专利名称：：头孢氨苄残留酶联免疫检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种兽药残留的免疫化学速测技术，特别是涉及一种用于头孢氨苄残留检测的酶联免疫检测试剂盒及其应用。
背景技术：
：头孢氨苄(Cephalexin)是P-内酰胺类抗生素。兽医临床广泛用于控制奶牛的乳房炎，治疗动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，均可造成它在畜产品中的残留，给人类健康带来严重�：�。针对该药物在食品中的残留，我国农业部发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定，牛奶中的最大残留限量为100pg/kg,肌肉、脂肪中的最大残留限量为200pg/kg。目前，用于检测头孢氨苄的方法主要有微生物法、色谱法或色谱-质谱联用分析法、免疫分析法等。微生物检测法操作简单，但其检测周期长且结果误差较大。色谱法或色谱-质谱联用技术虽然灵敏度高，但是样品前处理及测定操作繁琐、费用高，不适于大量样品的快速检免疫分析法(Immunoassay)具有极高的选择性和灵敏度，是广泛使用的快速筛查方法。基于酶标记物放大作用的免疫分析称为酶联免疫吸附试验法(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,即ELISA)，ELISA以其具有灵敏、快速、特异、简便等优点，广泛应用于现场监控和大规模样品筛査。
发明内容本发明的目的是提供一种操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本筛查，用于检测牛奶及动物组织中头孢氨苄药物残留量的酶联免疫检测试剂盒。一种头孢氨苄残留酶联免疫检测试剂盒，其中设置有以下成分包被有包被原的酶标板，所述包被原为头孢氨苄与载体蛋白的偶联物；头孢氨苄特异性抗体；酶标记物；头孢氨苄标准品溶液0吗/L-5吗/L;底物显色液；终止液；浓縮洗涤液；和样品稀释液。本发明的试剂盒，其中所述酶标板的制备过程为用包被缓冲液将包被原稀释成0.5-1pg/mL，每孔加入100pL，37t:温育2h，再4'C过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200^L封闭液，37i:温育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。本发明的试剂盒，其中所述酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；所用的封闭液是1%-5%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。本发明的试剂盒，其中所述头孢氨苄特异性抗体为头孢氨苄单克隆抗体，其是用头孢氨苄与载体蛋白采用碳化二亚胺法得到的偶联物作为免疫原，利用杂交瘤技术得到的。其具体制备过程为(1)动物免疫采用雌性BALB/C纯系小鼠作为免疫动物，以头孢氨苄与载体蛋白牛血清白蛋白偶联物为免疫原；(2)细胞融合与克隆化取免疫BALB/C小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(3)单克隆抗体的制备与纯化使用雌性BALB/C纯系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂，5天后腹腔注射杂交瘤细胞株106个/只，7天后取小鼠腹水，进行纯化后得单克隆抗体分装，-2(TC保存。本发明的试剂盒，其中所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)、甲状腺蛋白(BCG)、卵清蛋白(OVA)或血蓝蛋白(KLH)等常用蛋白。本发明的试剂盒，其中所述酶标记物为酶标记羊抗鼠抗抗体，其中酶标记物的标记酶为辣根过氧化物，酶标记的羊抗鼠抗抗体是采用过碘酸钠法将标记酶与羊抗鼠抗抗体进行偶联得到的。本发明的试剂盒，其中所述底物显色液由体积比为1:1的显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化脲，显色液B液为四甲基联苯胺。本发明的试剂盒，其中所述终止液为1-2mol/L的硫酸。所述浓缩洗涤液为pH7.4含0.5%-1%吐温20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。所述样品稀释液为含有0.1%-1%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。本发明还提供一种利用所述的头孢氨苄残留酶联免疫检测试剂盒检测头孢氨苄残留的方法，包括以下步骤(1)样品前处理脱脂牛奶样品用样品稀释液稀释后直接测定；动物组织用含吐温20磷酸盐缓冲液抽提，再用三氯甲垸去除脂肪后测定；(2)用试剂盒检测向酶标板微孔中加入头孢氨苄标准品溶液或样本溶液50pL，再加入头孢氨苄特异性抗体50pL，用盖板膜封板，37C恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250pL浓缩洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干；加入酶标记物100pL，37'C恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺各50pL，轻轻振荡混匀，37。C恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液硫酸50^L，轻轻振荡混匀，用酶标测定450nm处吸光度值；(3)检测结果分析用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(O标准)的吸光度值(Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值；计算公式为百分吸光度值(％)=(8/80)xlOO%;公式中B为标准溶液的平均吸光度值，BQ为0pg/L标准溶液得平均吸光度值；以头孢氨苄标准品浓度的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图；用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应出一个样品的浓度，从标准曲线上读出样品中头孢氨苄的残留量。本发明的检测原理为在酶标板微孔条上预包被头孢氨苄偶联包被抗原，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入头孢氨苄特异性抗体溶液，样本中残留的头孢氨苄或头孢氨苄标准品与酶标板上包被的头孢氨苄偶联抗原竞争头孢氨苄特异性抗体，加入酶标记二抗，用显色液显色后，在450nm处检测吸光度，吸光度值与样本中头孢氨苄的浓度成反比。可通过标准曲线计算样本中头孢氨苄的浓度。本发明中检测动物性食品中头孢氨苄的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测牛奶及动物组织(猪、牛的肌肉、肝脏、肾脏等)中头孢氨苄的残留量，样品前处理过程简单，脱脂牛奶样品，用样品稀释液稀释后可直接测定，动物组织用含吐温20磷酸盐缓冲液抽提，再用三氯甲烷去除脂肪后测定，并且能同时检测大批样品。测定方法简单、省时，整个检测过程只需1.5小时可以完成。牛奶和肌肉中的最低检测线分别为0.5吗/L和0.5吗/kg，具有特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，可在动物性食品中头孢氨苄的残留检测中发挥重要作用。图1为实施例1中的头孢氨苄的检测标准曲线图。具体实施例方式实施例l:头孢氨苄残留酶联免疫检测试剂盒的制备1.蛋白偶联抗原的合成(1)头孢氨苄免疫抗原的合成将头孢氨苄和牛血清白蛋白(BSA)采用碳二亚胺法进行偶联得到免疫抗原。具体操作如下取头孢氨苄15mg溶于5mLPBS(0.01mol/L,pH7.4)中，加入25mg碳二亚胺(EDC)和10mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌30分钟，取BSA10mg溶于活化的头孢氨苄溶液中，25"C搅拌反应2小时，再4'C反应过夜。4'C条件下，用PBS透析3天，得到头孢氨苄免疫抗原，分装冻存。(2)头孢氨苄包被抗原的合成将头孢氨苄和卵清蛋白(OVA)，采用戊二醛法进行偶联得到包被抗原。具体操作如下取头孢氨节10mg溶于5mLPBS(0.01mol/L,pH7.4)中，加入1%戊二醛溶液搅拌30分钟，取OVA30mg溶于lmLPBS，加入到活化的头孢氨苄溶液中，25'C搅拌反应2小时，4'C反应过夜。4'C条件下，用PBS透析3天，得到头孢氨苄包被抗原，分装冻存。2.单克隆抗体的制备(1)动物免疫将合成的免疫原与等量的弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射8周龄雌性BALB/C小鼠，剂量为100昭/只。然后以100吗/只的剂量加弗氏不完全佐剂腹腔注射加强免疫3次，间隔2周。分别于每次免疫后IO天小鼠眼眶后缘静脉采血，测定抗体效价。(2)细胞融合和克隆化取免疫小鼠的脾细胞，按5:l比例与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤细胞。采用有限稀释法筛选能够稳定分泌头孢氨苄单克隆抗体的杂交瘤细胞株，扩大培养后液氮冻存。(3)单克隆抗体的制备与纯化使用雌性BALB/C纯系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL/只，5天后腹腔注射杂交瘤细胞106个/只，7天后取小鼠腹水，经辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，分装，-20°〇保存。3.试剂盒的制备(1)酶标板的制备用包被缓冲液将头孢氨苄包被抗原稀释成0.5-1pg/mL，每孔加入100^L，37'C温育2h再4'C过夜，倾去包被液，用稀释20倍的浓縮洗涤液洗涤4次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200pL封闭液，37'C温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。(2)所用试剂的配1)头孢氨苄系列浓度标准溶液，其浓度分别为0ng/L，0.05pg/L，0.1pg/L，0.5pg/L，2)蛋白浓度为0.1-1mg/L的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。3)蛋白浓度为0.1-1mg/L的头孢氨苄单克隆抗体。