专利名称：筛选与鉴定幽门螺杆菌抗原表位肽的方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，涉及筛选和鉴定抗原表位肽的方法，尤其涉及筛选和鉴定幽门螺杆菌抗原表位肽的方法。
背景技术：
幽门螺杆菌(Hp)是澳大利亚学者Warren和Marshall在1982年发现的。在过去的近30年时间里，研究证实Hp是胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡的主要病因，并与胃癌，胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)的发生密切相关，被世界卫生组织列为胃癌的I类致癌因子。并且，Hp的感染率非常高，流行病学调查显示全世界有50%的人口携带该细菌，特别是某些发展中国家的感染率甚至高达80%。因此，有效的治疗Hp感染对人类的健康是非常重要的。目前，临床上主要采用抗生素多联疗法治疗Hp感染。虽然能够达到85%的根除效率，但是存在以下缺点1、药物疗法毒副作用大；2、复杂的联合用药导致病人的依从性差； 3、药物不能防止Hp的潜在感染；4、抗生素治疗易产生赖药性而导致治疗失败；5、对发展中国家病人而言，药物疗法在经济上也比较困难。免疫接种是预防和控制感染性疾病最经济而有效的方法，鉴于Hp感染的高发病率及其与慢性胃炎、消化性溃疡以及胃癌、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的密切关系，如何通过免疫接种达到防治这些疾病的目的，一直是各国科研人员研究的重点问题。疫苗接种通过有效地调动机体免疫系统，克服细菌对宿主的免疫逃避来达到预防感染和消除已感染的细菌的目的，经济而简便，可在人群中大规模运用， 并且对赖药细菌仍然有效，因此研究Hp疫苗具有重要意义。动物实验研究表明，疫苗接种可以减少Hp在胃黏膜的定植，并减轻胃黏膜的炎症反应，起到预防和治疗Hp感染的作用。目前关于Hp的疫苗多是采用全菌疫苗或重组亚单位疫苗及核酸疫苗等，其引发的免疫应答与Hp感染是的免疫应答相似。Hp感染使机体内产生强烈的细胞与体液免疫应答，但是感染仍慢性持续化甚至是终身感染，说明机体已经对Hp的存在免疫耐受，自然感染时产生的免疫应答不能起到保护作用，因而通过疫苗接种的方式清除Hp就必须在抗原选择以及在表位水平对抗原进行改造，激发更有效的免疫应答。表位疫苗是以抗原表位为基础制备的疫苗，是目前感染性疾�。裥灾琢鲆约白陨砻庖咝约膊〉纫呙缟杓频男路较�。相对传统疫苗其具有很多的优点1.选择性提高所选择表位的免疫原性；2.去除表位所在蛋白中不必要甚至有害的部分，降低疫苗使用风险。3.可以对表位进行优势组合，扩大免疫应答的宽度；4.应用广泛，不仅有预防作用，还可以作为治疗性疫苗使用。研制表位疫苗的第一步是表位的筛选和鉴定。Hp是一种胞外感染细菌，研究证实， CD4+T淋巴细胞在抗Hp感染免疫应答中起着非常重要的作用，因此，在Hp表位疫苗的设计中加入CD4+T细胞表位(及辅助T细胞表位)尤为重要。此外，并非所有的表位均能诱导机体产生强烈的免疫应答，只有免疫显性表位才能引起机体强烈的免疫应答，亚显性表位引起的免疫应答远远弱于显性表位，因此，免疫显性CD4+T细胞表位才是Hp表位疫苗所需要的。目前，已报道的Hp抗原⑶4+T细胞表位均为小鼠H-2限制性Th表位，由于小鼠和人MHC分子的差别，H-2限制性表位可能不适用于人类疫苗设计，因此需要筛选鉴定HLA限制性表位。此外，现有报道的Hp表位多采用生物信息学软件预测而来，准确率不高，虽能通过实验加以验证，但是仍不能避免表位漏筛现象。此外，软件预测方法筛选表位难以解决表位的免疫显性问题，而免疫显性表位才是Hp表位疫苗最佳的候选表位。因此，建立一种系统的筛选免疫显性CD4+T细胞表位的方法显得尤为重要。本发明利用抗原特异性T细胞及步移重叠合成肽，建立了一种系统筛选Hp抗原HLA限制性免疫显性辅助T细胞(Th细胞) 表位的方法。
发明内容
本发明提供一种筛选与鉴定幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽的方法， 包括以下步骤培养外周血单核细胞；在HpaA抗原条件下，体外扩增外周血单核细胞中的 HpaA抗原特异性CD4+T细胞，并收集所获得的细胞；在收集的细胞中加入待筛选的多肽刺激这些细胞，并继续培养；检测特异性CD4+T细胞对步骤c的多肽的应答频率，根据应答频率的不同筛选出免疫显性表位肽，以及确定所述免疫显性表位肽的HLA限制性。上述体外扩增外周血单核细胞中的HpaA抗原特异性CD4+T细胞的步骤包括用 RPMI-1640完全培养基调整所培养的外周血单核细胞的浓度至2. 5 5X 106/ml，加入HpaA 抗原进行刺激，该HpaA抗原的终浓度为0. 05 1 μ M，培养5_8天时加入终浓度为25U/ml 的重组人IL-2，继续培养13-16天后收集细胞。上述待筛选的多肽通过以下方法获得在UniProt蛋白数据库中检索幽门螺杆菌 11637菌株来源的HpaA蛋白序列，从第观号氨基酸开始，每次步移6个氨基酸，合成步移重叠的18个氨基酸多肽；或者在获得的步移重叠的18个氨基酸多肽中每次步移2个氨基酸合成步移重叠的13个氨基酸多肽。