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专利名称：一种高通量、低成本、操作简单的电化学三维微流控纸芯片的制备及在现场检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及低成本、高通量、高灵敏度、高特异性的现场即时检测技术领域，更具体地说是一种以适合于高通量电化学酶分析的微流控纸芯片实验室的构建。
背景技术：
纸是一种非常廉价、丰富的材料，而且试纸条也已经作为一种分析平台(例如免疫层析)被广泛的用于简单的疾病诊断、环境检测等领域，例如早早孕试纸条等。哈弗大学化学院的Whiteside课题组首次提出了纸芯片实验室的新概念，又称之为微流控纸芯片分析器件。微流控纸芯片分析器件是指通过在纸上绘制疏水图案，由于纸的亲水能力很强，因此未绘制疏水图案部分便构成亲水通道/区域，借助纸的毛细驱动力，溶液可在纸通道内定向流动。以此为基础，把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到纸上，形成微流控纸芯片分析器件。该技术在现场疾病诊断、现场食品分析和现场环境监测等领域具有广阔的 应用前景。另一方面，与传统的建立在塑料片、玻璃片或者硅片基底的微流控芯片实验室相比，微流控纸芯片实验室具有成本低、制备方法简单(利用简单的打印技术，且无需无尘室等苛刻条件)、操作简单(无需外加设备，如泵等)、使用后可任意处理等优点。目前，建立在微流控纸芯片分析器件上的分析方法主要是比色法，由于比色法只能给出“是/否”的信号响应，且比色法灵敏度较低，选择性较差，易出现结果假阳性。因此在微流控纸芯片实验室中建立高灵敏度、高选择性的分析方法，实现高灵敏度、高特异性的现场即时分析检测便成为当前该研究领域亟需解决的问题之一。另外，为了更准确的进行疾病早期诊断、疾病筛查与评估以及药物响应，往往需要同时监测样品中多种组分的含量。因此探索建立高通量的微流控纸芯片有助于解决这一问题。

发明内容
本发明要解决的技术问题是在微流控纸芯片上建立具有样品处理简单、检测速度快、成本低、灵敏度高、特异性强等特点的电化学酶分析检测方法。进一步构建高通量集成化三维微流控纸芯片，并用于样品中葡萄糖、胆固醇、尿酸和血红素的同时检测。为了解决上述技术问题，本发明是通过构建一种新型的电化学三维微流控纸芯片来实现的，该电化学三维微流控纸芯片的制备方法为
(I)在计算机上设计电化学三维微流控纸芯片的三个疏水蜡批量打印图案，分别为蜡批量打印图案A (样式如附图1所示)，蜡批量打印图案B (样式如附图2所示)，蜡批量打印图案C (样式如附图3所示)。(2)在计算机上设计与蜡批量打印图案C匹配的阵列工作电极批量印刷图案(样式如附图4所示)。(3)在计算机上设计与蜡批量打印图案B对应的参比电极批量印刷图案(样式如附图5所示)。(4)在计算机上设计与疏水蜡图案B对应的对电极批量印刷图案(样式如附图6所示)。(5)在计算机上设计与蜡批量打印图案C匹配的辣根过氧化物酶批量打印图案(样式同附图4)。(6)在计算机上设计与蜡批量打印图案C匹配的氧化酶批量打印图案(样式分别如附图7、附图8、附图9和附图10所示)，一种氧化酶批量打印图案仅用来打印一种氧化酶。(7)将滤纸剪裁成三张打印机所需的常用A4大小的滤纸。(8)将步骤(7)中的裁好的A4滤纸放置到喷蜡打印机中，将步骤(I)中的设计的三个疏水蜡批量打印图案打印到步骤⑵中的三张A4滤纸上，分别得到滤纸A，滤纸B，滤纸C。(9)将步骤(8)中带有蜡图案的所有A4滤纸放置到平板加热器或烘箱中，在60-150°C摄氏度下加热0. 5-2分钟。使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙(原理如附图U)。