4)底物显色液由A液和B液组成，A液为用0.1mol/LpH5.0的柠檬酸缓冲液配制成0.1-1mg/mL的过氧化脲溶液，B液为四甲基联苯胺先用无水乙醇配制2mg/mL的溶液，再用0.1mol/LpH5.0的柠檬酸缓冲液配制成0.1-1mg/mL溶液。5)终止液为l-2mol/L硫酸。6)浓縮洗涤液为pH7.4含0.8-1.2%吐温20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。7)样品稀释液为0.1%-1%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。实施例1制备的试剂盒的试验例试验例1样品中头孢氨苄残留的检测(1)样品前处理牛奶样本取适量牛奶样本，4'C，4000r/min，离心15min，去除上层脂肪，取下层溶液用样品稀释液按1:10稀释后，取50pL用于分析。肌肉组织和脏器称取1-5g组织样捣碎后，加入9-45mL含吐温20磷酸盐缓冲液混合，4000r/min，离心20min，取上清液，加入4-20mL三氯甲烷，振摇，4000r/min，离心20min，取50pL用于分析。(2)用试剂盒检测向头孢氨苄偶联抗原包被的酶标板微孔中加入头孢氨苄标准品溶液或样本溶液50pL，再加入头孢氨苄单克隆抗体工作液50^L，用盖板膜封板，37"C恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250pL洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液100pL，37t;恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺各50nL，轻轻振荡混匀，37。C恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液硫酸50pL，轻轻振荡混匀，用酶标测定450nm处吸光度值。(3)检测结果分析用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值。计算公式为百分吸光度值(n/。)-(B/Bo)xl00%公式中B为标准溶液的平均吸光度值，BQ为0pg/L标准溶液的平均吸光度值。以头孢氨苄标准品浓度的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图(见图l)。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出样本中头孢氨节的残留量。试验例2试剂盒灵敏度试验分别测定20个不同批次的空白标准液，计算A45o的平均百分吸光度值(BQ)和标准差")，在标准曲线上查出Bo+3S对应的质量浓度为理论检测下限(LOD)，该浓度即为灵敏度。结果表明本发明开发的试剂盒对牛奶样品的最低检测限为0.5Kig/L，对动物组织样品的最低检测线为0.5pg/kg。试验例3试剂盒特异性测定选择与头孢氨苄结构和功能类似的3种药物测定交叉反应率。通过各种药物的标准曲线分别得到其50%抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率交叉反应率(％)=(引起50%抑制头孢氨苄的浓度/引起50%抑制的类似物浓度)xlOO%。试验结果如表1所示，测试的3种药物与头孢氨苄没有交叉反应。表1头孢氨苄检测试剂盒的交叉反应性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>试验例4精密度、准确度试验样品精密度试验-1)取头孢氨苄标准样品，添加20pg/L到样品中，分别取三个不同批次的试剂盒各三个，每个浓度重复5次，分别计算变异系数。结果表明，牛奶、组织样本中的变异系数均低于25%。2)分别在空白牛奶、牛肉样品中添加头孢氨苄标准液至终浓度为10pg/L(kg)、20pg/L(kg)和50pg/L(kg)。分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分别计算准确度。结果表明牛奶、组织样品添加准确度在79.5-98.7%之间。试验例5试剂盒保存期试验试剂盒保存条件为2-8°C，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50%抑制浓度、头孢氨苄添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37'C保存的条件下放置4天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8。C至少可以保存6个月以上。以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。权利要求1.一种头孢氨苄残留酶联免疫检测试剂盒，其特征在于其中设置有以下成分包被有包被原的酶标板，所述包被原为头孢氨苄与载体蛋白采用戊二醛法进行偶联得到的偶联物；头孢氨苄特异性抗体；酶标记物；头孢氨苄标准品溶液0μg/L-5μg/L；底物显色液；终止液；浓缩洗涤液；和样品稀释液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述酶标板的制备过程为用包被缓冲液将包被原稀释成0.5-1)xg/mL，每孔加入100pL，37'C温育2h，再4。