专利名称：一种检测植物根际微生物的荧光原位杂交方法
技术领域：
本发明涉及一种检测植物根际微生物的荧光原位杂交方法。
背景技术：
根际微生物(rhizosphere microbe)是在植物根系直接影响的土壤范围内生长繁殖的微生物，其种类有细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物等，一般数量比根际外多几倍至几十倍。它们和植物间是互生关系，与植物根系相互作用、相互促进。根据植物根系与根际微生物共存形式又分为多种形式，最常见的如豆科植物与相应的根瘤细菌、外生菌根、内生菌根以及病原菌复合体等。
近年来，随着宏基因组学与分子生态技术迅速发展，微生物荧光原位杂交 (fluore·scence in situ hybridization,FISH)结合的显微镜观测成为了解根际微生物的有力工具。荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术。它以荧光染料标记的16S rDNA和16S rRNA寡核苷酸序列作为探针，按照两个核酸的碱基序列互补原则，将荧光素标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上(也可使用生物素标记的探针，再加入标记有荧光素的生物素单抗)，通过荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列进行定位、定性和相对定量分析，实现原位样品中的目标细菌的探测。
荧光原位杂交技术已经开始应用于植物根际微生物的观察，但是目前普遍存在一些难点问题，主要集中在两个方面。第一个方面也是最大的一个难点是植物根系本身通常具有较强的自发荧光。植物样本采集后的最初24小时之内是观测的最佳时机，之后由于植物本身逐渐加强的自发荧光现象严重干扰了微生物的观测，但现实操作中很难保证采集植物样本后能够及时进行检测。第二个方面是根际微生物稀疏的分布使得显微镜观测过程中难以寻找到目的微生物，并且随着时间的推移，根系本身逐渐加强的自发荧光现象使观测更加困难。这两个难点为植物根际微生物FISH观测的瓶颈。发明内容
本发明的目的是提供一种检测植物根际微生物的荧光原位杂交方法。
本发明提供的用于检测植物根际微生物的荧光原位杂交方法，包括如下步骤
(I)植物根系片段的固定；
(2)荧光原位杂交；
其特征在于所述步骤(I)和所述步骤(2)之间还包括如下步骤甲将完成步骤 (I)的植物根系片段用O. 0001至O. lmol/L焦磷酸四钠水溶液进行处理，然后弃去所述植物根系片段。
所述步骤甲中的处理条件可为20-30°C、15-60分钟。所述步骤甲中的处理条件具体可为22°C、20分钟。所述步骤甲中，所述焦磷酸四钠水溶液的浓度具体可为0. OOlmol/ L0
所述方法还可包括如下步骤乙将完成所述步骤甲的溶液体系(反应习题)离心收集沉淀，用PBS缓冲液冲洗并悬浮。所述PBS缓冲液具体可为pH = 7. 4、IOmmol的PBS 缓冲液。每株植物的根系片段完成所述步骤甲的溶液体系得到的沉淀优选采用2-5ml所述 PBS缓冲液进行所述悬浮。所述两步骤乙中的所述离心的条件具体可为16000g，30秒。
所述步骤(I)具体可为将所述植物根系片段浸泡于溶液甲中12小时；所述溶液甲是将3体积份固定液和I体积份3XPBS缓冲液混合得到的；所述固定液的pH为7.0-7. 4，含有4g/100ml多聚甲醛。所述固定液的配制方法具体如下(以IOOml体积为例) (I)取66ml超纯水在水浴中加热至600C ； (2)加入4g多聚甲醛；(3)加入2mol/L的NaOH 水溶液至多聚甲醛充分溶解；⑷用3XPBS缓冲液补足至IOOml ； (5)室温下放置冷却，用 lmol/L的HCl水溶液调节pH至7. 0-7. 4; (6)用注射器通过滤头(O. 22 μ m)过滤。所述 3XPBS缓冲液具体可为pH = 7. 4、30mmol的PBS缓冲液。
所述突光原位杂交的条件具体可为46°C杂交1. 5小时。
所述荧光原位杂交所用的探针上具有荧光素标记。所述荧光素具体可为FLUOS荧光素。所述荧光原位杂交所用的探针的核苷酸序列具体可如序列表的序列I所示。所述荧光素可位于所述探针的5’端或3’端。在所述荧光原位杂交中，所述探针的浓度优选为8.3pmol/ μ I或5pmol/μ I。所述植物根际微生物具体可为真细菌。
所述植物具体可为灯芯草(Juncus acutiflorus)。本发明提供的方法具体可包括如下步骤
①将植物的根系组织切割成1. 5-2. 5cm(2cm左右)长度的根系片段；
