯乙醇胺A。
文档编号G01N33/543GK102539747SQ20111044551
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者于洪侠 申请人:于洪侠