对介质的磁辅助处理的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于对处理室(121)中的介质进行处理的处理设备(100)与方法。所述处理包括磁性粒子(M)到所述介质的添加，以及通过利用时变磁场(B)，尤其是利用部分振荡或旋转�。床僮菟鼋橹实幕旌�。可以利用多极磁场发生器(110)生成所述磁场(B)，所述多极磁场发生器包括四个子单元(111A、111B)，每个子单元具有芯(113A、113B)，所述芯(113A、113B)具有包围线圈(112A、112B)并且具有顶表面(114A、114B)，其中，所述子单元的全部顶表面优选地被布置在相同平面中，并且其中，全部的芯基本上相互平行。
【专利说明】对介质的磁辅助处理
【技术领域】
[0001] 本发明涉及能够被用于以磁方式对处理室中的介质进行处理的处理设备与方法。
【背景技术】
[0002] WO 2010/044006A2公开一种生物传感器系统，包括具有四个子单元的四极磁性组 件。每个子单元包括芯、顶表面和线圈。磁性组件被用于在传感器表面生成磁�。ü懦。� 磁性粒子能够被吸引到传感器表面或从该表面去除。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供允许对处理室中的介质的更多功能的处理的手段。
[0004] 该目的通过根据权利要求1的方法和根据权利要求2的处理设备得以实现。在从 属权利要求中公开优选的实施例。
[0005] 根据第一方面，本发明涉及一种用于处理包括靶粒子的介质的方法，所述介质例 如为包括核酸作为靶粒子的生物样品流体。所述方法包括以下步骤，所述步骤可以以所列 的或任意其他合适的顺序执行：
[0006] a)提供具有处理室的盒，能够利用待处理的所述介质填充所述处理室。所述盒通 常可以为由例如通过注塑成型的玻璃或塑料制成的可更换（一次性）部件。所述"处理室" 一般为相连的腔体，具有例如立方形的几何形状，或为通过通道相连的立方体的系统。
[0007] b)提供具有至少四个子单元的磁场发生器，每个子单元具有芯，所述芯具有顶表 面和包围所述芯的线圈，其中，全部子单元的所述顶表面被布置为毗邻前面提及的盒（并 因此毗邻所述处理室）。出于参考的目的，下文中将该磁场发生器称作"多极磁场发生 器"（其中，多极具有至少四个极）。
[0008] c)利用包括所述靶粒子的所述介质填充所述处理室。而且，所述磁性粒子（M)在 所述填充步骤之前、期间和/或之后，被添加到所述介质。在该上下文中，术语"磁性粒子" 应包括永磁粒子以及可磁化粒子两者，例如超顺磁珠。所述磁性粒子的大小通常在3nm到 50 μ m范围之间。所述磁性粒子例如可以在利用所述介质填充所述处理室之前，以干燥形式 存在于所述处理室中。
[0009] d)控制所述多极磁场发生器，使得生成时变磁�。鍪北浯懦〔僮菟龃判粤� 子并因此混合所述处理室中的所述介质。最优选地，在该步骤中个体地控制，即利用个体驱 动电流供应，所述多级磁场发生器的所述至少四个子单元。
[0010] e)将所述介质的靶粒子结合到所述磁性粒子。
[0011] f)控制所述多极磁场发生器，使得所述磁性粒子被吸引到所述处理室的表面，并 从所述处理室去除剩余的介质。
[0012] 以上方法中使用的重要部件为"多极磁场发生器"，能够利用其生成尤其适合于操 纵诸如生物样品流体的介质的磁场。该磁体的全部子单元的所述顶表面优选地被布置在相 同平面中，并且所述芯优选地基本上相互平行。
[0013] 前面提及的"在相同平面中"的布置按照定义应在与整体装置的大小有关的尺度 上测量。更具体地，如果第四个顶表面距包括前三个顶表面或至少与所述前三个顶表面相 交的平面（这样的平面总是存在的）的距离小于两个顶表面之间的最大距离的约10%，优 选地小于约5%，最优选地小于约1 %，则所述第四个顶表面应被视为被布置在该平面中。
[0014] 类似地，如果两个芯的延伸的轴以小于约20°，优选地小于约10°的相对角度取 向，则所述两个芯被视为"基本上"相互平行。
[0015] 大体上，所述多极磁场发生器的所述四个子单元可以在它们的尺寸和/或设计上 不同。然而优选地，全部四个子单元基本上彼此相同。而且，它们优选地被设置在具有旋转 对称的布置中，例如在正方形的角上。
[0016] 所述多极磁体的至少一个子单元可以任选地具有参与所述处理室中的磁场的生 成的多于一个顶表面。所述子单元可以例如被设计为具有毗邻所述盒布置的两个顶表面 (极）的马蹄形磁体。优选地，所述多极磁体的全部子单元可以被设计为这样的马蹄形磁 体。
[0017] 可以有多于四个具有上述特征的子单元（即具有芯、顶表面、包围所述芯的线圈、 以及任选的另外的特征），其中这样的子单元（或线圈）的总数目一般将为偶数。
[0018] 应注意，能够任选地在包括靶粒子的介质的连续流中执行所述方法。能够例如连 续地并且平行地，在所述处理室的不同位置处（例如在其不同的子室中），执行所述方法的 不同步骤。因此，能够由所述磁性粒子连续地捕获靶粒子。