(10)采用丝网印刷方法，按照步骤(2)中的阵列工作电极批量印刷图案，将阵列工作电极印刷到步骤(9)中得到的滤纸C上。(11)采用丝网印刷方法，按照步骤(3)中的参比电极批量印刷图案，将参比电极印刷到步骤(9)中得到的滤纸B上。(12)采用丝网印刷方法，按照步骤(4)中的对电极批量印刷图案，将对电极印刷到步骤(11)中得到的滤纸B上。(13)将步骤(10)中制备的滤纸C放入喷墨打印机中。按照步骤(5)中的辣根过氧化物酶批量打印图案，将辣根过氧化物酶墨打印到步骤(10)中滤纸C的无工作电极面上。(14)将步骤(13)中制备的滤纸C放入喷墨打印机中。按照步骤(6)中的氧化酶批量打印图案，依次将四种氧化酶墨分别打印到步骤(13)中滤纸C的无工作电极面上。(15)对步骤(9)中制备的滤纸A、步骤(12)中制备的滤纸B、步骤(14)中制备的滤纸C沿蜡图案外边缘进行裁剪，分别得到滤纸片A (样式如附图12所示)，滤纸片B (样式如附图13所示)，滤纸片C(样式如附图14所示)。(16)取普通双面塑料胶带，将其裁剪成与步骤(15)中滤纸片相同大小的双面胶带片A。然后，在相应位置抠四个孔，孔的大小与滤纸片A中纸通道宽度一致，四个孔分别对应滤纸片A中四个纸通道的末端(样式如附图15所示)。(17)通过步骤(16)中得到的双面胶带片A，将滤纸片A与滤纸片B粘合在一起(堆叠方式如附图16所示)。(18)取普通双面塑料胶带，将其裁剪成与步骤(15)中滤纸片相同大小的双面胶带片B。然后，在相应位置抠十六个孔，孔的大小与滤纸片B中纸通道宽度一致，十六个孔分别对应滤纸片C中十六个电化学检测孔(样式同附图14)。
(19)通过步骤(16)中得到的双面胶带片B，将步骤(17)中得到多层滤纸片与滤纸片C粘合在一起(堆叠方式如附图16所示)。(20)取普通单面塑料胶带，将其裁剪成与步骤(15)中滤纸片相同大小的单面胶带片。然后，在中心位置抠一个孔，孔的大小、位置与滤纸片A中纸通道宽度一致(样式如附图17所示)。(21)将步骤(20)中得到的单面胶带片贴到步骤(19)中多层滤纸片的滤纸片A上，得到的电化学三维微流控纸芯片(堆叠方式如附图16所示)。(22)在计算机上设计电化学三维微流控纸芯片夹的导线雕刻图案(样式如附图18所示)。(23)利用电路板雕刻机，按照步骤(22)中设计的图案，雕刻制备电化学三维微流控纸芯片夹。电化学三维微流控纸芯片夹用于连接电化学三维微流控纸芯片与电化学工作站。所设计的滤纸片A的疏水蜡图案特征如附图12所示，其中黑色部分是疏水区，白色部分是亲水纸通道，通道宽度为1. 0 4. 0 mm ;通道长度为15 mnT60 mm。所设计的滤纸片B的疏水蜡图案特征如附图13所示，其中黑色部分是疏水区，白色部分是亲水纸通道，通道宽度与滤纸片A中的通道宽度相同；通道长度为6 mnT24 _。另夕卜，滤纸片B两端各露出一个电极接头，用于将印刷的参比电极与对电极连接到电化学工作站中。所设计的滤纸片C的疏水蜡图案特征如附图14所示，其中黑色部分是疏水区，白色部分是亲水电化学检测孔，每个孔的直径相同，直径为2. (T8. 0 mm。所设计的双面胶带片A的特征如附图15所示，其中黑色部分表示胶带，白色部分表示抠掉的孔，孔直径与滤纸片A中的通道宽度相同。所设计的双面胶带片B的特征如附图14所示，其中黑色部分表示胶带，白色部分表示抠掉的孔，孔直径与滤纸片B中的通道宽度相同。所设计的单面胶带片的特征如附图17所示，其中黑色部分表示胶带，白色部分表示抠掉的孔，孔直径与滤纸片A中的通道宽度相同。所述的电化学三维微流控纸芯片，其特征是纸芯片总尺寸为25.0 mmX30.0mnTlOO. 0 mmX120. 0 mm。所述的电化学三维微流控纸芯片，其特征是将滤纸片A与滤纸片B通过双面胶带片A粘合时，滤纸片A上的纸通道末端、双面胶带片A上的四个孔和滤纸片B上四个纸通道的交叉点垂直对齐。