②将所述根系片段浸泡于所述溶液甲(以足够将所述根系片段完全淹没为准，2-5ml均可)中进行10-15小时(如12小时)的固定；
③将步骤②的反应体系离心(具体可为16000g，30秒)收集沉淀并用所述PBS 缓冲液冲洗两次，然后用所述焦磷酸四钠水溶液(以足够将所述根系片段完全淹没为准，5-10ml均可)悬�。�22°C水浴中培养20分钟(为使作用完全每5分钟漩涡振荡一次，每次振荡约10-20秒);
④将步骤③的反应体系中的植物根系取出后离心(如16000g，30秒)收集沉淀并用所述PBS缓冲液冲洗两次，然后用所述PBS缓冲液(以足够将所述根系片段完全淹没为准,2-5ml均可)悬�。�
⑤将10 μ I步骤④得到的悬浮液滴加至载玻片上，使其干燥(可用氮气吹干，也可在空气中自然风干)；
⑥将步骤⑤得到的载玻片依次在50%乙醇水溶液、80%乙醇水溶液和100%乙醇浸泡3分钟；
⑦将10μ I杂交缓冲液滴至载玻片的样品上，加入1μ I所述探针并与杂交缓冲液混合均匀，46°C杂交1. 5小时；
⑧用淋洗缓冲液冲洗掉载玻片上的杂交缓冲液，然后将载玻片浸泡于所述淋洗缓冲液中，48°C水浴静置20分钟；用蒸馏水冲洗后使其干燥(可放置于46°C烘箱中进行干燥，也可利用气体吹干)；
⑨进行DAPI染色后用荧光显微镜观察。
所述杂交缓冲液的制备方法具体可为将180 μ I 5Μ NaCl水溶液、300微升的甲酰胺、2 μ I 10g/100ml SDS水溶液依次加入并混匀，并用milliQ超纯水定容至I毫升。所述杂交缓冲液由水和如下浓度的各个溶质组成=NaCl O. 9M、SDS O. 02g/100ml、甲酰胺30% (体积比)。
所述淋洗缓冲液的制备方法具体可为将Iml Tris-HCl缓冲液(1M、pH = 8. O)、 1020 μ I 5Μ NaCl 水溶液、500 μ I O. 5Μ EDTA 水溶液(pH = 8. O)混匀，并用 milliQ 超纯水补足至50ml。所述淋洗缓冲液由水和如下浓度的各个溶质组成=Tris-HCl O. 02M、NaCl O. 102Μ、0· 005Μ EDTA0
所述DAPI染色时,可以加入抗粹灭剂。所述抗淬灭剂具体可为Vectorshield。
本发明提供的方法可以对采集后的样本进行即时检测，也可以允许采集后将样本放置保存一定时间后再进行检测，特别是对于放置24小时以上的样本，避免了自发荧光， 具有突出良好的效果。
本发明的发明人经过长期的实验研究，发现焦磷酸四钠水溶液可达到使植物根系与表面微生物发生解离的现象。在此基础上，对现有FISH方法进行改进，在现有FISH方法的固定与荧光原位杂交两个步骤之间，增加了焦磷酸四钠水溶液处理的步骤。本发明中的技术方案为将简单清洗去除土壤及沉积物颗粒之后的植物根系片段进行固定；用焦磷酸四钠水溶液处理固定之后的样品，通过焦磷酸四钠对根际微生物与其附着物(根系或土壤、沉积物颗粒)的解离作用，达到将二者分离的效果，去除原有附着物后，对包含解离脱落的微生物的所余溶液进行离心与再悬�。患绦薪酉吕吹挠庠辉咏�。本发明解决了植物根系FISH观测中植物本身常发生的自发荧光现象和根系本身附着根际微生物含量较小不便于观测的难点问题。
图1为实施例1中的FISH结果图；横线代表10微米，圆圈内为目标微生物。
图2为实施例2中的FISH结果图；横线代表10微米，圆圈内为目标微生物。
图3为实施例3中的FISH结果图；横线代表10微米，圆圈内为目标微生物。
图4为对比例中的FISH结果图；圆圈内为目标微生物。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例中所用的PBS缓冲液为pH = 7. 4U0mmol的PBS缓冲液；该PBS缓冲液 (pH = 7. 4)由溶质和水组成，溶质及其浓度如下=NaCl 137mmol · L-1，Na2HPO4IOmmol · L-1， KH2PO41. 76 · mmol. L、
实施例中所用的3XPBS缓冲液为pH = 7. 4、30mmol的PBS缓冲液；该PBS缓冲液 (pH = 7. 4)由溶质和水组成，溶质同PBS缓冲液，各个溶质的浓度均为PBS缓冲液的三倍。
灯芯草(Juncus acutiflorus)为常见湿地植物，参考文献成水平人工湿地废水处理系统的生物学基础研究进展湖泊科学，1996,8(3) =268-273.;吴建强，阮晓红，王雪人工湿地中水生植物的作用和选择水资源保护，2005，21 (I) :1-6。
实施例1、采用本发明的方法进行荧光原位杂交