[0019] 根据第二方面，本发明涉及一种用于处理包括靶粒子的介质的处理设备。所述处 理设备例如可以为生物传感器设备，能够在其中使生物样品流体任选地经受特定处理步 骤，并且能够在其中测量所述流体的性质。所述处理设备包括以下部件：
[0020] -具有处理室的盒，所述介质能够被提供在所述处理室中。
[0021] -包括至少四个磁性子单元的"多极磁场发生器"，每个磁性子单元具有芯，所述芯 具有顶表面和包围线圈，其中，所述顶表面被布置为毗邻所述盒。
[0022] -控制单元，通过所述控制单元，个体驱动电流能够被供应到所述多极磁场发生器 的所述子单元，所述个体驱动电流包括通过其进行以下操作的驱动电流：
[0023] a)操纵磁性粒子以混合所述处理室中的介质；
[0024] b)吸引磁性粒子到所述处理室的表面。
[0025] 所述磁性粒子在概念上可以被视为是或不是所述处理设备的部分。它们例如可以 在所述设备的使用之前，以干燥形式被储存在所述盒内。
[0026] 所述处理设备和所述方法基于相同的概念，即它们允许在操纵所述介质中的特定 实体（例如磁性粒子）的磁场的帮助下，混合所述介质。额外地，所述磁场发生器具有这样 的有利设计，使得允许其布置毗邻包括所述介质的盒的平面侧。
[0027] 由于它们的关系，针对所述处理设备或所述方法提供的解释这对其他部件也类似 地有效。而且，将在下文中描述本发明的优选实施例，所述优选实施例，加以必要的变通，适 用于所述处理设备和所述方法。
[0028] 在本发明的优选实施例中，所述多极磁场发生器的所述至少四个子单元被布置在 所述处理室之下（其中术语"之下"不应指关于重力的特定取向，而应表达在一手侧上的所 述至少四个子单元与在另一手侧上的所述处理室被布置在特定给定平面的不同侧）。优选 地，所述子单元也被布置在所述盒（其包含所述处理室）之下。所述盒则能够有利地被放 置在所述多极磁场发生器的顶上。
[0029] 根据另一优选布置，所述多极磁场发生器的所述至少四个子单元被布置为包围所 述处理室。尤其地，所述子单元的所述顶表面可以被布置为使得所述处理室（至少部分地） 位于它们之间。所述至少四个子单元例如可以突出到所述盒中，因此包围所述处理器。
[0030] 在本发明的另一实施例中，可以提供额外的磁场发生器，其被布置为关于所述处 理室与所述多极磁场发生器相对（即所述处理室被至少部分地设置在所述多极磁场发生 器与所述额外的磁场发生器之间）。所述额外的磁场发生器例如可以为永磁体或电磁体。 而且，优选地，能够独立于所述多极磁场发生器控制所述额外的磁场发生器。然而，应注意， "多极磁场发生器"与"额外的磁场发生器"之间的区别是任意的，因为后者也可以被视为所 述"多极磁场发生器"的部分。
[0031] 被添加到所述待处理介质的所述磁性粒子优选地形成磁流变结构，同时它们被操 纵以混合所述介质。这样的结构例如可以包括磁性粒子的链的复杂网络。
[0032] 被填充有所述待处理介质的所述处理室的体积通常小于约2000 μ 1，优选地小于 约500 μ 1并且可以低至10 μ 1，可能甚至为1 μ 1。这样小的流体体积的混合是个问题，因 为基于湍流的生成的常规途径通常失败了。因此，巨大的优势在于，本发明允许对这样小的 体积的磁诱导混合。
[0033] 在所述方法的第一步骤中被添加到所述介质的所述磁性粒子，在所述混合的步骤 期间，优选地被（均匀地或非均匀地）分布在整个处理室上。因此，磁耦合与混合基本上发 生在整个处理室内。
[0034] 由所述（一个或多个）磁场发生器生成的磁�。�/或在所述方法的所述混合步 骤期间施加的时变磁场，优选地包括至少一个振荡（向量）分量。而且，所述磁场可以至少 部分地为旋转的（即其可以包括在给定的固定平面中旋转的向量和垂直于所述平面的向 量）。具有振荡分量的磁场和/或部分旋转的磁场能够诱导对应的振荡和/或所述磁性粒 子的旋转移动，所述振荡和/或旋转移动被证明是有效的混合操作。
[0035] 前面提及的振荡或旋转的频率的范围优选地在约0. 005Hz到约100Hz之间，约 0. 01Hz到约100Hz之间，或约0. 1Hz到约100Hz之间。
[0036] 根据本发明的另一实施例，被添加到所述介质的所述磁性粒子的全部或一些包括 能够特异性地结合到所述介质的特定靶组分的结合位点。所述磁性粒子例如可以被包覆以 抗原，所述抗原特异性地结合到生物样品介质中的抗体。在将这样的磁性粒子添加到所述 介质之后，磁性粒子与靶组分（如果存在的话）之间的结合将发生，所述结合为所述磁性粒 子的除所述介质的混合以外的作用。
[0037] 在本发明的再另一实施例中，被添加到所述介质的所述磁性粒子的全部或一些能 够以静电方式结合充电粒子和/或极化粒子（例如分子），尤其是核酸（例如DNA或RNA或 其他核酸）的片段。
[0038] 大体上，所述磁性粒子中的至少一些可以包括能够以静电方式充电（并且在附近 的介质中保持该充电）的材料，尤其是二氧化硅（Si0 2)。这允许前面提及的粒子的静电结 合。