所述的电化学三维微流控纸芯片，其特征是将滤纸片B与滤纸片C通过双面胶带片B粘合时，滤纸片B上的所有纸通道末端、双面胶带片B上的所有孔和滤纸片C上所有电化学检测孔垂直对齐。所述的电化学三维微流控纸芯片，其特征是将单面胶带贴到滤纸片A上时，单面胶带片上的孔与滤纸片A上纸通道的交叉点垂直对齐。所采用的滤纸为常用的滤纸或吸水纸。所采用的塑料胶带均为常用的塑料胶带。所述的滤纸片C上的丝网印刷阵列工作电极，其特征是所采用的印刷油墨为常用的碳墨(浆)。每个工作电极位置与尺寸与滤纸片C上的电化学检测孔一致(样式如附图4所示)。所述的丝网印刷参比电极，其特征是所采用的印刷油墨为常用的银/氯化银混合墨。丝网印刷参比电极接通所有滤纸片B上的纸通道(样式如附图5和附图16所示)。所述的丝网印刷对电极，其特征是所采用的印刷油墨为常用的碳墨(浆)。丝网印刷对电极接通所有滤纸片B上的纸通道(样式如附图6和附图16所示)。所采用的喷蜡打印机为常用的富士施乐喷蜡打印机。步骤(13)中所述的辣根过氧化物酶墨为辣根过氧化物酶修饰的贵金属纳米粒子溶液。所采用的贵金属纳米粒子为常见贵金属纳米粒子，可为金纳米粒子、银纳米粒子。步骤(14)中所述的氧化酶墨为氧化酶修饰的贵金属纳米粒子溶液，所采用的氧化酶分别为葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、尿酸氧化酶和血红素氧化酶。所采用的贵金属纳米粒子为常见贵金属纳米粒子，可为金纳米粒子、银纳米粒子。步骤(6)中所述的氧化酶批量打印图案，其特征是附图7是葡萄糖氧化酶的批量打印图案；附图8是胆固醇氧化酶的批量打印图案；附图9是尿酸氧化酶的批量打印图案；附图10是血红素氧化酶的批量打印图案。所述电化学三维微流控纸芯片夹，其特征是电化学三维微流控纸芯片夹由两块电路板组成(样式如附图18所示，电路板A，电路板B)，电路板A的尺寸与电化学三维微流控纸芯片尺寸相同。电路板A上所有导电铜层被去除，且在其中心位置抠一个进样孔，大小、位置与单面胶带片上的进样孔一致。用电路板雕刻机，按照步骤(22)中设计的图案，对电路板B进行雕刻处理。电路板B上的铜导线雕刻图特征如附图18所示，包括十六个接触圆与十六根导线。十六个接触圆的大小、位置与滤纸片C上的阵列工作电极一直。十六根导线末端排列为十六铜手指，电路板B在十六铜手指一端比电路板A长出5 mm,以便插入十六铜手指插槽。利用上述制备的电化学三维微流控纸芯片实现多组分的现场同时检测的步骤为
(I)将电化学三维微流控纸芯片中滤纸片B的参比电极接头与便携式电化学工作站的参比电极导线相连；将电化学三维微流控纸芯片中滤纸片B的对电极接头与便携式电化学工作站的对电极导线相连(连接方式如附图19所示)。(2)将电化学三维微流控纸芯片用电化学三维微流控纸芯片夹夹住，将电路板B上的十六铜手指插入十六铜手指插槽中，该插槽通过多路复用器与便携式电化学工作站的工作电极导线相连(连接方式如附图19所示)。(3)将稀释后的样品溶液连续滴加到电化学三维微流控纸芯片的进样孔内。连续滴加5 10次后，打开电化学工作站，开始依次检测16个电化学检测孔中的与被测物含量相关的电流强度，得到反映电流强弱的形貌图。本发明中，样品溶液首先通过单面胶带片上的进样孔，进入滤纸片A上的纸通道，在毛细作用力的驱动下，经滤纸片A四通道分流；然后通过双面胶带片A上的四个孔，进入滤纸片B上的四个分流通道；在毛细作用力的驱动下，样品溶液继续被滤纸片B分流成16路。最终通过双面胶带片B上的16个孔进入滤纸片C上的16个电化学检测孔，然后完成电化学检测。
