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专利名称：一种检测心肌肌钙蛋白i的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种检测心肌肌钙蛋白I的方法，以及运用该方法制备的心肌肌钙蛋白I检测试剂盒。
背景技术：
目前急性心肌梗死(AMI)检测的主要生化标志物有肌酸磷酸激酶同工酶 (CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)和心肌肌钙蛋白I (cTnl)等。CK-MB、 LDH广泛分布于体内，因此特异性较低，许多疾病都可导致它们的升高，且在血液中维持时间较短；cTnT与骨骼肌肌钙蛋白T(sTnT)同源性很高，容易发生交叉反应。而cTnl具有特异性高、出现时间早、敏感性高和在血液中持续时间长等优点，可作为AMI早期诊断指标， 已经被证实为心肌损伤最特异、最敏感的血清标志物之一。目前影响cTnl测定精确度的因素有以下几方面(l)cTnl的存在形式不同cTnl 抗体识别游离形式cTnl和复合物形式cTnl的能力不同；0)cTnI的磷酸化cTnI的第22 位和第23位丝氨酸残基可以在蛋白激酶A作用下发生磷酸化，形成四种磷酸化形式(未磷酸化态，22Ser磷酸化态，23Ser磷酸化态，22、23Ser均磷酸化态)共同存在于细胞中，磷酸化改变了 cTnl分子的构象，影响某些cTnl抗体的识别能力；( cTnl的氧化CTnI的第80 位和第97位胱氨酸残基会发生氧化，从而影响某些cTnl抗体的识别能力；(4) cTnl的易水解性cTnI易受蛋白水解酶作用，且不同部分受影响的程度有差别，中心区域(第33位至 110位氨基酸)稳定性较高，N端和C端易被降解，产生包含不同抗原表位的cTnl蛋白酶解片段，不同cTnl抗体对不同降解表位的结合能力不同；( 干扰物质类风湿性因子(RF)、 嗜异性抗体会造成假阳性结果，自身抗体、胆红素和血红蛋白会造成假阴性结果；(6)抗凝剂乙二胺四乙酸(EDTA)是Ca2+螯合剂，可使cTnl-cTnC复合物解离，从而影响某些抗体的结合；肝素带负电荷，易与带正电荷(Pl为9. 87)的cTnl结合形成复合物，从而影响某些抗体的结合。高精确度cTnl检测要求所选用的抗体需满足下列条件(1)针对的抗原表位位于稳定的中间区域，不受水解影响；( 特异性高，和快骨骼肌型肌钙蛋白、慢骨骼肌型肌钙蛋白不发生交叉反应，即所针对的抗原表位应针对无同源性区域；C3)受cTnl的存在形式、 磷酸化、氧化的影响较�。�(4)受经常出现的血液和血浆成分干扰较小。目前商业化的试剂盒大都采用夹心免疫法，通常使用2 3个单克隆抗体，组合形式为1 2个捕获抗体加1个检测抗体或者1个捕获抗体加1 2个检测抗体。但是这样的组合不可能做到对已知cTnl测定影响因素不敏感，也无法满足高精确度cTnl检测抗体的条件，因此试剂盒无法达到高精确度要求。现有的cTnl检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)，化学发光法和酶联荧光分析法。ELISA方法测定周期长；化学发光法和酶联荧光分析法价格昂贵，需有专门仪器和专业人员操作，只适用于中心实验室使用，检测结果到达医生手中的时间较长，不能满足临床快速检测需要，也不适合于中小医院尤其是没有中心实验室的乡镇医院。而胶乳增强免疫比浊法操作简单，适用于绝大多数医院的自动生化分析仪使用，特别是对急诊能实现快速定量检测，其基本原理是将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。而cTnl抗体包被到胶乳颗粒上，一般可以采用物理吸附法和化学偶联法，物理吸附法稳定性较化学偶联法要差，易受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，导致检测结果假阳性或假性升高。目前采用的化学偶联法多为随机偶联法，该法将导致抗体结合力的损失，增加了抗体用量和生产成本。针对目前的现状，需要寻找一种新的cTnl检测方法，该方法应该具有操作简单、 适用范围广、精确度高和生产成本低等特点。