其中所述18个氨基酸多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 3-39所示；所述13个氨基酸多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :40-44所示。本发明还提供了鉴定所筛选到的免疫显性表位肽的HLA限制性的方法，包括以下步骤在特异性⑶4+T细胞的培养液中加入抗HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ分子的单克隆抗体，然后加入目的肽段进行刺激，ICS和流式检测特异性CD4+T细胞对多肽的应答频率，被抗HLA-DR分子的单克隆抗体阻断同时不被抗HLA-DP和HLA-DQ分子的单克隆抗体阻断的多肽即是HLA-DR限制性免疫显性表位肽。所述鉴定所筛选到的免疫显性表位肽的HLA限制性的方法，进一步包括用含有 EBV的B淋巴细胞系作为抗原递呈细胞负载目的肽段后与该肽段特异性CD4+T细胞进行混合淋巴细胞反应，然后进行ICS和流式检测多肽对特异性CD4+T细胞对多肽的应答频率，根据特异性CD4+T细胞的应答频率检测所述免疫显性表位肽的HLA限制性亚型。本发明还提供根据筛选与鉴定幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽的方法所得到的幽门螺杆菌HpaA抗原的HLA限制性免疫显性表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:8、22、30和42所示。其中，氨基酸序列如SEQ ID NO :42所示的表位多肽具有HLA-DR 限制性，该HLA限制性亚型为HLA-DRB 1*0406。本发明所提供的幽门螺杆菌HpaA抗原的免疫显性表位肽可在制备用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗中应用。本发明所提供的筛选和鉴定方法准确率高，可以避免漏筛和误筛现象，可以区别抗原表位的免疫显性和免疫亚显性，并且所筛选出的抗原表位均能被抗原递呈细胞自然递呈，由此使得制备高效、低毒、高安全性的Hp疫苗成为可能。本发明所提供的免疫显性表位多肽具有高免疫原性，可引发强烈的免疫反应。另外所述免疫显性表位多肽不含有不必要甚至有害的部分，从而降低由其所制备的疫苗的使用风险。本免疫显性表位多肽可以与其他疫苗成分进行优势组合，从而扩大免疫应答的宽度。由本免疫显性多肽制备的疫苗对幽门螺杆菌感染不仅有预防作用，还可以作为治疗性疫苗使用。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
图IA表示经ICS方法检测到的Hp感染阳性者PBMC中抗原特异性⑶4+T细胞频率，可见DMSO对照组和肽库刺激组之间没有显著差别；图IB表示经ELISP0T方法检测到的Hp感染阳性者PBMC中抗原特异性⑶4+T细胞频率，可见Hp感染阳性者PBMC中HpaA特异性⑶4+T细胞频率极低；图2A表示Hp感染者外周血中抗原特异性CD4+T细胞的体外有效扩增；图2B表示Hp感染者外周血中抗原特异性CD4+T细胞的体外扩增过程中，最佳抗原刺激浓度为0. 2 μ M ；图2C表示Hp感染者外周血中抗原特异性CD4+T细胞的体外扩增过程中，最佳的细胞培养时间是13-16天；图3Α表示利用抗原特异性⑶4+Τ细胞和步移重叠合成肽对18氨基酸(18-mer) 免疫显性表位进行筛�。渲械�28条肽段(P28，H19ch2ci7)为免疫显性肽段，第6 (P6，H58_75) 和第20(P20，H142_159)条肽段免疫亚显性肽段；图;3B表示利用抗原特异性⑶4+T细胞和步移重叠合成肽对13-mer免疫显性表位进行筛�。渲蠵^-3(H192_2(i4)为免疫显性肽段；图4表示利用HLA-II类分子抗体阻断实验初步确定免疫显性肽Ρ28_3Η192_2(14是 HLA-DR限制性的；图5表示利用BLCL递呈实验确定免疫显性肽(Η192-204)的HLA限制性是 HLA-DRB1*0406 ；图6表示应用来源于样本号为5250的HpaA特异性T淋巴细胞进一步验证了所筛选到的13-mer短肽为免疫显性肽段；图7表示将系统筛选方法与生物信息学软件预测法所得表位进行比较；
图8表示在相同HLA限制性的不同幽门螺杆菌感染者中对免疫显性表位的进一步验证。
具体实施例方式材料与方法CN 102353794 A (一)蛋白和肽段重组幽门螺杆菌粘附素A亚单位(rHpaA)蛋白(不含信号肽部分)为本单位重组构建(洪愉，幽门螺杆菌黏附素HpaA的克隆、表达及生物学活性研究中华微生物学和免疫学杂志2003年11期)；多肽肽段通过化学方法合成(由上海吉尔生化公司合成)，用二甲亚砜(DMSO)溶解至5mM的浓度，在_70°C保存，临用时用RPMI-1640完全培养基稀释到ImM 的浓度。 (二)主要溶液及试剂配制1. RPMI-1640不完全培养基分别称取10. 4g RPMI-1640粉末，2. 4g H印es和2g NaHC03，加入去离子水至 IOOmL,搅勻过滤除菌，分装冻存。2. RPMI-1640 完全培养基分别量取950mL RPMI-1640不完全培养基和50mL人AB血清，加入20万单位/mL 的青霉素和链霉素双抗各0. 5mL (终浓度为100U/mL)。3.冻存液将胎牛血清与DMSO按照9 1的比例混合，然后分装冻存。(三)所使用的主要试剂及其来源