[0039] 前面提及的静电结合的强度通常将取决于所结合的分子的电荷的量。针对核酸的 片段，它们的电荷的量通常与片段的大小有关。核酸的片段到磁性粒子的静电结合因此能 够被用于选择性地将（没有充分结合到所述磁性粒子的）小的片段与（充分地结合的）长 的那些分尚开。
[0040] 在所述方法的处理步骤中，所述磁性粒子被吸引到所述处理室的表面。到表面的 这种吸引能够例如被用于制备所述处理室中的大团介质，用于没有所述磁性粒子的处理步 骤。额外地或备选地，可以利用在所述表面处的所述磁性粒子和/或被附接到其的组分，执 行特定的处理步骤。
[0041] 在本发明的另一实施例中，在所述磁性粒子到表面的所述吸引期间，将新介质引 入到所述处理室中。因此，在所述磁性粒子保留在所述处理室内的同时，所述介质的隔离交 换是可能的。如果所述磁性粒子结合第一介质的靶组分，则在引入新介质时，这些靶组分也 能够被保留在所述处理器中。所述磁性粒子因此可以例如被用于将核酸的长片段保留在所 述处理室中，同时将短片段与大团介质一起移除。
[0042] 根据前面提及的实施例的进一步发展，被结合到磁性粒子的靶组分（尤其是已在 所述方法的所述结合步骤期间被结合到磁性粒子的靶组分）被释放到新介质中。这意味 着，在所述新介质已被引入到所述处理室中之后，这些靶组分从所述磁性粒子离解。因此整 个流程对应于靶组分从一种介质到另一种的特异性转移，其可以被用于纯化和/或浓缩生 物样品。
[0043] 在前面提及的实施例的进一步发展中，在所述靶组分到新介质中的所述释放期 间，生成操纵所述磁性粒子并因此混合所述介质的时变磁场。实验显示，这提供了被释放靶 组分的产率的令人惊讶的高增加。
[0044] 如果上述种类的额外的磁场发生器存在，并且被布置为关于所述处理室与所述多 极磁场发生器相对，则该额外的磁场发生器可以优选地在所述靶组分到所述新介质中的所 述前面提及的释放期间被激活。
[0045] 能够根据特定试验的需要，以任意合适的顺序重复几次以下所述步骤：将磁性粒 子吸引到所述处理器的表面，交换所述室中的所述介质，和/或以磁性方式混合所述室中 的所述介质。因此，例如能够实现有效的DNA纯化流程。
[0046] 大体上，被处理的所述介质中的所述靶粒子可以优选地包括核酸（例如DNA或 RNA)、蛋白、多肽、脂质、碳水化合物、代谢物、激素、药物、药用材料、细胞碎片、细胞、组织元 素、或前面提及的组分中的一些的混合物。
[0047] 已提及，对所述介质的处理尤其可以为或包括检测流程。根据相关实施例，所述处 理设备可以包括光检测器，其用于在所述处理室的平面壁处检测完全内反射的光。然后能 够利用有利的方式在所述壁的所述表面处执行对受抑全内反射（FTIR)的测量。该方法的 细节可以在US 2011/0221427A1或W0 2008/072156 A2中找到，通过引用将它们并入本申 请中。
[0048] 所述处理设备和/或所述（一个或多个）磁场发生器可以优选地包括控制单元， 所述控制单元用于选择性地施加驱动电流到所述子单元的所述线圈（和/或到所述额外的 磁场发生器，如果存在的话）。因此能够个体地控制每个子单元，这允许磁场在毗邻的空间 或处理室内的多功能生成。
[0049] 前面提及的驱动电流例如可以具有正弦时间进程，其中，不同子单元的电流可以 具有相同频率但不同相位。大体上，电流的频率和/或幅度可以针对不同的子单元而不同。 驱动电流的其他可能的时间进程包括方形、三角、锯齿或不规则波形。
[0050] 在步骤c)中填充所述处理室的所述介质优选地可以包括聚亚烷基二醇，例如 PEG (聚乙二醇），其量的范围尤其在约lwt-%到约20wt-%之间，优选地在约5wt-%到约 10wt-%之间的量。PEG已在DNA片段的大小选择方面的实验中显示出积极作用，即磁性珠 耦合到这样的片段的特异性取决于片段的长度。而且，PEG的存在似乎对磁性珠的静电行 为具有积极影响，增大它们形成磁流变结构的就绪性。包括聚亚烷基二醇的所述介质可以 任选地还包括盐溶液，例如NaCl的溶液（例如约0. 1M至1. 5M，优选为约1. 25M)。包括聚 亚烷基二醇和/或盐溶液的所述介质可以优选地与羧基化磁性粒子的应用组合。
[0051] 根据第三方面，本发明涉及一种用于处理包括靶粒子的介质的处理设备，所述处 理设备包括以下部件 ：
[0052] -具有处理室的盒，所述介质可以被提供在所述处理室中；
[0053] -具有至少四个子单元的多极磁场发生器，每个子单元具有芯，所述芯具有顶表面 和包围所述芯的线圈，其中，全部子单元的所述顶表面被布置为毗邻所述盒；
[0054] -额外的磁场发生器，其被布置为关于所述处理室与所述多极磁场发生器相对；
[0055] -控制单元，通过所述控制单元，个体驱动电流能够被供应到所述多极磁场发生器 的所述子单元和/或到所述额外的磁场发生器。
[0056] 所描述的处理设备允许对所述处理室中的磁性粒子的多功能操纵，因为后者被围 在多极磁场发生器与（能够被个体控制的）额外的磁场发生器之间。因此，例如能够通过 适当地操纵所述磁性粒子，混合所述处理室中的小体积的介质。