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、适用范围广、精确度高、抗干扰能力强及生产成本低的检测心肌肌钙蛋白I的方法。本发明所采用的技术方案为一种检测心肌肌钙蛋白I的方法将抗体组合物与聚苯乙烯胶乳颗粒进行偶联， 然后与检测标本中相应抗原发生免疫反应形成聚集颗粒，在400 700nm波长下测定反应物产生的浊度，即可得出检测标本中cTnl的含量。此方法的反应原理是胶乳增强免疫比浊法，基本反应过程为将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。在本发明中，检测标本中的cTnl与结合在胶乳颗粒表面的抗人cTnl抗体结合，产生抗原抗体反应，使胶乳颗粒形成聚集，在400 700nm 波长处测定吸光度，对照标准曲线可求出cTnl的含量。所述抗体组合物由至少3种抗体组成，每种抗体的量由与其结合的具体抗原的量决定。抗体的选择原则为抗体为cTnl特异、而不与快骨骼肌型肌钙蛋白I和慢骨骼肌型肌钙蛋白I发生交叉反应，即所述抗体是cTnl特异性的，不会和快骨骼肌型肌钙蛋白I、慢骨骼肌型肌钙蛋白I发生免疫反应。抗体组合物的选择原则为抗体组合物中若其中一种抗体对检测标本中某个影响cTnl精确测定的因素敏感(该因素会影响“一种抗体”与cTnl 的结合)，则至少有另一种抗体对该影响cTnl精确测定的因素不敏感(该因素不会对“另一种抗体”与cTnl的结合构成干扰)，即如果选择了一种对检测标本中某个影响因素比较敏感的抗体，那么选择的其他抗体中至少要有一种抗体对该影响因素不敏感，抗体经组合后，能够形成较强的反应性。检测标本中影响cTnl精确测定的因素包括cTnl的存在形式、 cTnl的磷酸化、cTnl的氧化、cTnl的易水解性、抗凝剂(具体影响状况如背景技术中所述) 对抗体结合的影响。抗凝剂如乙二胺四乙酸、肝素(具体影响状况如背景技术中所述)。所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，即由抗体组成的抗体组合物可以是单克隆抗体组合物、多克隆抗体组合物、或者单克隆抗体和多克隆抗体的组合物。作为优选，所述抗体组合物为MlS18M8单克隆抗体、19C741 49单克隆抗体、56083 93单克隆抗体、MF419(l li36单克隆抗体按1 :1:1: 1的比例进行组合，或MlS18M8单克隆抗体、19C741 49单克隆抗体、8E1086 9(1单克隆抗体、458169 m单克隆抗体按1 :1:1:1 的比例进行组合。
作为优�。�所述聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0. 05 0. 5 μ m。所述偶联为定向化学偶联，使得抗体组合物以特定取向连接到聚苯乙烯胶乳颗粒上，包括以下步骤(1)聚苯乙烯胶乳颗粒的激活在聚苯乙烯胶乳颗粒(带有羧基)中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDAC)，EDAC与聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为0. 5 5 100，反应0. 5 Ih后加入己二酸二酰胼，己二酸二酰胼与聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为50 250 100，继续反应0.5 lh，得到激活的聚苯乙烯胶乳颗粒；(2)抗体组合物的氧化用高碘酸钠将抗体组合物非结合活性区域Fc端的羧基氧化成醛基，高碘酸钠与抗体组合物的重量比为1 15 10；(3)抗体组合物与聚苯乙烯胶乳颗粒的偶联将步骤(1)激活的聚苯乙烯胶乳颗粒与步骤( 氧化的抗体组合物混合，抗体组合物与聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为2 22 100，反应1 池后，加入葡萄糖，葡萄糖与激活的聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为 (25 50) 100，继续反应2 4h，得到偶联抗体组合物的聚苯乙烯胶乳颗粒。