专利名称：制备用于分析的样品的方法和用于该制备方法的柱体的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备在分析过程中使用的样品的方法并涉及用于该制备方法的柱体。具体地，本发明涉及含有萃取来自食品的水溶性分析物，例如丙烯酰胺的样品的制备。
背景技术：
从食品中萃取化合物用于分析是已知的。例如，已知使用固相萃取(SPE)以从食品的萃取物中去除杂质并将纯化样品通过液相色谱/串联质谱(LC/MS/MS)技术进行分析。SPE利用溶解或悬浮于液体中(已知为流动相)的溶质的亲和性，对于固体(固体已知为固定相并包括吸附材料)，样品通过该固体将混合物分离为需要的和不需要的成分。以填充有吸附材料的注射器形的柱体形式设置该固定相。可以选择吸附材料以在其上通过吸收保留需要的分析物或不需要的杂质。已经开发了一些特定分析物和特定溶剂的SPE系 统，它们使用特定的SPE吸附剂。例如，已知使用多层吸附剂(已知为USA, PA，贝尔丰特的Sigma-Aldrich 公司市售的 Supelclean ENVI-Carb-II/PSE SPE 管)的 SPE 柱体用于从农产品中使用例如乙腈的有机溶剂萃取农药。近年来，一些健康和安全机构已经开始关注某些食品中存在的据信是某些烹制过程的副产品生成的化学丙烯酰胺。美国食品和药物管理局(FDA)已经开发了用于定量确定食品中的丙烯酰胺的分析方法(美国健康和人类服务局部门，美国食品和药物管理局，食品安全和应用营养中心，植物和奶制品和饮料办公室于2002年6月20日草拟，于2002年7月23日和2003年2月24日更新的“食品中的丙烯酰胺的检测和定量”)。由FDA开发的该方法使用与相关设备一套的特定的固相萃取(SPE)方法以在清理过程中从食品的含有丙烯酰胺的萃取物中去除杂质，以制备通过液相色谱/串联质谱(LC/MS/MS)技术用于后续分析的样品。具体地，FDA丙烯酰胺LC/MS/MS样品清理过程使用两个连续的且独立的清理过程，每个过程使用单独的SPE柱体，每个柱体含有单独的固定相。用于第一 SPE步骤中的第一 SPE柱体使用高分子吸附剂，USA，MA，米尔福特的Waters公司市售的OasisHLB作为固定相，并且用于第二 SPE步骤中的第二 SPE柱体使用显示出强阳离子交换和强阴离子交换并含有C8活性基团的混合模式的吸附剂，USA, CA，城市海港的Varian有限公司市售的BondElut Accucat作为固定相。更详细地，FDA清理过程需要使用第一柱体的如下的第一清理过程用3. 5ml的甲醇调节OASIS SPE柱体，随后用3.5ml的水调节该柱体。废弃使用过的甲醇和水部分以制备柱体。用1.5ml的试验部分萃取液填充OASIS SPE柱体。使得萃取液完全通过该吸附材料。用0. 5ml的水洗脱柱体并废弃。再用I. 5ml的水洗脱柱体并收集用于后续的SPE柱体清理。使用第二柱体进行如下的第二后续清理过程在高于吸附剂床上面的Iml液体的高度在Varian SPE柱体的外面设置标记。用2. 5ml的甲醇调节Varian SPE柱体，随后用2. 5ml的水调节该柱体。废弃使用的甲醇和水部分以制备柱体。用I. 5ml的从第一清理步骤中收集的部分填充并在收集洗脱过的部分的剩余物之前洗脱到Iml的标记处。转移到2ml的琥珀色自动取样瓶用于LC/MS/MS分析。FDA试验方案显示出可以实现高度的试验精确度，例如十亿分之50的精确度。但是，实现这一精确度的代价是该试验方案是非�：氖鼻已细竦�。例如，修订的分析方法要求人员在大约I. 5小时内制备12个用于分析的部分。手动多个步骤的方法是非�：氖鼻依投芗�。此外，FDA发现对于第一清理步骤，在方法的开发中试验了许多SPE柱体，并且它们中的全部都具有不同的分析物的保留和洗脱特性。