[0057] 根据所述第三方面的所述处理设备能够任选地具有以上分别关于根据本发明的 第一和第二方面的所述处理设备和/或所述方法描述的特征中的一个或多个。
[0058] 本发明还涉及根据本发明的第一和/或第三方面的所述处理设备用于通过激励 磁性粒子混合介质的用途。如上所述，该混合尤其能够包括操纵所述磁性粒子以形成磁流 变结构的时变磁场的生成。
[0059] 而且，本发明涉及根据本发明的第一和/或第三方面的所述处理设备用于靶组分 从介质的分离，尤其用于特定长度的DNA片段（或其他核酸物质）从其他DNA片段（或核 酸物质）的分离的用途。因此例如能够实现短的合成寡聚物和DNA片段（例如来自DNA库 的衔接子，或来自扩增的引物）的有效纯化及去除。
[0060] 本发明还涉及上文描述的所述处理设备用于分子诊断、生物样品分析、核酸处理 (尤其是核酸纯化）、化学样品分析、食品分析和/或法医分析的用途。例如可以在被直接 或间接地附接到靶分子的磁性珠或荧光粒子的帮助下，完成分子诊断。
【专利附图】
【附图说明】
[0061] 本发明的这些以及其他方面将从后文描述的实施例变得显而易见，并将参考后文 描述的实施例得以阐明。
[0062] 附图中：
[0063] 图1示意性地示出在通过以磁性方式操纵的磁性粒子对流体的混合期间，根据本 发明的第一生物传感器的侧视图；
[0064] 图2示出当所述磁性粒子被吸引到表面时，图1的所述生物传感器；
[0065] 图3示出图1的所述生物传感器的所述磁场发生器的俯视图；
[0066] 图4图示DNA纯化流程的连续处理步骤；
[0067] 图5示出可以被施加到图1-3中的线圈的驱动电流的示范性时间进程；
[0068] 图6示出作为参考的取决于片段大小的DNA片段产率与根据本发明的方法的DNA 片段产率的比较；
[0069] 图7示出生物传感器的第二实施例，其中，磁性子单元被设置在盒之下和之上。
[0070] 在附图中，类似的附图标记或相差100的整数倍的附图标记指示相同或相似的部 件。
【具体实施方式】
[0071] 在用于分析化学和生物技术应用的小型微流控设备领域中，快速且有效的混合是 重要挑战之一。事实上，在小尺度上缺乏湍流将混合机制限制为分子扩散，分子扩散是个缓 慢的过程。
[0072] 为了解决前面提及的问题，本发明提出一种新的微流控混合概念，其基于通过局 部交变磁场对磁性粒子（珠）的操纵。优选地，所述磁性粒子通过在磁场的存在下的磁偶 极子相互作用形成自组装结构。这些结构或物体也被称作"磁流变结构"。这样的结构通常 包括磁链的非常丰富且复杂的网络，并且其大小由几个竞争的磁力确定。介质的混合则尤 其可以是由磁流变结构网络生成的无序对流的结果。
[0073] 为了实现生物分子与缓冲液或其他介质的有效（良好且快速的）混合，本发明尤 其提出在使用（至少）四个磁性子单元的电磁体的帮助下，激励磁性粒子（珠）。经由该方 法，能够有效地实现混合，得到（封闭的）盒中的高清除率。该方法也能够被用于通过使用 DNA到磁性珠的结合对DNA (或其他核酸物质）的纯化。
[0074] 图1-3示意性地示出根据以上的一般概念的处理设备100的第一实施例。处理设 备100包括三个主要部件，即：
[0075] 1、具有处理室121的盒120,可以在处理室121中提供介质（通常为流体，尤其是 液体）。处理室121连接至入口 122和出口 123,分别用于填充和排空它。而且，处理室121 包括平面（底）壁124,其具有在面向处理室121的内部的一侧上的表面125。如果处理设 备100被提供给有合适的检测器件（例如FTIR检测器，未示出），则该表面例如可以充当检 测表面。尽管所示出的处理室基本上为立方体，但其也可以具有更复杂的形状，例如包括彼 此通过通道连接的几个子室（"混合室"、"反应室"等等）。
[0076] 2、包括四个磁性子单元111A、111B、111C和111D (在图1和图2中，仅前面的两个 子单元可见；在图3的俯视图中能够看到全部四个子单元）的"多极磁场发生器"110。全 部四个子单元具有相同的设计，例如子单元111A包括芯113A，芯113A被线圈112A围绕并 且具有顶表面114A。所述四个子单元的芯113AU13B相互平行（全部在z方向延伸）。而 且，顶表面114A-114D全部被布置在相同平面中。因此，四个顶表面能够被设置为紧紧毗邻 盒120的平面壁124。所述顶表面或尖端之间的内距d(磁气隙）通常范围在约1mm到约 5cm之间。尖端宽度为关键参数，因为其确定所生成的磁场的定位。由于该实施例中仅有四 个子单元，所述磁场发生器在下文中也被称作"四极"。
[0077] 在备选的实施例中，顶表面114A-114D也可以突入所述盒中，以包围所述处理室。 在该情况中，所述尖端的所述顶表面之间的距离d必须足够大，例如为约1. 5cm。
[0078] 3、任选的额外的磁场发生器130,例如具有线圈和芯的电磁体，所述芯被设置在处 理器121之上。尽管附图示出单个电磁体，但额外的磁场发生器130也可以为多极（例如四 极）磁体。应注意，该额外的磁场发生器130也可以在概念上被当作"多极磁场发生器"110 的部分。
