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专利名称：基于能斯特电势荧光染料的细胞钾电极特性的检测方法
技术领域：
本发明属于生物领域，特别涉及基于能斯特电势荧光染料的细胞钾电极特性评价值的检测方法。
背景技术：
细胞的电生物物理特性或电生理特性是细胞离子通道表达及功能分化或功能成熟的直接表现，也是一些细胞尤其是可兴奋细胞功能评价的重要指标。尽管细胞电生物物理特性或电生理特性评价最常用和经典的方法仍然是膜片钳为代表的玻璃微电极技术，这一手段的侵入性以及在某些条件下(如活组织及材料三维结构内部)应用的局限性使得人们逐渐采用更加实用的非侵入性研究或评价方法。电势荧光染料技术是近二十余年发展起来的评价细胞电生物物理特性的非侵入性检测手段。它依靠电势敏感荧光染料及显微荧光技术来评价细胞的电生物物理特性或电生理特性进而了解细胞的功能特性。尽管当今电势荧光染料技术的发展已经使得该技术可以被用于可兴奋细胞动作电位的显示与研究，细胞静息电位的评价与研究仍然是电势荧光染料技术最为常见的用途。细胞静息电位的评价对于成熟前的可兴奋细胞(不具备动作电位特征)及非兴奋细胞的研究及功能评价具有极其重要的意义。这里的一个典型的应用实例是在神经干细胞以及以神经干细胞为基础的组织工程植入体的应用研究。神经干细胞以其可自我更新及多分化潜能在神经组织修复、退行性疾病治疗和神经组织工程研究等方面有着巨大的应用潜能。神经干细胞的一个重要功能是分化为神经元并修复神经组织的缺损或病变。成熟神经元的主要功能是接收、处理和传递电化学信号。在这一过程中，膜上离子通道的表达及功能成熟是神经细胞完成其功能的基础。在神经干细胞没有分化或分化的早期，离子通道尤其是电压依赖性离子通道稀少且细胞不能产生稳定的动作电位时，细胞膜静息电位是神经干细胞所能检测到的最重要的电生物物理特性。因此，研究细胞静息电位建立成为了解神经干细胞离子通道功能表达情况的重要途径。为实现以细胞静息膜电位了解细胞离子通道功能表达情况，一个核心的问题是细胞静息膜电位的高内含解析。细胞电极特性是与细胞静息膜电位对细胞外离子浓度依赖关系相关的重要细胞电生物物理特性功能参数。其中最重要的是细胞钾电极特性(细胞静息电位变化对细胞外 K+浓度的依赖性)。细胞静息电位的建立涉及钾通道电流、钠通道电流以及少量其他通道电流。从这一角度看，细胞电极特性可以理解为与静息膜电位建立中各通道电流相对贡献有关的物理量。理论上，如果细胞的静息膜电位完全由钾通道电流参与建立，细胞的静息膜电位与胞外钾离子浓度的依赖关系将完全符合Nernst方程的定量关系，细胞膜的钠/钾通透性比值将为零。容易理解，在神经干细胞分化的不同时期，随着细胞离子通道表达谱的改变，神经干细胞应该具有不同的细胞钾电极特性或钠/钾通透性比值。采用膜片钳的研究表明，在神经干细胞分化前及分化初期，当细胞钾通道电流密度表达增加成为优势通道电流而又同时缺少钠通道电流、钙通道电流时，可以发现细胞静息电位变化对细胞外K+的依
4赖性接近Nernst方程的描述，即Nernst (能斯特)钾电极特性，推测这一现象可能与神经干细胞存在的延迟整流性钾电流以及大量的主要由钾离子介导的被动电流有关。随着神经干细胞的进一步分化和钠通道和钙通道等电流的表达和增加，细胞静息膜电位值可能明显偏离钾平衡电位或Nernst钾电极特性，同时，细胞膜的钠/钾通透性比值可能会明显地增加。因此考察细胞的钾电极特性可以作为神经干细胞功能分化程度的一个重要客观指标。应用膜片钳技术评价细胞钾电极特性的局限性是①膜片钳技术操作精细，仪器昂贵，技术要求高，不便于普通研究与开发机构推广；②检测通量低，每次只能测定一个细胞。同时，细胞取样的随机性及取样不足可能给结果的解释带来困难；③是一种侵入性测量手段，测量对细胞的侵入或封接不可避免地会引起细胞功能特性的改变；④操作过程往往需要细胞脱离原来生长环境进行检测，难于在原位或in situ实现对细胞钾电极特性或其他电生物物理特性的评价；⑤难于在活组织或材料三维结构条件下应用。