权利要求
1.一种筛选与鉴定幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽的方法，其特征在于， 包括以下步骤a.培养外周血单核细胞；b.在HpaA抗原条件下，体外扩增外周血单核细胞中的HpaA抗原特异性CD4+T细胞，并收集所获得的细胞；c.在步骤b收集的细胞中加入待筛选的多肽刺激这些细胞，并继续培养；d.检测特异性CD4+T细胞对步骤c的多肽的应答频率，根据应答频率的不同筛选出免疫显性表位肽，以及确定所述免疫显性表位肽的HLA限制性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b所述的培养包括用RPMI-1640完全培养基调整步骤a中培养的外周血单核细胞的浓度至2. 5 5X 106/ml，加入HpaA抗原进行刺激，该HpaA抗原的终浓度为0. 05 1 μ M，培养5_8天时加入终浓度为25U/ml的重组人IL-2，继续培养13-16天后收集细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c所述待筛选的多肽通过下述方法获得在UniProt蛋白数据库中检索幽门螺杆菌11637菌株来源的HpaA蛋白序列，从第观号氨基酸开始，每次步移6个氨基酸，合成步移重叠的18个氨基酸多肽；或者在获得的步移重叠的18个氨基酸多肽中每次步移2个氨基酸合成步移重叠的13个氨基酸多肽。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述18个氨基酸多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 3-39 所示。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述13个氨基酸多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 40-44 所示。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d包括在细胞培养液中加入抗 HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ分子的单克隆抗体，然后加入目的肽段进行刺激，ICS和流式检测特异性CD4+T细胞对多肽的应答频率，被抗HLA-DR分子的单克隆抗体阻断同时不被抗 HLA-DP和HLA-DQ分子的单克隆抗体阻断的多肽即是HLA-DR限制性免疫显性表位肽。
7 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤d进一步包括用含有EBV的B淋巴细胞系作为抗原递呈细胞负载目的肽段后与该肽段特异性CD4+T细胞进行混合淋巴细胞反应，然后进行ICS和流式检测特异性CD4+T细胞对多肽的应答频率，根据特异性CD4+T细胞的应答频率检测所述免疫显性表位肽的HLA限制性亚型。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述HLA限制性免疫显性表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :8、22、30和42所示。
全文摘要
本发明提供了一种筛选与鉴定幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽的方法。所述方法包括体外放大培养Hp抗原特异性T细胞的方法、抗原特异性T细胞体外应答的检测方法、利用抗原特异性T细胞结合抗原步移合成重叠肽来筛选免疫显性表位的方法以及利用HLA-II类分子抗体阻断实验和不同HLA-II类分子亚型的EBV转化B淋巴细胞系(BLCL)对表位的递呈实验来确定表位HLA限制性的方法。根据本发明方法所得到的幽门螺杆菌HpaA抗原免疫显性表位多肽具有SEQ ID No8、22、30和42所示的氨基酸序列。本发明所提供的方法可避免漏筛和误筛，并且所筛选到的表位肽可以被抗原递呈细胞自然递呈。
文档编号G01N33/68GK102353794SQ20111020752
公开日2012年2月15日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者余抒, 吴超, 石云, 罗萍, 赵 卓, 邹全明, 陈立 申请人:中国人民解放军第三军医大学
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