因此，该方案规定不能在没有试验的这一步骤中替换另一种SPE吸附剂。此外，该方案规定不能为了在任何SPE步骤中加快洗脱过程使用真空。换句话说，在SPE步骤中，需要流动的液相在重力的作用下逐滴地通过固定的固相。虽然从文献中已知的是两个柱体可以通过连接器的连接被垂直堆叠，但是本发明人发现这样的堆叠在机械上是不稳定的，受到的高背压阻止液体通过其进行流动，并且对 于自动的SPE清理是不适合的。因此，虽然自动的SPE清理作为技术本身是已知的，但是仍然存在的问题是如何自动进行丙烯酰胺的清理同时仍然可以在该方案本身的范围内进行操作。本发明人发现的与该方案有关的另一个问题是多个步骤的手动方法可能引起被检测的丙烯酰胺含量的变化，这显然是由于在固相中从不需要的杂质中分离需要的分析物(丙烯酰胺)的程度的变化。据信这一问题是由于柱体中的吸附材料的填料密度变化的灵敏度所引起的。因此总之，已知的丙烯酰胺清理过程是耗时的，劳动密集的且非常容易出错的。根据样品萃取液的性质，样品和液体通过该柱体的流量差别很大。这一差别可能潜在地影响后续分析。
发明内容
本发明的目的是至少部分地克服对于含有丙烯酰胺的样品的已知的SPE清理方法的这些问题，并且更广泛地提供一种用于制备从食品中萃取的含有水溶性分析物(丙烯酰胺仅仅是一个例子)的样品的方法和用于该方法中的柱体。因此，本发明提供了制备用于分析过程中的含水样品的方法，该样品包括至少一种来源食品的水溶性分析物，该方法包括以下步骤(a)提供包括第一吸附材料和第二吸附材料的固相萃取柱体，设置所述的第一吸附材料和第二吸附材料以在其上分别吸收不同的化学成分，所述的柱体包括含有所述的第一吸附材料和第二吸附材料且具有入口和出口的室；(b)将包括至少一种来自食品的水溶性分析物和杂质的含水样品流动通过所述的A 口，从而在所述的第一吸附材料和第二吸附材料的至少一种中分散所述的样品；(C)将清洗液流动通过所述的入口，使得在所述的第一吸附材料和第二吸附材料中至少部分地将所述至少一种水溶性分析物和杂质分离；和(d)通过将洗脱液流动进入到所述的入口，从所述的柱体的出口洗脱出所述至少一种水溶性分析物。该方法还包括以下步骤，在步骤(a)和步骤(b)之间的通过将至少一种调节液流动通过所述的入口进入到所述的柱体的调节所述的吸附材料的步骤。优选地，设置所述的第一吸附材料和第二吸附材料作为所述的柱体中的两层。通常，所述的第一吸附材料被设置为所述的柱体的入口侧的上层并包括适于在其上吸收疏水性有机分子的高分子吸附材料和/或所述的第二吸附材料被设置为所述的柱体的出口侧的下层并包括适于在其上吸收阴离子成分和阳离子成分的基于硅的混合模式的吸附材料。通常，等量的所述的第一吸附材料和第二吸附材料存在于所述的柱体中。优选地，在步骤(b)，(C)和(d)的每一步中各自的液体以正流体压力和控制流量被注入到所述的柱体。较优选地，所述的控制流量是预设的。·需要地,在步骤(b), (C)和(d)的每一步中使用相同的控制流量。可选地，在步骤(b)，(C)和(d)的每一步中将等量的液体通过所述的入口注入。在最优选的实施例中，至少一种水溶性分析物包括丙烯酰胺。该方法还可以包括以下步骤，将所述的柱体在具有液体注入装置的设备中处理的步骤，所述的液体注入装置适于与所述的入口，清洗液源和洗脱液源相通，样品相对于设备被安装并且所述的液体注入装置适于取一部分样品用于制备，所述的液体注入装置适于选择性地并连续地将所述的样品，所述的清洗液和所述的洗脱液的各部分注入到所述的柱体。通常，由步骤(d)产生的洗脱样品被自动地转移到用于进行所述的分析过程的设备。