本发明的有益效果1.在微流控纸芯片实验室中引入了高灵敏度、高特异性的电化学酶分析检测方法，拓展了微流控纸芯片实验室的检测范围，提高了微流控纸芯片实验室的检测灵敏度与准确度。2.采用全印刷的制备模式，简化了电化学三维微流控纸芯片的制备步骤，降低了制备成本，提高了微流控纸芯片的制备与检测的可重复性。3.采用三维堆叠分流模式，可实现在微流控纸芯片实验室上的大规模检测单元集成，提高微流控纸芯片实验室的检测通量和检测能力。4.所采用的打印图案都可进行集成打印，实现每个页面上打印多个图案用于同时制备多个电化学三维微流控纸芯片。5.氧化酶打印墨中含有贵金属纳米粒子，借助贵金属纳米粒子的催化作用，可提高酶识别催化能力与效率，进一步提高该电化学三维微流控纸芯片的电化学检测灵敏度。6.由于滤纸的多孔性质，因此滤纸片A与滤纸片B中的纸通道还具有纸层析分离的功能，将大颗粒杂质过滤掉。联合氧化酶与辣根过氧化物酶分子的双重特异性识别催化能力，该电化学三维微流控纸芯片可实现无前处理的直接样品加入检测，简化了检测步骤，节省了样品前处理成本。7.电化学三维微流控纸芯片夹可以重复使用，降低了使用成本。


图1.为电化学三维微流控纸芯片中滤纸片A的疏水蜡批量打印图案。图2.为电化学三维微流控纸芯片中滤纸片B的疏水蜡批量打印图案。图3为电化学三维微流控纸芯片中滤纸片C的疏水蜡批量打印图案。图4为滤纸片C上阵列工作电极的丝网批量印刷图案，亦为滤纸片C上辣根过氧化物酶的批量打印图案。图5为滤纸片B上参比电极的批量丝网印刷图案。图6为滤纸片B上对电极的批量丝网印刷图案。图7为滤纸片C上葡萄糖氧化酶的批量打印图案。图8为滤纸片C上胆固醇氧化酶的批量打印图案。图9为滤纸片C上尿酸氧化酶的批量打印图案。图10为滤纸片C上血红素氧化酶的批量打印图案。图11为喷蜡打印构建亲水通道的原理示意图，A图是空白滤纸的示意图；B图是在滤纸上打印蜡图案的示意图，其中a是打印的蜡层；C图是在烘箱或平板加热设备中加热后，蜡图案融化并浸透整个滤纸的厚度，形成疏水墙。图12为滤纸片A疏水图案示意图，其中白色部分为纸通道，黑色部分为蜡。图13为滤纸片B疏水图案示意图，其中白色部分为纸通道，黑色部分为蜡。两端凸出部分分别用作参比电极与对电极的电极接头。图14为滤纸片C疏水图案示意图，其中白色部分为纸通道，黑色部分为蜡。其中①是葡萄糖检测孔；②是胆固醇检测孔是尿酸检测孔；④血红素检测孔。该图亦为双面胶带片B示意图，黑色部分为胶带，白色部分为抠掉的孔。
图15为双面胶带片A示意图，黑色部分为胶带，白色部分为抠掉的孔。图16为电化学三维微流控纸芯片堆叠过程示意图。图17为单面胶带片示意图，黑色部分为胶带，白色部分为抠掉的进样孔。图18为电化学三维微流控纸芯片夹示意图，黑色部分为雕刻去掉导电铜层的电路板；白色部分为抠掉的进样孔；灰色部分为导电铜层。图19为电化学三维微流控纸芯片与电化学工作站连接方法的俯视示意图。其中①是电化学工作站是多路复用器；③十六铜手指插槽电化学三维微流控纸芯片夹上的十六铜手指电化学三维微流控纸芯片中滤纸片B上的参比电极接头；⑥电化学三维微流控纸芯片中滤纸片B上的对电极接头；⑦连接参比电极接头的导线；⑧连接对电极接头的导线；⑨纸芯片夹夹住的电化学三维微流控纸芯片。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。实施例1人血液中葡萄糖、胆固醇、尿酸和血红素的现场快速同时检测。(I)在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计电化学三维微流控纸芯片的三个疏水蜡批量打印图案，分别为蜡批量打印图案A (样式如附图1所示)，蜡批量打印图案B (样式如附图2所示)，蜡批量打印图案C (样式如附图3所示)。蜡图案A上的纸通道宽度为2 mm，长度为30 mm。蜡图案B上的纸通道宽度为2 mm，长度为12 mm。蜡图案C上的电化学检测孔直径为4 mm。(2)在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计与腊批量打印图案C匹配的阵列工作电极批量印刷图案(样式如附图4所示)，每个工作电极直径为4 mm。