本发明还提供运用上述检测心肌肌钙蛋白I的方法制备的心肌肌钙蛋白I检测试剂盒，该试剂盒包括试剂1、试剂2，其中试剂1为缓冲液，试剂2由偶联抗体组合物的聚苯乙烯胶乳颗粒、缓冲液组成，偶联抗体组合物的聚苯乙烯胶乳颗粒与缓冲液的重量体积比为 0. 05 0. 35%。作为优选，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、 醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液、氯化铵缓冲液中的一种或几种。所述试剂盒中试剂1所用的缓冲液与试剂2所用的缓冲液只要为上面的缓冲液中的一种任意搭配均可。该心肌肌钙蛋白I试剂盒除包括试剂1和试剂2外，还可以包括校准品，所述校准品采用cTnl-cTnT-cTnC复合物作为配制材料。目前各种试剂盒采用的校准品材料都各不相同，既有cTnl的单体形式，又有cTnC-Tnl、cTnC-cTnT-cTnl复合物形式，研究结果表明， 采用cTnl-cTnT-cTnC复合物作为校准品，由于其分子稳定性好又能被多数抗体识别，可大大缩小各试剂盒之间检测结果差异。本发明的优点和有益效果1、本发明所采用的检测方法具有操作简单、适用范围广、精确度高及生产成本低的优点；2、本发明检测方法中采用至少3种以上抗体的组合物，尽可能地满足了高精度 cTnl检测抗体所需条件，均衡了抗体对各种测定影响因素的敏感性，可以最小化阴性或阳性干扰，增加了测定方法的精确度；3、本发明采用定向偶联法将cTnl抗体包被到胶乳颗粒上，抗体偶联部位为Fc片段，使抗原结合位点指向流动相，因此不会发生抗体结合力损失的情况，保持了抗体的活力，大大减少了抗体的用量，降低了生产成本。除此之外，该方法得到的致敏胶乳颗粒稳定性较好，抗体不会从胶乳颗粒上脱落，而且由于化学偶联过程中，Fc片段发生了结构上的改变，因此减少了类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，大大提升了检测结果的准确性和可信性；4、本发明试剂盒中采用结构稳定、能被多数抗体识别的cTnl-cTnT-cTnC复合物作为校准品配制材料，进一步提高了试剂的检测性能。


图1所示的是本发明试剂盒与对照试剂盒的蛋白酶降解敏感性比较图；图2所示的是本发明试剂盒与对照试剂盒的肝素敏感性比较图；图3所示的是本发明试剂盒与对照试剂盒的磷酸化敏感性比较图。
具体实施例方式下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。实施例1 cTnl抗体组合物的选择本实施例选用两种抗体组合物作为本发明试剂盒的制备，进行试验，这两种抗体组合物分别为僅1818 28、1亂74卜49、56083 93、1^419(1 1964个单克隆抗体(购自HyTest)按 1:1:1: 1的比例进行组合，及M1818 28、19C741 49、8E10 ; 9(1、458169 1784个单克隆抗体(购自HyTest)按1 :1:1: 1的比例进行组合。当然，除了以上组合的抗体组合物外，也可以为符合要求的其他组合的抗体组合物。实施例2 cTnl检测试剂盒的制备本实施例的主要原材料如下1.抗体本发明试剂盒1僅1&8 现、1叱741 49、56083 93、1^419(1 1!36(比例为1 1 1 1)本发明试剂盒2:M1818 w、19C741 49、8E10TO 9(1、458169 1784 (比例为 1 1 1 1)对照试剂盒僅1818 28、1亂741 49(比例为1 1)2.胶乳本发明仅示例性地采用直径为150 250nm的带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒进行实验。本实施例的主要试剂配制如下试剂Rl 含 1. 2% PEG6000(聚乙二醇 6000)、0. 15M(mol/L) NaCl 的甘氨酸缓冲液。 该试剂为无色透明溶液。试剂R2 用抗人cTnl抗体组合物偶联聚苯乙烯胶乳颗粒。该试剂为乳白色溶液。具体步骤如下1.取Iml (100mg/ml)聚苯乙烯胶乳颗粒，用0. 1M、pH5. O的MES溶液(2-吗啉乙
