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专利名称：一种同时检测水中多种微囊藻毒素的方法
技术领域：
本发明属于水环境污染物的检测技术领域。特别涉及一种水体中多种痕量微囊藻毒素的检测方法，具体地说是针对地表水中多种痕量微囊藻毒素的检测方法。
背景技术：
微囊藻毒素(microcystin，MC)是水体富营养化发生后，蓝藻凋亡所产生的毒素， 通过食物链危害人体健康，造成肝损伤。研究结果表明，富营养化水体中MCs的含量甚微， 仅为ng/L或μ g/L级，因此，检测痕量MCs要求分析方法具有较高的灵敏度、准确性和重复性。20世纪80 90年代，我国主要使用酶联免疫吸附(ELISA)法检测富营养化水体中的 MCsjELISA方法具有高效、快速、灵敏度高等特点，但是其抗体通常只是针对某一种MC建立起来的，对其他类型MCs的交叉反应性不高，不能检测MCs的一些异构体。随着色谱技术的发展，可以对不同异构体的MCs进行定量检测，目前通常采用高效液相色谱(HPLC)法检测富营养化水体中痕量MCs。HPLC具有准确、灵敏、重现性好等特点，是WHO、英美等发达国家和我国权威机构推荐的MCs检测方法。 以往的研究，利用HPLC主要分析MC-LR，分析时间一般大于lOmin。然而根据甲基化、羟基化、异构化程度以及可变氨基酸的不同，已经发现了 80种微囊藻毒素的亚型，因此，仅仅检测MC-LR已远远不能满足人们对饮用水安全的要求。鉴于此，需建立一种经济、快速、灵敏、 准确的且能同时分析多种MCs (MC-RR、YR、LR、LA和LY)的分析方法。

发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测水中多种微囊藻毒素的方法，以经济、快速、 灵敏、准确的同时分析多种微囊藻毒素。为实现上述目的，本发明提供的同时检测水样中多种微囊藻毒素的方法，是采用固相萃取-液相色谱对水中多种微囊藻毒素(MC-RR、MC-YR、MC-LR、MC-LA和MC-LY)进行测定，其主要步骤包括1)配制多种微囊藻毒素的标准溶液，采用液相色谱反相萃取柱制备标准曲线；2)将预处理的待测水样采用HLB固相萃取柱进行固相萃取富集，用含有体积浓度 0. 1-0. 15%三氟乙酸的甲醇洗脱，洗脱液在氮气流下吹干，加入甲醇溶解制成待测溶液；3)将步骤2的待测溶液采用液相色谱反相萃取柱进行测定，测定结果与标准曲线比较，得到待测水中各种微囊藻毒素的含量。所述的方法，其中，反相萃取柱为C18柱、C8柱或C2柱。所述的方法，其中，待测水样的预处理是经0.45 μ m的亲水性尼龙微孔滤膜负压抽滤。所述的方法，其中，HLB固相萃取柱预先进行活化，活化的顺序为10mL色谱纯甲醇、15-20mL超纯水，流速为< lmL/min。所述的方法，其中，固相萃取富集的条件为流速2-5mL/min，富集结束后真空抽干lmin，洗脱液流速小于lmL/min。所述的方法，其中，液相色谱测定条件为采用甲醇和体积比0. 01-0. 03%三氟乙酸超纯水为流动相，流速lmL/min，柱温箱30°C;甲醇的体积比0-5min为55%，6-10min为 65%, 10. Omin 为 55%并维持至 12min。本发明采用固相萃取-高效液相色谱法实现对水环境样品中痕量微囊藻毒素的富集和定量测定，操作简单易行，分析快速准确。目前，尚未见有与本发明的检测方法及其效果类似的相关报道。


图1为1 μ g/mL的5种MCs混合标准品溶液的色谱图，出峰顺序为MC-RR 3. 916min；MC-YR :5. 344min；MC-LR :6.917min ；MC-LA :9.733min ；MC-LY :10.316min。
具体实施例方式本发明提供的水体中5种痕量微囊藻毒素(MC-RR、MC-YR、MC-LR、MC-LA和MC-LY) 的检测方法如下1)水样预处理依次利用IOmL色谱纯甲醇、15_20mL超纯水活化Waters公司的HLB (500mg，6cc) 固相萃取柱，控制流速小于lmL/min ；2)浓缩富集利用IOmL含0. 三氟乙酸(体积分数)的纯甲醇洗脱HLB柱，控制流速小于 lmL/min，洗脱液收集于IOmL尖底玻璃离心管中，洗脱液在氮气流下缓慢吹直至近干，加入 ImL甲醇溶解残留物，漩涡混合，待测；3)利用高效液相色谱(HPLC)定量检测5种MCs色谱柱=ZORBAX300SB C18，4. 