与之相对应的是， 电势荧光染料技术的特点是①技术要求低，易于广泛推广和使用；②检测通量高，一次能测定一个视野内的所有细胞；③是一种非侵入性测量手段；④操作过程细胞不需要脱离原来生长环境进行检测，可在原位或in situ实现对细胞钾电极特性或其他电生物物理特性的评价；⑤结合激光共聚焦显微技术，可以直接在活组织或材料三维结构条件下应用。能斯特电势荧光染料是一类根据细胞膜电位在细胞内外分布呈Nernst平衡的电势敏感荧光染料。它可以依据染料在细胞内外的分布浓度比值或荧光强度比值来评价细胞的静息膜电位及变化。然而，由于染料带有电荷，在跨膜平衡分布的同时会不可避免地与细胞膜或细胞内的生物大分子相结合，即非电势依赖性结合。非电势依赖性结合是影响以能斯特染料确定细胞静息电位数值的主要干扰因素。在进行细胞静息膜电位的有关比较研究时，非电势依赖性结合是这一方法系统误差的组成部分。显然，忽略非电势依赖性结合并不会影响有关比较研究的结论。另一种权宜的校正非电势依赖性结合的方法是，以高钾离子浓度的溶液(通常130mM)刺激细胞，在这一“零电位”状态标定细胞的非电势依赖性染料结合量。很显然，这一标定方法在很大程度上取决于“零电位”状态的实际电位值。上述标定方法显然不适用于在评价细胞钾电极特性、需要更准确了解细胞静息膜电位与细胞外钾离子浓度依赖关系时非电势依赖性染料结合的标定。

发明内容
本发明的目的在于提供基于能斯特电势荧光染料的细胞钾电极特性评价值的检测方法，该方法准确性高，操作简单。为实现上述目的，本发明的技术方案为1、基于能斯特电势荧光染料的细胞钾电极特性的检测方法，具体包括以下步骤A建立具有能斯特钾电极特性的细胞用钾离子载体对细胞进行处理，得具有能斯特钾电极特性的细胞；B对细胞内平均钾离子浓度与染料非电势依赖性结合系数的比值的计算将步骤A所述具有能斯特钾电极特性的细胞浸浴在设定的梯度钾离子浓度，即 [K+]。的溶液中，用能斯特电势荧光染料染色并平衡，用荧光显微技术对染色平衡后的细胞在同一参数条件下拍照、图像分析，求得细胞内外荧光强度比值[F]i/[F]。，将已知的各组
5[K+]。和[F] J [F]。值代入公式
权利要求
1.基于能斯特电势荧光染料的细胞钾电极特性的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤A建立具有能斯特钾电极特性的细胞用钾离子载体对细胞进行处理，得具有能斯特钾电极特性的细胞； B对细胞内平均钾离子浓度与染料非电势依赖性结合系数的比值的计算将步骤A所述具有能斯特钾电极特性的细胞浸浴在设定的梯度钾离子浓度，即[K+]。的溶液中，用能斯特电势荧光染料染色并平衡，用荧光显微技术对染色平衡后的细胞在同一参数条件下拍照、图像分析，求得细胞内外荧光强度比值[F]i/[F]。，将已知的各组[K+]。和[F] 乂 [F]。值代入公式= fff中，进行线性拟合，求得具有能斯特钾电极特性的J Yk J0 L^J0细胞胞内平均钾离子浓度与染料非电势依赖性结合系数的比值，即[K+]i/f ； C胞内钠离子的检测用钠离子载体对细胞通透使细胞内外的钠离子平衡，让细胞浸浴在预先设定的梯度钠离子浓度[Na+]。的缓冲液中，对细胞加载Na+荧光染料并平衡，拍照，对图像进行分析，得到不同的[Na+]。浓度所对应的荧光强度读数，以细胞内钠离子的荧光强度对设定浓度作图，对其进行线性拟合求得标准曲线方程；在相同的条件下，另取未使用用钠离子载体处理的细胞使用相同浓度的Na+荧光染料染色，拍照，对图像进行分析，得出对应的荧光强度读数，以胞内钠离子荧光强度代入上述标准曲线方程，可以直接计算胞内钠离子浓度；D非电势依赖性染料结合系数的标定及待测细胞钾电极特性评价值的获得将待测钾电极特性的细胞浸浴在设定的梯度钾离子浓度的溶液中，该溶液是以不同浓度钾离子依次置换钠离子的等渗盐溶液，其中钾离子浓度与钠离子浓度之和为依据等渗条件设定的常量；用能斯特电势荧光染料分别染色并平衡，用荧光显微技术对染色平衡后的细胞在同一参数条件下拍照、图像分析，求得细胞内外荧光强度比值[F] 乂 [F]。