[0079] 如图1中所示，全部四个磁性子单元111A-111D的所述芯可以被附接到公共基座 结构117。该基座结构117和/或所述芯优选地由铁磁材料制成。所述子单元应被一个接 一个地磁性连接以用于磁通闭合。有关单个子单元的可能设计特征的更多信息可以在US 2011/0221427 A1和WO 2010/044006A2中找到，通过引用将它们并入本文本。
[0080] 在另外的备选配置中，单个子单元中的每个均可以为马蹄形磁体（例如在中间具 有单个线圈的两个相连的极）。子单元中的每个的极不应相互太接近，例如彼此具有约为极 (尖端）大小那么大的距离。
[0081] 线圈112A-112D和额外的磁场发生器130被耦合到控制单元140,能够通过控制单 元140向它们供应个体驱动电流。因此能够相互独立地控制电流，并且能够在所述盒中生 成例如非常不规则的外部磁场（这对于利用磁性粒子的混合可以是有利的）。
[0082] 图1还示出整个四极磁场发生器110由在z方向有弹力的弹簧115承载。因此， 四极磁场发生器110和盒120能够被带到完美接触/接近，而无论任何制造容限，其中，顶 表面114A-114D接触盒120。
[0083] 使用四子单元磁性布置的电磁体，能够通过四极磁体110和任选地额外的顶磁体 130以及对个体电磁体或线圈112A-114DU30的适当激励，实现通过磁性粒子对介质的混 合。尤其地，能够在平面中生成变化或振荡（例如旋转）磁场B。
[0084] 所描述的实施例的关键区别特征在于，四极磁体组件在所述盒的表面之下。这确 保了四极磁体有效运行，尽管在所述盒的外侧；并且在于，其以这样的方式被定位，使得能 够以简单的方式完成所述盒在所述磁体的场中的插入。
[0085] 应注意，在去除/泵出残留液体时，也能够使用表面125上的"固定"磁性粒子对 电磁体112A-114D、130的激励，用于洗涤应用。这在洗涤和清除协议的特定步骤中是需要 的，如下文更详细地描述的。
[0086] 使用电磁体作为子单元的尤其有利的方面在于，电磁体的磁极（顶表面）的形状 不必须被加工到非常高的精确度。相反，能够通过合适的激励协议生成所期望的场和场梯 度。
[0087] 另一重要因素是通过使用交变磁场诱导所述磁性微球的旋转运动的可能性。该旋 转运动为所述混合提供额外的主动贡献。磁性粒子在室或通道中的保留与操纵使得更局部 的磁场成为必须。因此，所描述的电磁系统允许磁通量的生成与聚焦。在主动混合的情况 中，以磁性方式操纵所述珠。所述磁流变结构区域中（尖端之间）的流体将被强烈搅拌。 在该上下文中，能够想象所述混合是流体被超顺磁性珠网络无序分裂的结果。另一重要因 素是超顺磁珠在低频f(〇. lHz〈f〈50Hz)处的交变磁场中的集体动力学行为。简言之，该动 力学是通过改变磁场极性诱导的磁性偶极子的旋转的结果。能够容易地设置时间相关的磁 �。杂盏汲炒判灾榈耐绲恼庵衷硕�。
[0088] 所描述的系统的有用应用是对短寡聚物和DNA片段（例如来自DNA库的衔接子） 的有效清除与去除。图4图示相关联的协议，通过该协议获得（封闭的）盒中的清除，其更 快地起作用并且具有提供更高产率的优点。类似的协议也能够被有利地用于改进混合效 率，例如通过珠以及它们的旋转矩在四极场中的引入，引入了（旋转）无序混合。
[0089] 根据图4的步骤a)，处理室121被填充有包含DNA片段或靶T的溶液。在该步骤 期间，以磁性方式将已存在于所述室中的磁性粒子Μ吸引到所述室的底表面，使得它们不 受所述溶液的流入影响。所述磁性粒子或者可以与DNA溶液一起提供。
[0090] 在步骤b)中，磁性珠 Μ被释放到所述介质中，并且例如通过旋转磁场被激励，以便 在所述样品室中开始对流体的混合。在该步骤期间，DNA靶Τ被磁性粒子Μ结合。所述磁 性粒子通常在所述处理室中具有为约0. 2mg/ml至约2mg/ml的浓度。
[0091] 前面提及的靶T的结合应优选地为特异性的，在于仅特定靶分子结合而其他的不 结合，这取决于分子的性质。
[0092] 在优选的应用中，靶T例如包括各种长度的DNA片段，包括（期望的）长片段的DNA 以及较�。ú幌胍模┦Ｓ嗥瘟秸撸鍪Ｓ嗥卫绶橇拥南谓幼悠�、松散寡核苷 酸或太小的DNA片段（与测序不相关，因为它们在以下测序步骤的阅读长度以下）以及引 物二聚体（用于可能的先前执行的扩增（例如PCR)步骤）。其为（应）由所述磁性粒子捕 获的长DNA片段。这可以在能够以静电方式结合充电分子的磁性粒子的帮助下得以实现。 这例如为针对二氧化硅珠（在其中嵌入磁性纳米粒子）的情况。仅长DNA片段充分充电以 粘到这些磁性粒子（即粘到二氧化娃）。关于此的更多信息可以在文章 "Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids，'（R. Boom, Μ. M. Salimans, C. L. Jansen, P.M.Wertheim-van Dillen, J.van der Noordaa, J.Clin.Microbiol.l990,28(3),第 495 页）中找到。