(3)在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计与蜡批量打印图案B对应的参比电极批量丝网印刷图案(样式如附图5所示)。(4)在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计与疏水腊图案B对应的对电极批量丝网印刷图案(样式如附图6所示)。(5)在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计与腊图案C匹配的辣根过氧化物酶批量打印图案(样式如附图4所示)。(6)在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计与腊图案C匹配的氧化酶批量打印图案(葡萄糖氧化酶批量打印图案样式如附图7所示、胆固醇糖氧化酶批量打印图案样式如附图8所示、尿酸氧化酶批量打印图案样式如附图9所示、血红素氧化酶批量打印图案样式如附图10所示)，
(7)将普通定性滤纸剪裁成三张A4大小的滤纸。(8)将步骤(7)中的裁好的滤纸放置到喷蜡打印机中，将步骤(I)中的设计的三个疏水蜡批量打印图案打印到步骤(7)中的三张滤纸上，分别得到滤纸A、滤纸B、滤纸C。(9)将步骤(8)中滤纸A、滤纸B、滤纸C放置到平板加热器或烘箱中，在100°C摄氏度下加热I分钟。(10)采用丝网印刷方法并使用碳墨，按照步骤(2)中的阵列工作电极批量丝网印刷图案，将阵列工作电极印刷到步骤(9)中得到的滤纸C上。(11)采用丝网印刷方法并使用银/氯化银墨，按照步骤(3)中的参比电极批量丝网印刷图案，将参比电极印刷到步骤(9)中得到的滤纸B上。(12)采用丝网印刷方法并使用碳墨，按照步骤(4)中的对电极批量印丝网刷图案，将对电极印刷到步骤(11)中得到的滤纸B上。(13)制备氧化酶打印墨取0. 5毫升链霉亲和素溶液(1. 0毫克每毫升)，加入到20. 0毫升金纳米粒子溶液中(金纳米粒子直径为12. 0 nm)，室温下搅拌0. 5小时。然后加A 0. 5毫升质量分数为百分之五的牛血清白蛋白溶液，室温下搅拌5分钟。然后将上述反应溶液在12500转每分钟的转速下离心分离20分钟。将得到的沉淀分散到生物素化的辣根过氧化物酶/葡萄糖氧化酶/胆固醇氧化酶/尿酸氧化酶/血红素氧化酶溶液中，在37摄氏度下搅拌I小时。将上述反应溶液在12500转每分钟的转速下离心分离10分钟。将
得到的沉淀分散到Tris-HCl缓冲溶液中(pH=8. 0，0. 05摩尔每升)，制备得到氧化酶打印
m
O(14)将步骤(10)中制备的滤纸C放入安装有辣根过氧化物酶墨盒的喷墨打印机中。按照步骤(5)中的辣根过氧化物酶批量打印图案，将辣根过氧化物酶墨打印到步骤
(10)中滤纸C的无工作电极面上。(15)将步骤(14)中制备的滤纸C放入安装有四个氧化酶墨盒的喷墨打印机中。按照步骤(6)中的氧化酶批量打印图案，依次将四种氧化酶墨打印到步骤(14)中滤纸C的无工作电极面上。(16)用剪刀 沿步骤(9)中制备的滤纸A、步骤(12)中制备的滤纸B、步骤(15)中制备的滤纸C蜡图案外边缘进行裁剪，分别得到滤纸片A (样式如附图12所示)，滤纸片B (样式如附图13所示)，滤纸片C(样式如附图14所示)。(17)取普通双面塑料胶带，将其用剪刀裁剪成与步骤(16)中滤纸片相同大小的双面胶带片A。然后，在相应位置抠四个孔，孔的大小与滤纸片A中纸通道宽度一致，四个孔分别对应滤纸片A中四个纸通道的末端(样式如附图15所示)。(18)通过步骤(17)中得到的双面胶带片A，将滤纸片A与滤纸片B粘合在一起(堆叠方式如附图16所示)。(19)取普通双面塑料胶带，将其用剪刀裁剪成与步骤(16)中滤纸片相同大小的双面胶带片B。