6mmX 150mmX5 μ m ；梯度洗脱采用甲醇和含0.02%三氟乙酸的超纯水为流动相，甲醇的比例 0-5min维持在55%，6min上升至65%，6_10min维持在65%，10. Omin降回到55%维持至 12min,以上百分比均为体积百分比；4)绘制标准曲线，以外标法进行定量测定5)样品的测定采集待测水样，按步骤1和2对水样进行预处理和浓缩富集，再按步骤3进行液相色谱检测，并与步骤4得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测水样中5种MCs的含量。本发明的有益效果是采用高效液相色谱对5种不同的微囊藻毒素分别进行定量测定，操作简单易行，分析快速准确。环境友好、易于操作的水体中5种痕量微囊藻毒素的检测手段，尤其是提供一种环境友好、易于操作、富集倍数高、重现性好、能够快速同时分析水体中多种微囊藻毒素的方法。以下结合最佳实施例对本发明所述的水环境中5种痕量微囊藻毒素浓度的检测方法予以说明。1)水样的预处理
取2000ml水样，经亲水性尼龙微孔滤膜(Whatman，0. 45 μ m)进行负压抽滤，滤液收集于棕色玻璃瓶中，利用固相萃取装置活化Waters公司的HLB固相萃取柱，活化的顺序为10mL色谱纯甲醇、15-20mL超纯水，流速为< lmL/min。2)浓缩富集采用大体积采样器将水样和固相萃取装置连接，启动真空泵，对滤液进行固相萃取富集，控制流速在2-5mL/min ；富集结束后真空抽干lmin，以去除水分，利用IOml含 0. 三氟乙酸(体积分数)的纯甲醇洗脱HLB柱，控制流速小于lmL/min，洗脱液收集于 IOmL尖底玻璃比色管中，洗脱液在氮气流下缓慢吹直至近干，加入Iml甲醇溶解残留物，漩涡混合，待测。3)高效液相色谱分析5种MCs的浓度高效液相色谱选择的条件高效液相色谱仪包括四元输液泵，自动进样器，美国 Agilent公司，1260型，Agilent色谱管理软件(B. 04. 02版)进行仪器控制、数据处理和定量计算，美国Agilent公司。色谱柱ZORBAX300SB C18 6mmX 150mmX 5 μ m)，Agilent 公司。采用甲醇和 0. 02%三氟乙酸超纯水为流动相，流速为lmL/min，流动相梯度条件详见表1，柱温箱条件为30°C。流动相梯度条件如表1所示。4)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定所述的外标法标准曲线的绘制分别用ImL的纯甲醇溶解100 μ g的MC-RR、YR、 LR、LA、LY,配制成100 μ g/mL的5种MC单标原液，再分别取100 μ L的MC-RR、YR、LR、LA、 LY单标原液，用纯甲醇配制成浓度为10 μ g/mL的混和标准溶液作为储备液，用色谱纯甲醇将混合标准储备液稀释成系列浓度的标准溶液，采用液相色谱进行分析，分别以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得到5条标准曲线，用于测定样品中分析物的量。5)样品及回收率的测定采集待测的水样，按步骤1对水样进行预处理，再按步骤2进行液相色谱检测，并与上述得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测污泥样品中5种MCs的含量。采用同样的水样，按0. 5 μ g/L的量向其加入5种MCs的混合标准溶液，按步骤1 对水样进行预处理，再按步骤2进行液相色谱检测5种MCs的含量，并按照下式进行回收率计算R = C~C° XlOO0Zo(1)
1.0式中R-回收率，% ；C-添加标准溶液水样的5种MCs的含量，μ g/mL ；C0-未添加标准溶液水样5种MCs的含量，μ g/mL。以下列举三个实例对本发明的检测方法进一步说明，但不限制本发明。实施例12000mL北京奥体公园的水样，向其加入100 μ L的1 μ g/L的5种MCs的混合标准溶液，充分摇勻，经亲水性尼龙微孔滤膜(Whatman，0. 45 μ m)进行负压抽滤，滤液经事先用 IOmL色谱纯甲醇、15-20mL超纯水活化的HLB固相萃取柱浓缩富集，控制流速在2 5mL/min0富集结束后真空抽干lmin，10mL含0. 1 %三氟乙酸的纯甲醇洗脱HLB柱，洗脱液收集于IOmL尖底玻璃比色管中，洗脱液在氮气流下缓慢吹直至近干，加入Iml甲醇溶解残留物， 漩涡混合，待测。利用液相色谱测定上述待测样品，结果见表2。实施例22000mL太湖(31° 21' 24.22" N，120° 1' 25. 80〃 E)的水样，经亲水性尼龙微孔滤膜(Whatman，0. 