本发明还提供了固相萃取柱体，所述的柱体包括第一吸附材料和第二吸附材料，设置所述的第一吸附材料和第二吸附材料以在其上分别吸收不同的化学成分，所述的柱体包括含有所述的第一吸附材料和第二吸附材料且具有入口和出口的室，设置所述的第一吸附材料和第二吸附材料作为所述的柱体中的两层，所述的第一吸附材料被设置为所述的柱体的入口侧的上层并包括适于保留疏水性有机分子的高分子吸附材料，并且所述的第二吸附材料被设置为所述的柱体的出口侧的下层并包括适于保留阴离子成分和阳离子成分的基于娃的混合模式的吸附材料。优选地，等量的所述的第一吸附材料和第二吸附材料存在于所述的柱体中。本发明还提供了自动制备来自食品的含有丙烯酰胺的含水样品的方法，所述的样品用于定量确定所述的样品中的丙烯酰胺含量的分析过程中，所述的方法包括以下步骤(a)提供包括第一吸附材料和第二吸附材料的固相萃取柱体，设置所述的第一吸附材料和第二吸附材料以在其上分别吸收不同的化学成分，所述的柱体包括含有所述的第一吸附材料和第二吸附材料且具有入口和出口的室，并且将所述的柱体在具有液体注入装置的设备中处理，所述的液体注入装置适于与所述的入口，清洗液源和洗脱液源相通；(b)使用液体注入装置以正流体压力和控制流量将来自食品的含有丙烯酰胺和杂质的含水样品通过入口注入，从而在第一吸附材料和第二吸附材料的至少一种中分散所述的样品；(C)使用液体注入装置以正流体压力和控制流量将来自清洗液源的一部分清洗液通过入口注入，使得在第一吸附材料和第二吸附材料中至少部分地分离所述的丙烯酰胺和杂质；和(d)使用液体注入装置以正流体压力和控制流量将来自洗脱液源的一部分洗脱液通过入口注入，从所述的柱体出口洗脱出丙烯酰胺。
现在，本发明的实施例将通过参考附图仅仅以举例的方式进行描述，其中图I示意性地显示了根据本发明的一个实施例的用于制备用于分析的样品的方法中的清理步骤中的固相萃取(SPE)柱体；图2a到2d显示了在清理步骤中使用图I的柱体的连续阶段；和图3示意性地显示了进行图2中显示的方法的设备。
具体实施例参看图I,固相萃取(SPE)柱体2包括限定内腔6的外壳4,外壳4具有用于内腔6的入口 8和出口 10，该入口 8和出口 10是同轴对齐的。出口 10被连接到空心针12以对于柱体2形成注射器形的结构。该内腔6包括两层，即第一吸附材料14和第二吸附材料16，它们由玻璃料18分离。第一吸附材料14和第二吸附材料16的每一层分别包括微粒材料的填料部分。第一吸附材料14被设置为入口侧的上层，包括适于保留疏水性有机分子的高分子吸附材料。具体地，第一吸附材料14可以包括水可湿性反相高分子吸附材料，例如USA，MA，米尔福特的Waters公司市售的Oasis HLB。第二吸附材料16被设置为出口侧的下层，包括适于保留阴离子成分和阳离子成分以及高极性成分的基于硅的混合模式的吸附材料。具体地，该第二吸附材料16可以包括硅基团上含有磺酸和季胺的水可湿性混合模式的吸附剂，例如USA, CA，城市海港的Varian有限公司市售的Bond Elut Accucat。虽然在所示的实施例里公开的是分层的柱体2，可替代地，可使用含有两种微粒溶剂材料的物理混合物的混合模式的柱体。通常，第一吸附材料14和第二吸附材料16的数量(例如按重量测量)是相同的，虽然这些数量可以被改变。用于本发明的优选实施例的典型柱体具有3ml的体积并含有IOOmg的第一吸附材料14和IOOmg的第二吸附材料16。但是，根据本发明可以使用不同的柱体体积和/或吸附材料数量。在使用时，在同一柱体2中使用两种吸附材料14，16利用单一柱体清理方法对柱体2进行顺续的处理步骤。对柱体2进行下面的连续的处理步骤I.调节步骤，其中使用例如甲醇的略带极性或极性溶剂平衡吸附材料，并且随后用水清洗以润湿吸附剂表面。首先是溶剂，随后是水以预设的控制流量顺序地被注入通过入口。2.样品添加步骤，其中包括要被分析的(例如丙烯酰胺)来自食品的水溶性分析物的含水样品以预设的控制流量被注入通过入口，这使得在吸附材料中一些样品的成分的分离，下面将详细说明；3.