然后，在相应位置抠十六个孔，孔的大小、位置与滤纸片C中亲水孔一致，十六个孔分别对应滤纸片C中十六个电化学检测孔(样式同附图14)。(20)通过步骤(16)中得到的双面胶带片B，将步骤(18)中得到多层滤纸片与滤纸片C粘合在一起(堆叠方式如附图16所示)。(21)取普通单面塑料胶带，将其裁剪成与步骤(16)中滤纸片相同大小的单面胶带片。然后，在中心位置抠一个孔，孔的大小与滤纸片A中纸通道宽度一致(样式如附图17所示)。(22)将步骤(21)中得到的单面胶带片贴到步骤(20)中多层滤纸片的滤纸片A上，得到的电化学三维微流控纸芯片(堆叠方式如附图16所示)。(23)在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计电化学三维微流控纸芯片夹的导线雕刻图案(样式如附图18所示)。(24)利用电路板雕刻机，按照步骤(23)中设计的图案，雕刻制备电化学三维微流控纸芯片夹。
用三高病人的血样作为分析样品，血样中含有葡萄糖、胆固醇、尿酸和血红素。利用上述制备的电化学三维微流控纸芯片实现多组分的现场同时检测
(25)将电化学三维微流控纸芯片中滤纸片B的参比电极接头与便携式电化学工作站的参比电极导线相连；将电化学三维微流控纸芯片中滤纸片B的对电极接头与便携式电化学工作站的对电极导线相连(如附图19所示)。(26)将电化学三维微流控纸芯片用电化学三维微流控纸芯片夹夹住，将电路板B上的十六铜手指插入十六铜手指插槽中，该插槽通过多路复用器与便携式电化学工作站的工作电极导线相连(连接方式如附图19所示)。(27)取病人血样0. 5毫升，加入到5毫升Tris-HCl缓冲溶液中(pH=8. 0, 0. 05摩尔每升)进行稀释。将稀释后的样品溶液，用普通塑料滴管连续滴加到电化学三维微流控纸芯片的进样孔内。连续滴加10次后，打开电化学工作站，开始依次检测16个检测孔中的与被测物含量先关的电流强度，得到反映电流强弱的形貌图。实施例2人尿液中的葡萄糖、多酚、黄嘌呤、胆固醇、尿酸和血红素的现场快速同时检测。将实施例1 步骤(I) (2) (3) (4) (5) (6) (23)中的“利用 Adobe IllustratorCS4软件设计”改为“利用Photoshop CS4软件设计”；将实施例1中的“普通定性滤纸”改为“普通定量滤纸”;将实施例1步骤(9)中的“在100°C摄氏度下加热I分钟”改为“在150摄氏度下加热30秒”;将实施例1步骤13)中的“金纳米粒子溶液中”改为“银纳米粒子溶液”;将实施例1中的“三高病人血样”改为“三高病人尿样”;将实施例1步骤(27)改为“取病人尿样5毫升，用普通塑料滴管连续滴加到电化学三维微流控纸芯片的进样孔内。连续滴加10次后，打开电化学工作站，开始依次检测16个检测孔中的与被测物含量先关的电流强度，得到反映电流强弱的形貌图。”。
权利要求
1.一种操作简单、低成本、多通道的电化学三维微流控纸芯片的制备方法，其特征是包括以下步骤在计算机上设计电化学三维微流控纸芯片的三个疏水蜡批量打印图案，分别为蜡批量打印图案A，蜡批量打印图案B，蜡批量打印图案C ;在计算机上设计与蜡批量打印图案C匹配的阵列工作电极批量印刷图案；在计算机上设计与蜡批量打印图案B对应的参比电极批量印刷图案；在计算机上设计与疏水蜡图案B对应的对电极批量印刷图案；在计算机上设计与蜡批量打印图案C匹配的辣根过氧化物酶批量打印图案；在计算机上设计与蜡批量打印图案C匹配的氧化酶批量打印图案，一种氧化酶批量打印图案仅用来打印一种氧化酶；将滤纸剪裁成三张打印机所需的常用A4大小的滤纸；将步骤(1.7)中的裁好的A4滤纸放置到喷蜡打印机中，将步骤(I)中的设计的三个疏水蜡批量打印图案打印到步骤(1.7)中的三张A4滤纸上，分别得到滤纸A，滤纸B，滤纸C ;将步骤(1. 8)中带有蜡图案的所有A4滤纸放置到平板加热器或烘箱中，在60-150°C摄氏度下加热O. 