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专利名称：全内反射荧光显微镜测量植物细胞中钙离子浓度的方法
技术领域：
本发明涉及全内反射荧光显微镜测量植物细胞中钙离子浓度的方法。
背景技术：
在高等植物细胞中，Ca2+不仅是细胞重要的营养元素，还作为细胞内的第二信使， 参与多种细胞生长发育过程。通常细胞中的Ca2+以三种形式存在，1.与细胞结构成分或大分子结合，即结合钙；2.贮存于内质网、液泡、线粒体等胞内钙库中，即贮存钙；3.以离子形式存在于细胞中，即游离钙。细胞中的贮存钙和游离钙是可以相互转换的。在静止状态下， 细胞中游离态的Ca2+以一个非常低的浓度存在，大约维持在10-8-10_7mOl/L。当受到外界刺激时，细胞质中的游离钙会迅速发生变化，使细胞中Ca2+的浓度达到10_6mOl/L，这个变化通常发生在毫秒甚至亚毫秒级水平。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种测定植物组织中钙离子浓度的方法。本发明所提供的测定植物组织中钙离子浓度的方法，包括以下步骤(1)将已知浓度的钙离子溶液与F1UO-4AM染色液I混合，得到混合检测液；用全内反射荧光显微镜测定所述混合检测液的荧光强度，制作钙离子浓度对应荧光强度的标准曲线；(2)用含有F1UO-4AM的染色液II对植物组织进行染色，得到染色后的植物组织； 用全内反射荧光显微镜测定所述染色后的植物组织的荧光强度，根据所述标准曲线，得到所述植物组织中钙离子的浓度。所述步骤(1)中，所述F1UO-4AM染色液I为将Fluo_4AM溶解于无水二甲基亚砜中得到的染色液；所述F1UO-4AM在所述混合检测液中的浓度为10 μ Μ-25 μ M或10 μ M或 20μΜ 或 25μΜ。所述步骤(1)中，所述钙离子溶液中的钙离子的浓度为ΙΟηΜ-ΙΟΟΟηΜ，具体为 10nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM 和 IOOOnM ；所述
钙离子溶液为CaCl2水溶液。所述步骤O)中，所述对植物组织进行染色的方法包括如下步骤将所述植物组织浸泡于所述含有Fluo-4AM的染色液II中，在4°C孵育1. 5h-2. 5h或1.证或池或2. 5h， 得到染色后的植物组织。所述步骤O)中，所述含有F1UO-4AM的染色液II中Fluo_4AM的浓度为 10 μ Μ-25 μ M 或 10 μ M 或 20 μ M 或 25 μ Μ。所述用全内反射荧光显微镜测定荧光强度的曝光时间为10ms-500ms或IOms或 200ms 或 500ms ο所述植物为活体植物；所述植物组织为植物根毛；所述植物为拟南芥。本发明利用Ca2+的指示剂F1UO-4AM与隐失波荧光显微术相结合的方法对活体拟
式I化学名称为4-(6-ACET0XYMETH0XY-2,7-DIFLU0R0-3-0X0-9-XANTHENYL) -4 ‘ -ME THYL-2,2 ‘ -(ETHYLENEDIOXY)DIANILINE-N, N, N ‘ , N ‘ -TETRAACETIC ACID TETRAKIS(ACETOXYMETHYL)ESTER。方法I一、制作钙离子浓度对应荧光强度的标准曲线1、配制 Fluo-4AM 储存液将50 μ g Fluo-4AM(购自 hvitrogen 公司)用 45. 6 μ L 无水二甲基亚砜(DMSO) (购自Sigma公司，产品目录号为D4M0)配制成浓度为ImM的Fluo_4AM储存液。
南芥根毛细胞中的Ca2+浓度进行了实时、动态的观测，并对其浓度进行测定；同时通过用I丐离子载体Ionomycin和Ca2+作为阳性对照，用Ionomycin和EGTA处理材料作为阴性对照， 证明利用本方法测量活体细胞中Ca2+浓度时简单、可行且重复性好。


图1为不同Ca2+浓度对应相对荧光强度的标准曲线。图2为拟南芥根毛细胞顶端Ca2+浓度的分布图。图3为5 μ M Ionomycin和5mM EGTA处理后，拟南芥根毛细胞中的Ca2+浓度分布图。图4为5μΜ Ionomycin和2mM Ca2+处理后，拟南芥根毛细胞中的Ca2+浓度分布图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、利用全内反射荧光显微镜测定拟南芥根毛细胞中Ca2+浓度Fluo-4AM 的化学式为C51H5tlF2N2O23。结构式为如下式I所示