1、自湿地中取一株灯芯草(Juncus acutiflorus)的根系组织,取样48小时后,用去离子水清洗去除表面附着的过多湿地沉积物与土壤残余；然后将根系组织切割成2cm左右长度的根系片段。
2、将步骤I获得的根系片段浸泡于2_5ml (足够将根系片段完全淹没为准)溶液甲中进行12小时的固定。
所述溶液甲是将3体积份固定液和I体积份PBS缓冲液混合得到的。
固定液的配制方法如下(以IOOml体积为例)(I)取66ml超纯水在水浴中加热至60°C;⑵加入4g多聚甲醛至水中，混合液会变浑浊；(3)缓缓加入2mol/L的NaOH水溶液至混合液中直至溶液清澈；(4)用3XPBS缓冲液补足至IOOml ； (5)室温下放置冷却，用 lmol/L的HCl水溶液调节pH至7. 0-7. 4 ； (6)用注射器通过滤头(O. 22 μ m)过滤。
3、将步骤2的反应体系离心(16000g，30秒)，收集沉淀并用PBS缓冲液冲洗两次， 然后用5-10ml (足够将根系片段完全淹没为准)O. OOlmol/L焦磷酸四钠水溶液悬浮(为使作用完全可先漩涡振荡I分钟)，在22°C水浴中培养20分钟(为使作用完全每5分钟振荡一次，每次振荡约10-20秒)。
4、将步骤3的反应体系中的根系片段取出，剩余的反应体系(溶液体系)离心 (16000g, 30秒)，收集沉淀并用PBS缓冲液冲洗两次，然后用2-5ml (足够将根系片段完全淹没为准)PBS缓冲液悬浮。
实际应用时，可以根据实际需要确定本步骤中最后加入的PBS缓冲液体积，小量的PBS缓冲液可起到富集作用。本步骤得到的样本如需长期保存可保存于100%乙醇和PBS 缓冲液等体积混合得到的混合液中，_20°C保存。
5、将10 μ I步骤4得到的悬浮液滴加至载玻片上，用氮气吹干(也可在空气中自然风干)。
实际应用时，如果样品颗粒较大可使用0.1 %琼脂糖胶点在样品上后干燥，起到固定作用。
6、将步骤5得到的载玻片依次在50%乙醇水溶液、80%乙醇水溶液和100%乙醇浸泡3分钟。
实际应用中，本步骤处理后可将样品可以储藏于_20°C条件下。
7、将10μ I杂交缓冲液滴至载玻片的样品上，加入1μ I杂交探针，用移液器枪头轻轻搅动用以混合；46°C杂交1. 5小时。
本实施例中所用的杂交探针为针对真细菌的EUB338探针，核苷酸序列为(序列表的序列I) :5’ -GCTGCCTCCCGTSGGAGT-3’(5’末端标记FLUOS荧光素)，杂交探针浓度为 8.3pmol/μ I。
实施例中所用的杂交缓冲液的制备方法将180 μ I 5Μ NaCl水溶液、300微升的甲酰胺、2 μ I 10g/100ml SDS水溶液依次加入并混匀，并用milliQ超纯水定容至I毫升。 杂交缓冲液中各溶质的浓度如下=NaCl 0.9M、SDS 0. 02g/100ml、甲酰胺30% (体积比)。
实际应用中，应根据具体的探针选择合适的杂交缓冲液。实际应用中，如果采用 Cy3或者Cy5标记的杂交探针，杂交探针浓度最好为5pmol/ μ I。
8、用少量淋洗缓冲液冲洗掉载玻片上的杂交缓冲液，然后将载玻片浸泡于淋洗缓冲液中，48°C水浴静置20分钟；将载玻片表面的淋洗缓冲液用预冷却的蒸馏水冲洗掉，放置于46°C烘箱中进行干燥(也可利用气体吹干)。
实施例中所用的淋洗缓冲液的制备方法将Iml Tris-HCl缓冲液(1Μ、ρΗ = 8.0),1020 μ I5M NaCl水溶液、500 μ I O. 5Μ EDTA水溶液(pH = 8. O)混匀，并用milliQ超纯水补足至50mlO淋洗缓冲液中各溶质的浓度如下=Tris-HCl O. 02M、NaCl O. 102Μ、0· 005Μ EDTA。
实际应用中，应根据具体的探针选择合适的淋洗缓冲液。
9、将预混有DAPI染料的Vectorshield(抗淬灭剂)滴加至载玻片的样本上，盖上盖玻片，用突光显微镜(Zeiss Axioplan 2microscope ；Zeiss, Jena, Germany)观察。
见图1。可以清晰观察到带有荧光的目的微生物。
实施例2、采用本发明的方法进行荧光原位杂交
1、同实施例1的步骤I。
2、同实施例1的步骤2。
3、采用O. 0001mol/L焦磷酸四钠水溶液，在20°C水浴中培养15分钟，其它同实施例I的步骤3。
4、同实施例1的步骤4。
5、同实施例1的步骤5。
6、同实施例1的步骤6。
7、同实施例1的步骤7。
8、同实施例1的步骤8。
9、同实施例1的步骤9。
见图2。可以清晰观察到带有荧光的目的微生物。
实施例3、采用本发明的方法进行荧光原位杂交
1、同实施例1的步骤I。
2、同实施例1的步骤2。