清洗步骤，其中以预设的控制流量将水注入通过入口以进一步在吸附材料中分离样品的成分，下面将详细说明；和4.洗脱步骤，其中以预设的控制流量将水注入通过入口以从出口产生洗脱萃取液流。这一洗脱萃取液被收集用于后续分析。在每一步骤中，每种液体以正流体压力和控制流量通过柱体。随后，该洗脱萃取液通过LC/MS/MS设备用于分析。除了水之外，可以使用用于样品和/或用于清理方法的缓冲液成分。参看图2a，在调节步骤中，使用例如甲醇的溶剂平衡第一吸附材料14和第二吸附 材料16，并且随后用水清洗以润湿吸附剂表面。这使得第一吸附材料14，第二吸附材料16用水逐渐被润湿，水的注入使得较早的甲醇的注入通过出口被置换。对于具有3ml容量并含有IOOmg的第一吸附材料14和IOOmg的第二吸附材料16的柱体,0. 5ml的甲醇和0. 5ml的水可以被注入到柱体内，甲醇和水均以40 ii 1/s的控制流量被注入到柱体。参看图2b，在样品添加步骤中，被注入的样品将一部分水置换流出该出口并将该样品分散通过上部的第一吸附材料14。对于上面确定的3ml容量的柱体，0. 5ml的萃取液以20iU/S的控制流量被注入到柱体。参看图2c，在清洗步骤中，使用上面确定的柱体，0. 5ml的水以20 yl/s的控制流量被注入到柱体。这使得在第一吸附材料14，第二吸附材料16之间萃取液中的成分发生分离。在图2中由苯环示意性表示的疏水有机材料趋向于被保留于高分子第一吸附材料14中。在图2中由a+/_示意性表示的离子(阴离子和阳离子)成分和任何高极性的物质趋向于被向下清洗并被保留于混合模式的第二吸附材料16中。在图2中由AA示意性表示的例如丙烯酰胺的水溶性分析物基本趋向于被保留于在高分子第一吸附材料14的较低部分和混合模式的第二吸附材料16的较高部分之间延伸的带状物中。换句话说，使用萃取液添加和清洗步骤的双重吸附材料实现了萃取物成分的色谱状的分离。参看图2d，在最终洗脱步骤中，使用上述柱体，例如0. 5ml的水以预设的流量，例如20 u 1/s，被注入通过入口以从出口产生富含水溶性分析物的含水洗脱萃取液流，疏水有机材料和离子(阴离子和阳离子)和高极性的物质被保留于柱体中。参看图3，在本发明的优选实施例的方法中，柱体2被设置于具有液体注入装置22的设备20中，该液体注入装置22是注射器的形状并适于与入口 8连通。设备20被设置有调节溶剂源24 (例如甲醇)和清洗液源和/或洗脱液源26，它们通�？梢允撬⑶乙部梢允遣煌�。例如在小瓶30中的含有要被纯化的分析物的含水液体食品萃取液的样品28相对于设备20被安装。小瓶30可以具有密封橡胶帽32，液体注入装置22的注射器针34通过密封橡胶帽32可以被推进以抽出一部分食品萃取物样品。液体注入装置22选择性地且顺续地受控并被操作以将样品28，调节溶剂，清洗液体和洗脱液体中的每种液体的各自部分注入柱体2。最终洗脱样品在另一个小瓶36中被收集，该小瓶36随后被自动转移到用于进行分析过程的设备38。通过使用清理方法中的这一顺序步骤并利用具有两种吸附材料的柱体，这相对于用于分析来自食品的水溶性分析物(例如丙烯酰胺)的现有的清理方法提供了许多明显的优点，并且特别对于上面讨论的用于丙烯酰胺的FDA方法提供了许多明显的优点。