[0093] 额外地或备选地，能够使用的磁性粒子在它们的表面上具有特定的寡核苷酸捕获 片段。在该情况中，DNA或RNA到磁性珠的吸引通过杂交而发生，其中，核酸片段结合到在 给定珠的表面上的其互补片段。捕获片段针对一组特定的核酸能够是特异性的，例如针对 mRNA，或针对一个特定序列的poly-dT寡核苷酸。通过使用所提出的主动混合，这些磁性珠 的捕获效率能够得到非常大的提高。这例如能够被用于靶向测序工作，即仅测序针对手边 的特定临床或生物学问题感兴趣的基因组的部分。在该过程中使用的珠也可以为如在W0 2010/097775 A1中公开的编码珠。
[0094] 在步骤c)中，具有结合靶T的、磁性粒子Μ被吸引到所述处理室的底表面，然后通 过去除残留缓冲流体和小的未结合DNA片段，排空所述处理室。而且，在所述磁性粒子仍保 留在底表面的同时，将冲洗缓冲液引入到所述处理室中。
[0095] 在步骤d)中，具有结合靶Τ的磁性粒子Μ再次被释放到所述处理室中，并被激励 以用于混合。
[0096] 在步骤e)中，在从冲洗缓冲液排空所述处理室的同时，将具有结合靶的磁性粒子 吸引到底表面。而且，接下来将洗脱缓冲液引入到所述处理室中。洗脱缓冲液通常为这样 的介质，其降低磁性粒子与结合靶组分（例如DNA片段）之间的静电相互作用。
[0097] 在步骤f)中，所述磁性粒子已被释放到所述处理室中，并且被激励以用于混合流 体。在该步骤中，靶T从磁性粒子Μ分离。
[0098] 扩增的DNA的实验指示，捕获的靶组分能够有效地从磁性粒子释放，即使后者在 很大程度上保留为团聚状态。这允许使用仅在一侧上具有单个磁场发生器的处理设备（例 如图1-3的处理设备100,没有额外的磁体130)，尽管也可以利用顶磁体的活性。
[0099] 在步骤g)中，在将所述处理室中包括所释放的靶T的介质从所述室去除的同时， 再次将所述磁性粒子吸引到底表面。
[0100] 应注意，也可以出于许多其他目的使用通过激励磁性珠对介质的所描述的混合， 例如用于溶解细胞，使得诸如DNA和RNA的细胞组分将被释放。
[0101] 所使用的四极磁体的重要优点是操纵所述珠的能力。这是针对在测序（以及其他 协议）中的混合和清除步骤的关键。为了恰当地浓缩并混合介质，需要四极磁体，因为其允 许使用各种驱动方案（例如使用方块驱动方案或正弦驱动方案）在流体中的珠循环。实验 显示，这些驱动方案例如生成珠的振荡环，其诱导流体的良好混合。
[0102] 图5示出针对各种示范性驱动方案，到四个线圈112A-112D的驱动电流的时间进 程。
[0103] 图5中的上图示出分别被施加到线圈112A、112B、112C、112D的正弦驱动电流IA、 IB、I。、ID。四个电流具有相同的幅度（例如±2A)和周期T(例如Is)，但在I A与IB、IB与 Ic、以及Ic与ID之间相互有相移Δφ (约T/8)。
[0104] 图5中的中图示出与所述上图相同的正弦驱动电流IA、IB、I c、ID，但具有约Τ/4的 更大的相互相移Δφ。
[0105] 图5中的下图图示针对驱动电流ΙΑ、ΙΒ、I。、I D可以使用的几个基本波形，即：
[0106] -方波形 SQ;
[0107] -正弦波形SI;
[0108] -与垂直轴镜面对称的三角波形TR ;
[0109] -锯齿波形ST (即具有一个垂直边缘的三角波形）。
[0110] 如在上面两图中针对正弦波形SI所图示的，针对全部线圈的驱动电流通常具有 相同的波形但有相互相移。然而大体上，也能够针对线圈的驱动电流使用不同的幅度、周 期、相移和/或波形。而且，所施加的波形也可以是不规则的，即根本不具有周期性。
[0111] 图6在图中示出作为参考的取决于片段大小的DNA片段产率Y(上曲线"Ref"）与 根据图4的方法的DNA片段产率Y(下曲线"Crtg"）的比较。产率Y被定义为所供应的片 段（即进入图4a中的）中被所述磁性珠保留（即留在图4g中的）的百分数。水平轴涉及 经由它们的核苷酸数量测量的片段大小。在包括7% PEG的溶液中提供并处理片段（参见 US 5898071)。可见，根据本发明的方法在片段大小方面令人惊讶地有比参考方法更高的选 择性。
[0112] 图4中的洗脱步骤f)可以包括顶磁体的激活。然而，使用结合缓冲液（例如7% PEG，1. 25M NaCl)，也能够单独利用四极磁场发生器充分激励磁性珠。可能怀疑结合缓冲液 改变了珠的静电荷，使得珠能更靠近在一起，并达到更大的静磁矩。
[0113] 在原理上对应于图4的流程的典型实验中，进行以下步骤：
[0114] -磁性珠的提供（例如羧基包覆的磁性珠，具有约1 μ m的平均直径和约30Am2/ kg(30emu/g)的磁矩）；
[0115] -1次lmL 70%乙醇的制备；
[0116] -盒在设置上的放置；
[0117] -200 μ 1洗脱缓冲液（例如5mM Tris，pH = 8. 5)在对应的注射器中的添加；