磺酸缓冲液)洗涤3次，超声分散；2.加入0. 2ml用0. 1M、pH5. O的MES溶液新鲜配制的EDAC (10mg/ml)混合完全， 室温混和15min ；3.加入0. 8ml用0. 1M、pH5. O的MES溶液新鲜配制的己二酸二酰胼(83mg/ml)， 4 °C反应过夜；4.用0. 1Μ、ρΗ5. O的MES溶液洗涤2次，0. 1Μ、ρΗ7. 5的磷酸盐溶液洗涤1次，超声
分散备用；5.取1. 5ml抗体组合物(3. 9mg/ml)溶液，加入0. 2ml用0. 1Μ、ρΗ7. 5的磷酸盐溶液配制的高碘酸钠溶液(10mg/ml)，室温混合15min ；6.将步骤5中氧化好的抗体组合物加入到步骤4中已激活的聚苯乙烯胶乳溶液中，4°C反应过夜；7.加入0. 22ml 10% BSA(小牛血清白蛋白)溶液，4°C混合4h ；8.加入0. 3ml 10%葡萄糖溶液，4°C混合过夜；9.用0. 12M、pH7. 5甘氨酸溶液洗涤3次，加入0. 12M、pH7. 5甘氨酸溶液(含1 % BSA、0. 1% TW-20、0. 2% NaN3的甘氨酸缓冲液)至聚苯乙烯胶乳颗粒终浓度为0. 15%。cTnl校准品在磷酸盐缓冲溶液中加入不同含量的cTnl-cTnT-cTnC复合物，除菌过滤，所述的cTnl校准品中cTnl-cTnT-cTnC复合物含量控制在O 10ug/L之间，这些校准品均为无色透明液体。实施例3 cTnl的测定检测工具日立7060型自动生化分析仪。分析方法两点终点法；波长:600nm ；样品量25ul ；Rl :200ul ；R2 :50ul ；校准方式多点校准；反应方向向上；测定温度37°C ；样品与Rl混勻后，于第Imin读取吸光度 A1 ；于5min时加入R2，于細化时读取吸光度A2。反应吸光度的计算为A2与Al的校准差值。计算方法采用多点校准，多参数曲线方程(如logit/log)拟合，以ΔΑ可求得肌钙蛋白含量。实施例4不同影响因素的敏感性分析1、蛋白酶降解敏感性分析将内源性组织蛋白酶的混合物和cTnl-cTnT-cTnC复合物一起孵育120h，本发明试剂盒(包括本发明试剂盒1、本发明试剂盒2、和对照试剂盒同时检测孵育前和孵育后 cTnl-cTnT-cTnC复合物浓度，其中孵育前复合物浓度为10ug/L。实验结果表明，和对照试剂盒相比，本发明试剂盒大大提高了检测结果的稳定性(见图1)。2、肝素敏感性分析本发明试剂盒(包括本发明试剂盒1、本发明试剂盒2、和对照试剂盒同时检测不含肝素和含10IU/ml肝素的样本，实验结果表明，对照试剂盒对含有肝素的样本敏感性很高，和不含肝素的样本相比，其反应性有所降低，而本发明试剂盒在测定不含肝素或含有肝素样本时，反应性变化不大，即对肝素敏感性不高(见图2)。3、磷酸化敏感性分析本发明试剂盒(包括本发明试剂盒1、本发明试剂盒2、和对照试剂盒同时检测未发生磷酸化和被人为磷酸化的cTnl-cTnT-cTnC复合物，实验结果表明，对照试剂盒对磷酸化敏感性很高，而本发明试剂盒对磷酸化基本不敏感(见图3)。实施例所用的原料，除另有说明外，均为市售工业品。本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种检测心肌肌钙蛋白I的方法，其特征在于将抗体组合物与聚苯乙烯胶乳颗粒进行偶联，然后与检测标本中相应抗原发生免疫反应形成聚集颗粒，在400 700nm波长下测定反应物产生的浊度，即可得出检测标本中cTnl的含量；所述抗体组合物由至少3种抗体组成，所述抗体为cTnl特异、而不与快骨骼肌型肌钙蛋白I和慢骨骼肌型肌钙蛋白I发生交叉反应，且所述抗体组合物中若其中一种抗体对检测标本中某个影响cTnl精确测定的因素敏感，则至少有另一种抗体对该影响cTnl精确测定的因素不敏感，检测标本中影响 cTnl精确测定的因素包括cTnl的存在形式、cTnl的磷酸化、cTnl的氧化、cTnl的易水解性、抗凝剂对抗体结合的影响，抗体经组合后有较好的反应性。
2.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的方法，其特征在于所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的方法，其特征在于所述抗凝剂包括乙二胺四乙酸、肝素。