45 μ m)进行负压抽滤，滤液经事先用IOmL色谱纯甲醇、15_20mL超纯水活化的HLB固相萃取柱浓缩富集，控制流速在2 5mL/min。富集结束后真空抽干lmin， IOmL含0. 三氟乙酸的纯甲醇洗脱HLB柱，洗脱液收集于IOmL尖底玻璃比色管中，洗脱液在氮气流下缓慢吹直至近干，加入Iml甲醇溶解残留物，漩涡混合，待测。利用液相色谱测定上述待测样品中5种MCs的浓度。计算结果得到，太湖 (31° 21' 24.22〃 N, 120° 1' 25.80〃 E)水体检出 5 种 MCs 即 RR、YR、LR、LY、LA 情况为0. 1645,0. 0497,0. 8027,0. 1435,0. 2163 μ g/L。实施例32000mL 巢湖(31° 35' 23.53〃 N,117° 47' 57.05" Ε)的水样，经亲水性尼龙微孔滤膜(Whatman，0. 45 μ m)进行负压抽滤，滤液经事先用IOmL色谱纯甲醇、15_20mL超纯水活化的HLB固相萃取柱浓缩富集，控制流速在2 5mL/min。富集结束后真空抽干lmin， IOmL含0. 三氟乙酸的纯甲醇洗脱HLB柱，洗脱液收集于IOmL尖底玻璃比色管中，洗脱液在氮气流下缓慢吹直至近干，加入Iml甲醇溶解残留物，漩涡混合，待测。利用液相色谱测定上述待测样品中5种MCs的浓度。计算结果得到，巢湖水样 (31° 35' 23.53〃 N, 117° 47' 57.05〃 E)检出 5 种 MCs 艮口 RR、YR、LR、LY、LA 情况为 0. 3407,0. 1655、ND (未检出)、0· 1364,0. 0688 μ g/L。表 权利要求
1.一种同时检测水样中多种微囊藻毒素的方法，采用固相萃取-液相色谱对水中多种微囊藻毒素进行测定，其主要步骤包括1)配制多种微囊藻毒素的标准溶液，采用液相色谱反相萃取柱制备标准曲线；2)将预处理的待测水样采用HLB固相萃取柱进行固相萃取富集，用含有体积浓度 0. 1-0. 15%三氟乙酸的甲醇洗脱，洗脱液在氮气流下吹干，加入甲醇溶解制成待测溶液；3)将步骤2的待测溶液采用液相色谱反相萃取柱进行测定，测定结果与标准曲线比较，得到待测水中各种微囊藻毒素的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，多种微囊藻毒素为MC-RR、MC-YR、MC-LR、MC-LA 禾口 MC-LY0
3.根据权利要求1所述的方法，其中，反相萃取柱为C18柱、C8柱或C2柱。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，待测水样的预处理是经0.45 μ m的亲水性尼龙微孔滤膜负压抽滤。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，HLB固相萃取柱预先进行活化，活化的顺序为 IOmL色谱纯甲醇、15-20mL超纯水，流速为< lmL/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，固相萃取富集的条件为流速2-5mL/min，富集结束后真空抽干lmin，洗脱液流速小于lmL/min。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，液相色谱测定条件为采用甲醇和体积比 0. 01-0. 03%三氟乙酸超纯水为流动相，流速lmL/min，柱温箱30°C ；甲醇的体积比0-5min 为 55%，6-10min 为 65%，10. Omin 为 55% 并维持至 12min。
全文摘要
一种同时检测水样中多种微囊藻毒素的方法，采用固相萃取-液相色谱对水中多种微囊藻毒素进行测定，其步骤包括1)配制多种微囊藻毒素的标准溶液，采用液相色谱反相萃取柱制备标准曲线；2)将预处理的待测水样采用HLB固相萃取柱进行固相萃取富集，用含有体积浓度0.1-0.15％三氟乙酸的甲醇洗脱，洗脱液在氮气流下吹干，加入甲醇溶解制成待测溶液；3)将步骤2的待测溶液采用液相色谱反相萃取柱进行测定，测定结果与标准曲线比较，得到待测水中各种微囊藻毒素的含量。本发明的方法水样预处理环境友好、易于操作、富集倍数高，且重现性好、能够快速准确地分析水环境中5种痕量微囊藻毒素的含量。
文档编号G01N30/89GK102435703SQ20111038063
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月25日 优先权日2011年11月25日
发明者任立军, 席北斗, 曹金玲, 毛敬英, 狄一安, 许其功 申请人:中国环境科学研究院