5-2分钟；采用丝网印刷方法，按照步骤(1.2)中的阵列工作电极批量印刷图案，将阵列工作电极印刷到步骤(1. 9)中得到的滤纸C上；采用丝网印刷方法，按照步骤(1.3)中的参比电极批量印刷图案，将参比电极印刷到步骤(1.9)中得到的滤纸B上；采用丝网印刷方法，按照步骤(1.4)中的对电极批量印刷图案，将对电极印刷到步骤 (1. 11)中得到的滤纸B上；将步骤(10)中制备的滤纸C放入喷墨打印机中，按照步骤(5)中的辣根过氧化物酶批量打印图案，将辣根过氧化物酶墨打印到步骤(10)中滤纸C的无工作电极面上；将步骤(13)中制备的滤纸C放入喷墨打印机中，按照步骤(6)中的氧化酶批量打印图案，依次将四种氧化酶墨分别打印到步骤(13)中滤纸C的无工作电极面上；对步骤(1.9)中制备的滤纸A、步骤(1. 12)中制备的滤纸B、步骤(1. 14)中制备的滤纸C沿蜡图案外边缘进行裁剪，分别得到滤纸片A，滤纸片B，滤纸片C ；取普通双面塑料胶带，将其裁剪成与步骤(1.15)中滤纸片相同大小的双面胶带片A， 然后，在相应位置抠四个孔，孔的大小与滤纸片A中纸通道宽度一致，四个孔分别对应滤纸片A中四个纸通道的末端；通过步骤(1. 16)中得到的双面胶带片A，将滤纸片A与滤纸片B粘合在一起；取普通双面塑料胶带，将其裁剪成与步骤(1.15)中滤纸片相同大小的双面胶带片B， 然后，在相应位置抠十六个孔，孔的大小与滤纸片B中纸通道宽度一致，十六个孔分别对应滤纸片C中十六个电化学检测孔；通过步骤(1. 16)中得到的双面胶带片B，将步骤(1. 17)中得到多层滤纸片与滤纸片C 粘合在一起；取普通单面塑料胶带，将其裁剪成与步骤(1.15)中滤纸片相同大小的单面胶带片，然后，在中心位置抠一个孔，孔的大小、位置与滤纸片A中纸通道宽度一致；将步骤(1.20)中得到的单面胶带片贴到步骤(1. 19)中多层滤纸片的滤纸片A上，得到的电化学三维微流控纸芯片；在计算机上设计电化学三维微流控纸芯片夹的导线雕刻图案；利用电路板雕刻机，按照步骤(1.22)中设计的图案，雕刻制备电化学三维微流控纸芯片夹，电化学三维微流控纸芯片夹用于连接电化学三维微流控纸芯片与电化学工作站。
2.本发明所述电化学三维微流控纸芯片的现场即时检测包括以下步骤将电化学三维微流控纸芯片中滤纸片B的参比电极接头与便携式电化学工作站的参比电极导线相连，将电化学三维微流控纸芯片中滤纸片B的对电极接头与便携式电化学工作站的对电极导线相连；将电化学三维微流控纸芯片用电化学三维微流控纸芯片夹夹住，将电路板B上的十六铜手指插入十六铜手指插槽中，该插槽通过多路复用器与便携式电化学工作站的工作电极导线相连；将稀释后的样品溶液连续滴加到电化学三维微流控纸芯片的进样孔内，连续滴加5 10 次后，打开电化学工作站，开始依次检测16个电化学检测孔中的与被测物含量相关的电流强度，得到反映电流强弱的形貌图。
3.根据权利要求1所设计的滤纸片A的疏水蜡图案，其特征是，蜡图案构成两个交叉的纸通道，纸通道宽度为1. O 4. O mm,通道长度为15 mm^60 mm。
4.根据权利要求1所设计的滤纸片B的疏水蜡图案，其特征是，蜡图案构成16个纸通道，两两相交，纸通道宽度与滤纸片A中的通道宽度相同，通道长度为6 mnT24 _，另外， 滤纸片B两端各露出一个电极接头，用于将印刷的参比电极与对电极连接到电化学工作站中。
5.根据权利要求1所设计的滤纸片C的疏水蜡图案，其特征是，每个孔的直径相同，直径为2. 0 8. O mm。
6.根据权利要求1所设计的双面胶带片A，其特征是，孔直径与滤纸片A中的通道宽度相同。
7.根据权利要求1所设计的双面胶带片B，其特征是，孔直径与滤纸片B中的通道宽度相同。
8.根据权利要求1所设计的单面胶带片，其特征是，孔直径与滤纸片A中的通道宽度相同。