[0118] -在将要泵送乙醇之前，将0. 5mL 70%的乙醇放到用于乙醇的储器中；
[0119] -42. 9 μ 1的DNA产品到所述盒的混合室（图1中未示出）中的添加；
[0120] -77. 1 μ 1的珠到针对所述珠的储器中的添加；
[0121] -将所述珠泵送到所述混合室；
[0122] -在所述混合室中保持泵送5分钟左右；
[0123] -通过使用在所述盒的样品出口侧/废物侧的泵（也称作抽拉泵），将样品和珠泵 送到所述处理室；
[0124] -当所述室充满时，停止泵送；
[0125] -将小的永磁体放置在所述处理室的顶上，并在整个实验期间保持其在那里；
[0126] -收集所述珠3分钟；
[0127] -再次使用抽拉泵，在240秒上泵送乙醇通过所述处理室（约0. 5mL)到废液，而不 首先泵走结合缓冲液；
[0128] -泵送空气通过所述处理室8分钟，以干燥所述室/珠；
[0129] -泵送洗脱缓冲液到所述处理室中；
[0130] -当所述室充满时停止泵送；
[0131] -激励四极磁体5分钟（交替打开和关闭磁体）；
[0132] -允许所述珠再次在顶磁体处聚集2分钟；
[0133] -泵送液体到样品出口，顶磁体一直在其上；
[0134] -定量洗脱液的体积；
[0135] -也清除废液；
[0136] -在具有12000DNA试剂盒的生物分析器上分析洗脱液。
[0137] 对该实验的评价显示DNA片段在洗脱液中约85%的产率。
[0138] 图7示出根据本发明的另一优选实施例的生物传感器200。在生物传感器200中， 多极磁场发生器210的四个子单元21认、21川、211(：、2110(电磁体）被设置在盒220周围， 以便诱导期望的任意场取向。这使得也能够在垂直方向（z方向）调节场。
[0139] 所描述的磁性结构可以任选地与加热元件组合。这可以进一步改进混合与清除步 骤的特异性，因为DNA结合与释放也是温度T的函数。
[0140] 总之，本发明涉及用于对处理室中的介质进行处理的磁场发生器、处理设备及方 法。所述处理包括磁性粒子到所述介质的添加，以及通过利用时变磁�。绕涫牵ú糠郑┱� 荡或旋转�。僮菟龃判粤Ｗ永椿旌纤鼋橹�。可以利用包括四个子单元的磁场发生器 生成所述磁场，每个子单元具有芯，所述芯具有包围线圈并且具有顶表面，其中，所述子单 元的全部顶表面被布置在相同平面中并且其中，全部芯基本上相互平行。本发明包括在盒 表面之下的四极磁铁用于激励（封闭的）盒中的磁性粒子，以影响处理步骤（例如混合） 的用途。而且，其涉及使用四极磁体在（封闭的）盒中清除DNA或其他核酸（例如RNA)的 协议。
[0141] 尽管已在附图和前面的描述中详细说明并描述了本发明，但要将这样的说明和描 述视为说明性或示范性的，而非限制性的；本发明不限于所公开的实施例。通过研究附图、 说明书以及权利要求书，本领域技术人员在实践要求保护的本发明时可以理解并实现所公 开实施例的其他变型。在权利要求书中，词语"包括"不排除其他元件或步骤，并且量词"一" 或"一个"不排除多个。互不相同的从属权利要求中记载了特定措施并不指示不能有利地 使用这些措施的组合。权利要求书中的任何附图标记不得被解释为对范围的限制。
【权利要求】
1. 一种用于处理包括靶粒子（T)的介质的方法，所述方法包括以下步骤： a) 提供具有处理室（121、221)的盒（120、220); b) 提供具有至少四个子单元（111A、111B、111C、111D、211A、211B、211C、211D)的多极 磁场发生器（110、130、210)，每个子单元具有芯（113八、1138)，所述芯具有顶表面（114八、 114B)和包围所述芯（113AU13B)的线圈（112AU12B)，其中，全部子单元的所述顶表面 (114A、114B)被布置为毗邻所述盒（120、220); c) 利用包括所述靶粒子（T)的所述介质填充所述处理室（121、221)，其中，在添加磁性 粒子（M)到所述介质之前、期间和/或之后，完成所述填充； (1)控制所述多极磁场发生器（110、130、210)，使得生成时变磁场出），所述时变磁场操 纵所述磁性粒子（M)并因此混合所述介质； e) 将所述介质的靶粒子⑴结合到所述磁性粒子（M); f) 控制所述多极磁场发生器（110、130、210)，使得所述磁性粒子_被吸引到所述处 理器（121、221)的表面（125、225)，并从所述处理室（121、221)去除剩余的介质。
2. -种用于处理包括靶粒子（T)的介质的处理设备（100、200)，包括： -具有处理室（121、221)的盒（120、220)，所述介质能够被提供在所述处理室中； -具有至少四个子单元（111A、111B、111C、111D、211A、211B、211C、211D)的多极磁场 发生器（110、130、210)，每个子单元具有芯（1124、1128)，所述芯具有顶表面（114八、1148) 和包围所述芯（112A、112B)的线圈（112AU12B)，其中，全部子单元的所述顶表面（114A、 114B)被布置为毗邻所述盒（120、220); -控制单元（140)，通过所述控制单元，个体驱动电流能够被供应到所述多极磁场发生 器（110、130、210)的所述子单元（11认、11比、111(：、1110、21认、2118、211(：、2110)，所述个 体驱动电流包括通过其进行以下操作的驱动电流： a) 操纵磁性粒子（M)以混合所述处理室（121、221)中的介质； b) 吸引磁性粒子（M)到所述处理室（121、221)的表面（125、225)。