3、采用0. lmol/L焦磷酸四钠水溶液，在30°C水浴中培养60分钟，其它同实施例1的步骤3。
4、同实施例1的步骤4。
5、同实施例1的步骤5。
6、同实施例1的步骤6。
7、同实施例1的步骤7。
8、同实施例1的步骤8。
9、同实施例1的步骤9。
见图3。可以清晰观察到带有荧光的目的微生物。
对比例、采用现有方法(无焦磷酸四钠水溶液解离处理)进行荧光原位杂交
1、同实施例1的步骤I。
2、同实施例1的步骤2。
3、将步骤2的反应体系(含根系片段)滴加至载玻片上，用氮气吹干。
4、同实施例1的步骤6。
5、同实施例1的步骤7。
6、同实施例1的步骤8。
7、同实施例1的步骤9。
见图4。根系显示很强的自发英冠，不能清晰观察到带有荧光的目的微生物。
序列表〈110〉中国科学院生态环境研究中心〈120〉一种检测植物根际微生物的荧光原位杂交方法<130> CGGNAY1120856〈160〉 I〈210〉 I<211〉18 〈212〉 DNA <213〉人工序列〈220〉 <223>〈400〉 Igctgcctccc gtsggagt18
权利要求
1.一种用于检测植物根际微生物的荧光原位杂交方法，包括如下步骤(1)植物根系片段的固定；(2)荧光原位杂交；其特征在于所述步骤(I)和所述步骤(2)之间还包括如下步骤甲将完成步骤(I)的植物根系片段用O. 0001至O. lmol/L焦磷酸四钠水溶液进行处理，然后弃去所述植物根系片段。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤甲中的处理条件为20-30°C、 15-60分钟。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤甲中的处理条件为22°C、20分钟； 所述焦磷酸四钠水溶液的浓度为O. 001mol/L。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括如下步骤乙将完成所述步骤甲的溶液体系离心收集沉淀，用PBS缓冲液冲洗并悬浮。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(I)为将所述植物根系片段浸泡于溶液甲中12小时；所述溶液甲是将3体积份固定液和I体积份3XPBS缓冲液混合得到的；所述固定液的PH为7. 0-7. 4，含有4g/100ml多聚甲醛。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法,其特征在于所述突光原位杂交的条件为 46°C杂交1. 5小时。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述荧光原位杂交所用的探针上具有荧光素标记；所述荧光素优选为FLUOS荧光素。
8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于所述荧光原位杂交所用的探针的核苷酸序列如序列表的序列I所示。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述荧光原位杂交所用的探针的浓度为 8.3pmol/μ I。
10.如权利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于所述植物为灯芯草。
全文摘要
本发明公开了一种检测植物根际微生物的荧光原位杂交方法。本发明提供的方法，包括如下步骤(1)植物根系片段的固定；(2)荧光原位杂交；其特征在于所述步骤(1)和所述步骤(2)之间还包括如下步骤甲将完成步骤(1)的植物根系片段用0.0001至0.1mol/L焦磷酸四钠水溶液进行处理。本发明的发明人发现焦磷酸四钠水溶液可达到使植物根系与表面微生物发生解离的现象。在此基础上，对现有FISH方法进行改进，在现有FISH方法的固定与荧光原位杂交两个步骤之间，增加了焦磷酸四钠水溶液处理的步骤。本发明解决了植物根系FISH观测中植物本身常发生的自发荧光现象和根系本身附着根际微生物含量较小不便于观测的难点问题。
文档编号G01N21/64GK102994614SQ20111026685
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月9日 优先权日2011年9月9日
发明者祝贵兵, 王雨, 尹澄清 申请人:中国科学院生态环境研究中心
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