9.根据权利要求1所述的电化学三维微流控纸芯片，其特征是纸芯片总尺寸为25.O mmX 30. O mnTlOO. O mmX 120. O mm。
10.根据权利要求1所述的电化学三维微流控纸芯片，其特征是，将滤纸片A与滤纸片 B通过双面胶带片A粘合时，滤纸片A上的纸通道末端、双面胶带片A上的四个孔和滤纸片 B上四个纸通道的交叉点垂直对齐。
11.根据权利要求1所述的电化学三维微流控纸芯片，其特征是，将滤纸片B与滤纸片 C通过双面胶带片B粘合时，滤纸片B上的所有纸通道末端、双面胶带片B上的所有孔和滤纸片C上所有电化学检测孔垂直对齐。
12.根据权利要求1所述的电化学三维微流控纸芯片，其特征是，将单面胶带贴到滤纸片A上时，单面胶带片上的孔与滤纸片A上纸通道的交叉点垂直对齐。
13.根据权利要求1所采用的滤纸为常用的滤纸或吸水纸。
14.根据权利要求1所采用的塑料胶带均为常用的塑料胶带。
15.根据权利要求1所述的滤纸片C上的丝网印刷阵列工作电极，其特征是，所采用的印刷油墨为常用的碳墨(浆)，每个工作电极位置与尺寸与滤纸片C上的电化学检测孔一致。
16.根据权利要求1所述的丝网印刷参比电极，其特征是，所采用的印刷油墨为常用的银/氯化银混合墨，丝网印刷参比电极接通所有滤纸片B上的纸通道。
17.根据权利要求1所述的丝网印刷对电极，其特征是，所采用的印刷油墨为常用的碳墨(浆)，丝网印刷对电极接通所有滤纸片B上的纸通道。
18.根据权利要求1步骤(1.13)中所述的辣根过氧化物酶墨，其特征是，辣根过氧化物酶墨为辣根过氧化物酶修饰的贵金属纳米粒子溶液，所采用的贵金属纳米粒子为常见贵金属纳米粒子，可为金纳米粒子、银纳米粒子。
19.根据权利要求1步骤(1.14)中所述的氧化酶墨，其特征是，氧化酶墨为氧化酶修饰的贵金属纳米粒子溶液，所采用的氧化酶分别为葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、尿酸氧化酶和血红素氧化酶；所采用的贵金属纳米粒子为常见贵金属纳米粒子，可为金纳米粒子、 银纳米粒子。
20.根据权利要求1所述电化学三维微流控纸芯片夹，其特征是，电化学三维微流控纸芯片夹由两块电路板组成(电路板A，电路板B)，电路板A的尺寸与电化学三维微流控纸芯片尺寸相同；电路板A上所有导电铜层被去除，且在其中心位置抠一个进样孔，大小、位置与单面胶带片上的进样孔一致；用电路板雕刻机，按照步骤(1.22)中设计的图案，对电路板B进行雕刻处理；电路板B上的铜导线雕刻图特征是，包括十六个接触圆与十六根导线；十六个接触圆的大小、位置与滤纸片C上的阵列工作电极一致；十六根导线末端排列为十六铜手指，电路板B在十六铜手指一端比电路板A长出5 mm,以便插入十六铜手指插槽。
全文摘要
本发明公开了一种操作简单、低成本、多通道的电化学三维微流控纸芯片的制备及其现场检测的方法。本发明采用全打印级粘合堆叠模式，分贝在三张A4大小的普通滤纸上，批量打印出疏水蜡图案。制备过程还包括以下步骤批量打印疏水蜡图案；熔蜡成型；在滤纸上批量丝网印刷阵列工作电极、参比电极与对电极；在滤纸的无工作电极面上依次批量打印辣根过氧化物酶和氧化酶；电化学三维微流控纸芯片裁剪；制备双面胶带片；将滤纸片通过双面胶带片粘合在一起；制备电化学三维微流控纸芯片夹。一种电化学三维微流控纸芯片的现场检测的方法，包括如下步骤用电化学三维微流控纸芯片夹将纸芯片夹住；然后插入十六铜手指插槽；通过多路复用器连接电化学工作站。
文档编号G01N27/30GK103041876SQ20121057782
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者于京华, 葛磊, 王盼盼, 颜梅, 葛慎光, 张彦, 楚成超, 李伟平, 苏敏, 王衍虎, 臧德进, 闫纪宪, 王少伟, 王寿梅, 张萌 申请人:济南大学