C过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200pL封闭液，37'C温育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；所用的封闭液是1%-5%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述头孢氨苄特异性抗体为头孢氨苄单克隆抗体，其是用头孢氨苄与载体蛋白采用碳化二亚胺法得到的偶联物作为免疫原，利用杂交瘤技术得到的。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述头孢氨苄单克隆抗体的具体制备过程为(1)动物免疫采用雌性BALB/C纯系小鼠作为免疫动物，以头孢氨苄与载体蛋白牛血清白蛋白偶联物为免疫原；(2)细胞融合与克隆化取免疫BALB/C小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(3)单克隆抗体的制备与纯化使用雌性BALB/C纯系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂，5天后腹腔注射杂交瘤细胞株106个/只，7天后取小鼠腹水，进行纯化后得单克隆抗体分装，-20°C保存。6.根据权利要求1或4或5任一项所述的试剂盒，其特征在于所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)、甲状腺蛋白(BCG)、卵清蛋白(OVA)或血蓝蛋白(KLH)。7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记物为酶标记羊抗鼠抗抗体，其中酶标记物的标记酶为辣根过氧化物，酶标记的羊抗鼠抗抗体是采用过碘酸钠法将标记酶与羊抗鼠抗抗体进行偶联得到的。8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述底物显色液由体积比为1:l的显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化脲，显色液B液为四甲基联苯胺。9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述终止液为1-2mol/L的硫酸；浓縮洗涤液为pH7.4含0.5%-1%吐温20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液；样品稀释液为含有0.1%-1%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。10.—种利用权利要求1所述的头孢氨苄残留酶联免疫检测试剂盒检测头孢氨节残留的方法，其特征在于包括以下步骤(1)样品前处理脱脂牛奶样品用样品稀释液稀释后直接测定；动物组织用含吐温20磷酸盐缓冲液抽提，再用三氯甲烷去除脂肪后测定；(2)用试剂盒检测向酶标板微孔中加入头孢氨苄标准品溶液或样本溶液50^L，再加入头孢氨苄特异性抗体50pL，用盖板膜封板，37"C恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250浓縮洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干；加入酶标记物100pL，37'C恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺各50^L，轻轻振荡混匀，37"C恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液硫酸50^L，轻轻振荡混匀，用酶标测定450nm处吸光度值；(3)检测结果分析用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值；计算公式为百分吸光度值(％)=(8/80)xl00%;公式中B为标准溶液的平均吸光度值，Bc为Opg/L标准溶液的平均吸光度值；以头孢氨苄标准品浓度的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图；用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应出一个样品的浓度，从标准曲线上读出样品中头孢氨苄的残留量。全文摘要一种头孢氨苄残留酶联免疫检测试剂盒，其中设置有以下成分包被有包被原的酶标板，所述包被原为头孢氨苄与载体蛋白的偶联物；头孢氨苄特异性抗体；酶标记物；头孢氨苄标准品溶液0μg/L-5μg/L；底物显色液；终止液；浓缩洗涤液；和样品稀释液。本发明的检测动物性食品中头孢氨苄残留的酶联免疫检测试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测牛奶及动物组织(猪、牛的肌肉、肝脏、肾脏等)中头孢氨苄的残留量，样品前处理过程简单，能同时检测大批样品。测定方法简单、省时，整个检测过程只需1.5小时就可以完成。文档编号G01N33/543GK101354401SQ20081022209公开日2009年1月28日申请日期2008年9月9日优先权日2008年9月9日发明者王羚鸿,邹明强,刚郝,涌金,陈立本申请人:中国检验检疫科学研究院
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