2、配制不同浓度CaCl2溶液将CaCl2溶于双蒸水中，配制成含有0. ImM CaCl2的母液，然后将母液分别稀释成以下 Ca2+ 浓度的 CaCl2 溶液10nM，IOOnM, 200nM, 300nM, 400nM, 500nM, 600nM, 700nM, 800nM, 900nM,ΙΟΟΟηΜ。3、制作标准曲线分别向上述步骤2配制的不同Ca2+浓度的CaCl2溶液中加入步骤1配制的 F1UO-4AM储存液，得到不同Ca2+浓度混合液(见表1)；得到的各不同Ca2+浓度的混合液中 Fluo-4AM的浓度均为20 μ Μ。将得到的各不同Ca2+浓度的混合液分别加到记号笔标记的载玻片上，用全内反射荧光显微镜对其进行观测，曝光时间为200ms，并利用ImageJ软件测定各不同Ca2+浓度混合液的荧光强度，测定结果见表1，并制作不同Ca2+浓度对应荧光强度标准曲线(图1)，得出不同Ca2+浓度对应荧光强度标准曲线方程为y = 4E-07x3-0. 0009x2+ 0. 8077x+30. 455 (R2 = 0. 9663)。表1不同Ca2+浓度对应的相对荧光强度
权利要求
1.一种测定植物组织中钙离子浓度的方法，包括以下步骤(1)将已知浓度的钙离子溶液与F1UO-4AM染色液I混合，得到混合检测液；用全内反射荧光显微镜测定所述混合检测液的荧光强度，制作钙离子浓度对应荧光强度的标准曲线.一入 ，(2)用含有F1UO-4AM的染色液II对植物组织进行染色，得到染色后的植物组织；用全内反射荧光显微镜测定所述染色后的植物组织的荧光强度，根据所述标准曲线，得到所述植物组织中钙离子的浓度。
2.所述步骤(1)中，所述F1UO-4AM染色液I为将F1UO-4AM溶解于无水二甲基亚砜中得到的染色液；所述F1UO-4AM在所述混合检测液中的浓度为10 μ Μ-25 μΜ或ΙΟμΜ或20μΜ 或 25 μ Μ。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述钙离子溶液中的钙离子的浓度为ΙΟηΜ-ΙΟΟΟηΜ，具体为ΙΟηΜ、 50ηΜ、ΙΟΟηΜ、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM 和 IOOOnM ；所述钙离子溶液为CaCl2水溶液。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述步骤O)中，所述对植物组织进行染色的方法包括如下步骤将所述植物组织浸泡于所述含有Fluo-4AM的染色液II中，在4°C孵育1. 5h-2. 5h或1.证或池或2.证，得到染色后的植物组织。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述步骤O)中，所述含有Fluo-4AM的染色液II中Fluo-4AM的浓度为10 μ Μ-25 μ M 或 10μΜ或 20μΜ或 25μΜ0
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述用全内反射荧光显微镜测定荧光强度的曝光时间为10ms-500ms或IOms或200ms 或 500ms。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述植物为活体植物；所述植物组织为植物根毛；所述植物为拟南芥。
全文摘要
本发明公开了全内反射荧光显微镜测量植物细胞中钙离子浓度的方法。本发明所提供的测定植物组织细胞中钙离子浓度的方法，包括以下步骤(1)将已知浓度的钙离子溶液与Fluo-4AM染色液I混合，得到混合检测液；用全内反射荧光显微镜测定所述混合检测液的荧光强度，制作钙离子浓度对应荧光强度的标准曲线；(2)用含有Fluo-4AM的染色液II对植物组织进行染色，得到染色后的植物组织；用全内反射荧光显微镜测定所述染色后的植物组织的荧光强度，根据所述标准曲线，得到所述植物组织中钙离子的浓度。利用本方法测量活体细胞中Ca2+浓度时简单、可行且重复性好。
文档编号G01N21/64GK102183499SQ201110044919
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月24日 优先权日2011年2月24日
发明者万迎朗, 林金星, 范路生 申请人:中国科学院植物研究所