3. 根据权利要求2所述的处理设备（100、200)或根据权利要求1所述的方法， 其特征在于，所述多极磁场发生器（110、130、210)的所述至少四个子单元（111A、 111B、111C、111D、211A、211B、211C、211D)被布置在所述处理室（221)之下和/或包围所述 处理室（221)。
4. 根据权利要求2所述的处理设备（100)或根据权利要求1所述的方法， 其特征在于，额外的磁场发生器（130)被布置为关于所述处理器（121)与所述多极磁 场发生器（120)相对。
5. 根据权利要求2所述的处理设备（100、200)或根据权利要求1所述的方法， 其特征在于，所述磁性粒子（M)形成磁流变结构，同时它们被操纵以混合所述介质。
6. 根据权利要求2所述的处理设备（100、200)或根据权利要求1所述的方法， 其特征在于，所述磁�。˙)包括至少一个振荡分量，和/或其为至少部分旋转的。
7. 根据权利要求2所述的处理设备（100、200)或根据权利要求1所述的方法， 其特征在于，所述磁性粒子（M)中的至少一些包括特异地结合到所述介质的靶组分 (T)的结合位点。
8. 根据权利要求2所述的处理设备（100、200)或根据权利要求1所述的方法， 其特征在于，所述磁性粒子（Μ)中的至少一些能够以静电方式结合粒子，尤其是结合 核酸的片段。
9. 根据权利要求2所述的处理设备（100、200)或根据权利要求1所述的方法， 其特征在于，所述磁性粒子（Μ)中的至少一些包括二氧化硅。
10. 根据权利要求1所述的方法， 其特征在于，在步骤f)之后新介质被引入到所述处理室（121、221)中。
11. 根据权利要求10所述的方法， 其特征在于，结合到磁性粒子（M)的靶组分（T)被释放到所述新介质中。
12. 根据权利要求11所述的方法， 其特征在于，在所述靶组分（T)到所述新介质中的所述释放期间，生成操纵所述磁性 粒子（M)并因此混合所述介质的时变磁�。˙)。
13. 根据权利要求12所述的方法， 其特征在于，额外的磁场发生器（130)被布置为关于所述处理室（121)与所述多极磁 场发生器（130)相对，并在所述靶组分（T)到所述新介质中的所述释放期间被激活。
14. 根据权利要求2所述的处理设备（100、200)或根据权利要求1所述的方法， 其特征在于，所述靶粒子（T)包括核酸、蛋白、多肽、脂质、碳水化合物、代谢物、激素、 药物、药用材料、细胞碎片、细胞、或组织元素。
15. 根据权利要求1所述的方法， 其特征在于，步骤c)中的所述介质包括聚亚烷基二醇，其量尤其在约lwt-%到约 SOwt-1%之间。
16. -种用于处理包括靶粒子（T)的介质的处理设备（100、200)，包括： -具有处理室（121、221)的盒（120、220)，所述介质可以被提供在所述处理室中； -具有至少四个子单元（111A、111B、111C、111D、211A、211B、211C、211D)的多极磁场 发生器（110、130、210)，每个子单元具有芯（1134、1138)，所述芯具有顶表面（114八、1148) 和包围所述芯（113A、113B)的线圈（112AU12B)，其中，全部子单元的所述顶表面（114A、 114B)被布置为毗邻所述盒（120、220); -额外的磁场发生器（130)，其被布置为关于所述处理室（121)与所述多极磁场发生器 (130)相对； -控制单元（140)，通过所述控制单元，个体驱动电流能够被供应到所述多极磁场发生 器（110、130、210)的所述子单元（111A、111B、111C、111D、211A、211B、211C、211D)和 / 或到 所述额外的磁场发生器（130)。
17. 根据权利要求2或16所述的处理设备（100、200)用于通过激励磁性粒子（M)来混 合介质，用于靶组分（T)与介质的分离，和/或用于分子诊断、生物样品分析、核酸处理、化 学样品分析、食品分析和/或法医分析的用途。
【文档编号】G01N27/74GK104285143SQ201380025340
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年4月23日 优先权日:2012年5月16日
【发明者】M·M·奥夫扬科, P·J·范德扎格, H·M·费特斯马, R·温贝格尔-弗里德尔, T·A·J·勒林, M·J·范策尔斯特 申请人:皇家飞利浦有限公司
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