包括两种吸附材料的单一柱体的使用获得了自动的清理过程，因为这仅仅是单一样品的添加步骤和单一的洗脱步骤，并且可以避免手动操作。循环时间可以从FDA方法中的I. 5小时被减少到少于10分钟。可以使用用于LC/MS/MS的样品制备的市售的自动SPE样品清理设备，例如德国，D-45473 Mulheim an der Ruhr,Gerstel GmbH&Co. KG 公司市售的自动 SPE 样品清理设备。自动SPE样品清理设备可以与LC/MS/MS光谱仪接口，允许24小时的无人的自动样品清理和分析。在每个步骤中，使用正流体压力和控制流量将每种液体注入到柱体避免了依靠重力的逐滴送入并克服了在FDA方法中由密封柱体引起 的背压问题。此外，这些步骤应该提供了改进的精确度和再现性，并且减少了由柱体中的吸附材料的填料密度差异所引起的定量分析物的确定中的差异。分析结果的精确度可以潜在地被改进。虽然本发明的实施例已经根据来自食品的萃取液的丙烯酰胺的定量确定进行了具体地描述，但是本发明已经应用于了作为风味开发路径的一部分的可能存在于食品中的其它水溶性分析物的定量确定。本领域的技术人员将容易地意识到针对在此公开的本发明的实施例的其它改进。
权利要求
1.制备在分析过程中使用的含水样品的方法，所述的样品包括至少ー种来自食品的水溶性分析物，所述的方法包括以下步骤 (a)提供包括第一吸附材料和第二吸附材料的固相萃取柱体，设置所述的第一吸附材料和第二吸附材料以在其上分别吸收不同的化学成分，所述的柱体包括含有所述的第一吸附材料和第二吸附材料且具有入口和出口的室； (b)将包括至少ー种来自食品的水溶性分析物和杂质的含水样品流动通过所述的入ロ，从而在所述的第一吸附材料和第二吸附材料的至少ー种中分散所述的样品； (C)将清洗液流动通过所述的入口，使得在所述的第一吸附材料和第二吸附材料中至少部分地将所述至少ー种水溶性分析物和杂质分离；和 (d)通过将洗脱液流动进入到所述的入口，从所述的柱体的出口洗脱出所述至少ー种水溶性分析物。
2.根据权利要求I所述的方法，还包括在步骤(a)和步骤(b)之间的通过将至少ー种调节液流动通过所述的入口进入到所述的柱体的调节所述的吸附材料的步骤。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中设置所述的第一吸附材料和第二吸附材料作为所述的柱体中的两层。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的第一吸附材料被设置为所述的柱体的入口侧的上层并包括适于在其上吸收疏水性有机分子的高分子吸附材料。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述的第二吸附材料被设置为所述的柱体的出口侧的下层并包括适于在其上吸收阴离子成分和阳离子成分的基于硅的混合模式的吸附材料。
6.根据前述任何一项权利要求所述的方法，其中等量的所述的第一吸附材料和第二吸附材料存在于所述的柱体中。
7.根据前述任何一项权利要求所述的方法，其中步骤(b)，(c)和(d)的每ー步中各自的 液体以正流体压カ和控制流量被注入到所述的柱体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的控制流量是预设的。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中在步骤(b)，(c)和(d)的每ー步中使用相同的控制流量。
10.根据权利要求7至9中任何一项所述的方法，其中在步骤(b)，(c)和(d)的每ー步中将等量的液体通过所述的入口注入。
11.根据前述任何一项权利要求所述的方法，其中所述至少ー种水溶性分析物包括丙烯酰胺。
12.根据前述任何一项权利要求所述的方法，还包括将所述的柱体在具有液体注入装置的设备中处理的步骤，所述的液体注入装置适于与所述的入口，清洗液源和洗脱液源相通，所述样品相对于所述的设备被安装并且所述的液体注入装置适于取一部分所述样品用于制备，所述的液体注入装置适于选择性地并顺续地将所述的样品，所述的清洗液和所述的洗脱液的各自部分注入到所述的柱体。
13.根据前述任何一项权利要求所述的方法，其中由步骤(d)产生的洗脱样品被自动地转移到用于进行所述的分析过程的设备。