4.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的方法，其特征在于所述抗体组合物为M18w m单克隆抗体、19C741 49单克隆抗体、56083 93单克隆抗体、MF419(1 196单克隆抗体按1 :1:1: 1的比例进行组合，或MlS18M8单克隆抗体、19C741 49单克隆抗体、 8E1086 9(1单克隆抗体、458169 178单克隆抗体按1 :1:1: 1的比例进行组合。
5.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的方法，其特征在于所述聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0. 05 0. 5 μ m。
6.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的方法，其特征在于所述偶联为定向化学偶联，包括以下步骤(1)聚苯乙烯胶乳颗粒的激活在聚苯乙烯胶乳颗粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺与聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为0.5 5 100，反应0. 5 Ih后加入己二酸二酰胼，己二酸二酰胼与聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为50 250 100，继续反应0.5 lh，得到激活的聚苯乙烯胶乳颗粒；(2)抗体组合物的氧化用高碘酸钠将抗体组合物非结合活性区域Fc端的羧基氧化成醛基，高碘酸钠与抗体组合物的重量比为1 15 10；(3)抗体组合物与聚苯乙烯胶乳颗粒的偶联将步骤(1)激活的聚苯乙烯胶乳颗粒与步骤( 氧化的抗体组合物混合，抗体组合物与聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为2 22 100，反应1 池后，加入葡萄糖，葡萄糖与激活的聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为 (25 50) 100，继续反应2 4h，得到偶联抗体组合物的聚苯乙烯胶乳颗粒。
7.运用权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的方法制备的心肌肌钙蛋白I检测试剂盒，其特征在于包括试剂1、试剂2，其中试剂1为缓冲液，试剂2由偶联抗体组合物的聚苯乙烯胶乳颗粒、缓冲液组成，偶联抗体组合物的聚苯乙烯胶乳颗粒与缓冲液的重量体积比为0. 05 0. ；35%。
8.根据权利要求7所述的心肌肌钙蛋白I检测试剂盒，其特征在于所述缓冲液为PBS 缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液中的一种或几种。
9.根据权利要求7所述的心肌肌钙蛋白I检测试剂盒，其特征在于还包括校准品，所述校准品采用cTnl-cTnT-cTnC复合物作为配制材料。
全文摘要
本发明提供了一种检测心肌肌钙蛋白I的方法及运用该方法制备的心肌肌钙蛋白I检测试剂盒。该方法将抗体组合物与聚苯乙烯胶乳颗粒进行偶联，然后与检测标本中相应抗原发生免疫反应形成聚集颗粒，在400～700nm波长下测定反应物产生的浊度，即可得出检测标本中cTnI的含量。抗体组合物由至少3种抗体组成，抗体为cTnI特异、而不与快骨骼肌型肌钙蛋白I和慢骨骼肌型肌钙蛋白I发生交叉反应，且抗体组合物中若其中一种抗体对检测标本中某个影响cTnI精确测定的因素敏感，则至少有另一种抗体对该影响cTnI精确测定的因素不敏感。该方法操作简单、适用范围广、精确度高、抗干扰能力强、生产成本低。
文档编号G01N33/68GK102539784SQ201110440258
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者夏佳音, 邹炳德, 邹继华 申请人:宁波美康生物科技股份有限公司