；将上述所得各浓度梯度下对应的[F]i/[F]。比值、步骤B所得[K+]i/f值以及步骤C所得的[Na+几值[Fl [K+ \lf + [Na+1 .PNalK // 代入公式H = Lr'+1 ΓΛΓ + 中，取得的数据采用非线性迭代拟合法 [Fl [Κ+]ο+ΡΝα/κ[Να+]ο求出染料非电势依赖性结合系数f、胞内钾离子浓度DOi和细胞表观钠/钾通透性比值1^值;所述步骤B和步骤C的进行无时间上的先后区分，[F]” [F]。分别为胞内、外荧光强度， [K+]。为胞外钾离子浓度，[K+Ji为胞内钾离子浓度，f为非电势依赖性染料结合系数，[Na+J0 为胞外钠离子浓度，[Na+]i为胞内钠离子浓度。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤A中，钾离子载体为缬氨霉素。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤B中，能斯特电势荧光染料为四甲基罗丹明甲酯染料或其它依据能斯特平衡原理进行细胞膜电位测量的电势荧光染料。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤B中，细胞浸浴的梯度钾离子浓度溶液为无钠离子的盐溶液，钾离子浓度梯度由有机阳离子置换钾离子获得。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤B中，根据梯度钾离子浓度条件下的细胞内外荧光强度比值首先计算出细胞内钾离子平均浓度Dni与染料非电势依赖性结合系数f的比值[K+L/f。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤C中，在对细胞进行钠离子荧光染料染色的同时，使用梯度钠离子浓度溶液浸浴经钠离子载体通透的细胞进行标定，获取钠离子浓度与荧光强度的标准曲线方程。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤D中，采用梯度钾离子浓度的盐溶液平衡浸浴待测细胞，其中平衡盐溶液中钠离子浓度高于步骤C中所测胞内钠离子浓度的数据点不少于三个。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤D中，采用最小二乘法非线性迭代拟合法求出染料非电势依赖性结合系数f、胞内钾离子浓度[K+] i和细胞表观钠/钾通透性比值I3iwk值。
9.权利要求1-8任一项所述的检测方法在细胞离子通道功能表达或功能分化的非侵入性评价中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的检测方法在材料三维结构条件下对神经干细胞离子通道功能表达或功能分化的非侵入性评价中的应用。
全文摘要
本发明特别涉及基于Nernst电势荧光染料的细胞钾电极特性评价方法，具体步骤为构建具Nernst钾电极特性的细胞，以电势荧光染料技术得到[K+]i/f；用钠离子荧光染料评价胞内钠离子浓度；在梯度钾溶液中测量经电势荧光染料染色的待测细胞胞内外荧光强度比，根据Goldman方程以非线性迭代拟合得出f、[K+]i和细胞表观钠/钾通透性比PNa/K，以PNa/K作为评价细胞钾电极特性的定量指标；本发明建立的细胞钾电极特性评价法，为以电势荧光染料技术研究细胞电生物物理特性及离子通道功能表达提供了新的指标和方法，并为材料三维结构下细胞电生物物理特性乃至神经细胞功能分化的非侵入性原位检测提供了可能。
文档编号G01N33/50GK102393451SQ201110218448
公开日2012年3月28日 申请日期2011年8月1日 优先权日2011年8月1日
发明者吴泽志, 威廉.S.克萨阿利达, 宋兆全, 廖彦剑, 张利光, 李晨钟, 林雨, 罗美蓉, 金良, 陈景龙, 黄岂平 申请人:重庆大学