14.固相萃取柱体，所述的柱体包括第一吸附材料和第二吸附材料，设置所述的第一吸附材料和第二吸附材料以在其上分别吸收不同的化学成分，所述的柱体包括含有所述的第ー吸附材料和第二吸附材料且具有入口和出口的室，设置所述的第一吸附材料和第二吸附材料作为所述的柱体中的两层，所述的第一吸附材料被设置为所述的柱体的入口侧的上层并包括适于保留疏水性有机分子的高分子吸附材料，并且所述的第二吸附材料被设置为所述的柱体的出口侧的下层并包括适于保留阴离子成分和阳离子成分的基于硅的混合模式的吸附材料。
15.根据权利要求14所述的柱体，其中等量的所述的第一吸附材料和第二吸附材料存在于所述的柱体中。
16.自动制备来自食品的含有丙烯酰胺的含水样品的方法，所述的样品用于定量确定所述的样品中的丙烯酰胺含量的分析过程中，所述的方法包括以下步骤 (a)提供包括第一吸附材料和第二吸附材料的固相萃取柱体，设置所述的第一吸附材料和第二吸附材料以在其上分别吸收不同的化学成分，所述的柱体包括含有所述的第一吸附材料和第二吸附材料且具有入口和出口的室，并且将所述的柱体在具有液体注入装置的设备中处理，所述的液体注入装置适于与所述的入ロ，清洗液源和洗脱液源相通； (b)使用液体注入装置以正流体压カ和控制流量将来自食品的含有丙烯酰胺和杂质的含水样品通过入口注入，从而在所述的第一吸附材料和第二吸附材料的至少ー种中分散所述的样品； (C)使用液体注入装置以正流体压カ和控制流量将来自所述清洗液源的一部分清洗液通过入口注入，使得在第一吸附材料和第二吸附材料中至少部分地分离所述的丙烯酰胺和杂质；和 (d)使用液体注入装置以正流体压カ和控制流量将来自所述洗脱液源的一部分洗脱液通过入ロ注入，从所述的柱体出口洗脱出丙烯酰胺。
17.根据权利要求16所述的方法，其中设置所述的第一吸附材料和第二吸附材料作为所述的柱体中的两层。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的第一吸附材料被设置为所述的柱体的入ロ侧的上层并包括适于保留疏水性有机分子的高分子吸附材料。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述的第二吸附材料被设置为所述的柱体的出口侧的下层并包括适于保留阴离子成分和阳离子成分的基于硅的混合模式的吸附材料。
20.根据权利要求16至19中任何一项所述的方法，其中所述的控制流量是预设的。
21.根据权利要求16至20中任何一项所述的方法，其中在步骤(b)，(c)和(d)的每ー步中使用相同的控制流量。
22.根据权利要求16至21中任何一项所述的方法，其中在步骤(b)，(c)和(d)。
全文摘要
本发明涉及制备在分析过程中使用的含水样品的方法，该样品包括至少一种来自食品的水溶性分析物，该方法包括以下步骤(a)提供包括第一吸附材料和第二吸附材料的固相萃取柱体，设置该第一吸附材料和第二吸附材料以在其上分别吸收不同的化学成分，该柱体包括含有该第一吸附材料和第二吸附材料且具有入口和出口的室；(b)将包括至少一种来自食品的水溶性分析物和杂质的含水样品流动通过该入口，从而在该第一吸附材料和第二吸附材料的至少一种中处理该样品；(c)将清洗液流动通过该入口，使得至少部分地将所述至少一种水溶性分析物和杂质分离；和(d)从该柱体的出口洗脱出所述至少一种水溶性分析物。
文档编号G01N1/40GK102695950SQ201080043085
公开日2012年9月26日 申请日期2010年8月4日 优先权日2009年8月4日
发明者陈功 申请人:福瑞托-雷贸易公司股份有限公司
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