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专利名称：二氧化碳诊断/测定试剂盒及二氧化碳浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种二氧化碳诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定二氧化 碳浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
血液内二氧化碳的含量对人体内酸碱平衡的调节起着重要的作用。血液pH 的恒定是维持生命活动必不可少的条件，血浆中的多种缓冲系统中以碳酸氢盐 缓冲系统最为重要，直接影响血液的pH。
血液内二氧化碳的含量变化主要反映代谢性酸碱平衡紊乱。单纯代谢性酸 或碱中毒时，血液碳酸氢根[HC(V]下降或升高，总二氧化碳也随之下降或升高。 而单纯呼吸性酸或碱中毒时，血液碳酸氢根升高或下降。
总二氧化碳和碳酸氢根的测定方法较可分为直接测定和间接推算两类。直
接测定主要有量气法、量压法、滴定法、比色法、Conway微量扩散法、流动注 射气体扩散法等。间接推算是利用血气分析仪测得的PH与PC02,根据H-H方程 的变换形式
HC03— (m mol /L) =0. 03XPC02(mm Hg) Xantilog(PH-p ka)或 HC0「(m mol/L)=0. 225XPC02(k Pa) Xantilog(PH-p Ka) 计算获得。
式中PH为37。 C时测得值，pka在37。 C为6. 10。
目前，以间接推算法应用较普遍，由血液分析仪的微处理计算机并与血气分 析结果一起报告，准确性基本可以符合临床要求。
直接测定法以滴定法应用最广泛，但由于受多种因素影响，测定误差较大。 酶法测定适合自动化分析，结果可靠，应当是很有前途的测定方法，但目 前尚有待深入研究。检索中国专利发现，申请号为96190276.0、申请日为1996. 02. 06的发明
专利申请公开了一种用来导出病人血液中气体含量的非侵入性的系统和方法。 该系统相应于体积测量呼气中的二氧化碳浓度。然后处理该数据导出动脉血中 二氧化碳气体水平。若数据为时间域，处理可将时间域数据转换成体积域。该 方法也经迭代评估了多个变量的显著性，所得的关系可供快速和准确地对健康 人和患肺病病人进行血中气体含量的测定。近年来，申请号为02282386. 7、申 请日为2002. 10. 29的实用新型专利公开了一种医用的血液碳酸氢根测定仪，主 要由操作面板、进样检测机构、定滴加液机构、搅拌机构和以单片机为主控元 件的电器控制部分组成。其操作面板包括有手动按键、输入键盘和显示屏；进 样检测机构由沿圆周均布样本孔且在孔内放置样本瓶的样本转盘和竖直装配在 转盘下面的驱动电机及对应于检测位样本孔设置的光电检测器组成；定滴加液 机构由配置电机的微量泵和设置于样本孔上方的定滴头及配置在定滴头滴液口 处的计滴器组成；搅拌机构由设置在样本转盘下方相应位置的搅拌电机和装配 在搅拌电机轴上的磁盘及放置于样本瓶内的搅拌棒组成。
以上专利均与酶法测定无关，这从一个侧面说明，国内此方面的实验研究 十分缺乏。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联 法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm 波长处吸光度的变化，得以测定二氧化碳浓度的方法，同时，本发明还将给出 用以实现该方法的二氧化碳诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见 光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行二氧化碳浓度测定，而且测定速度快、 准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明二氧化碳浓度测定方法原理如下二氧化碳+过氧化氢+乙酰辅酶A 丙酮酸氧化酶 丙酮酸+
辅酶A+氧
丙酮酸+高铁细胞色素bl +水丙酮酸脱氢酶 乙酸+ 二氧化碳
+亚铁细胞色素bl
乙酸+还原型辅酶 醛脱氢酶 乙醛+辅酶+水
这种方法应用丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase (CoA-acetylating); EC 1.2,3.6) 酶(偶)联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.2.2)、醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase; EC 1.2.1.3; EC 1.2.1.4; EC 1.2.1.5)酶促反应连续监测法。丙 酮酸氧化酶作为作用酶，功能为将二氧化碳酶解产生丙酮酸。丙酮酸脱氢酶作
为循环酶丙酮酸脱氢酶再将丙酮酸再次变回二氧化碳，使二氧化碳不断地被 重复循环利用，同时不断的循环产生乙酸。醛脱氢酶作为显色酶，在乙酸存在
下将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没 有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测 量340nm处吸光度下降的速度，可以测算二氧化碳的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论 是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明二氧化碳诊断/测定试剂盒较为
理想
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
丙酮酸氧化酶 6000 U/L
丙酮酸脱氢酶 8000 U/L
醛脱氢酶 10000 U/L过氧化氢 12 mmol/L
乙酰辅酶A 7 mmol/L
高铁细胞色素bl 7 mmol/L
本发明的二氧化碳诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括-
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢 酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、高铁细胞色素bl。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂-试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、高铁细胞色 素bl。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶。 还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶、过氧化氢、乙酰辅 酶A、高铁细胞色素bl在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干 粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、高铁细胞色 素bl。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶。试剂3
缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶。 还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶、过氧化氢、乙酰辅
酶A、高铁细胞色素M在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒 可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使 用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定二氧化碳浓度的方法，其还原型辅 酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的二氧化碳诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
丙酮酸氧化酶 6000 U/L
丙酮酸脱氢酶 8000 U/L
醛脱氢酶 10000 U/L
过氧化氢 12 mmol/L
乙酰辅酶A 7mmol/L 高铁细胞色素bl 7mmol/L 试剂全 溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻千燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8 ±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测二氧化碳样品与试剂的体 积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检 测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出二氧化碳的浓度大小。 实施例二
本实施例的二氧化碳诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 过氧化氢 乙酰辅酶A 高铁细胞色素bl 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 过氧化氢 乙酰辅酶A 高铁细胞色素bl
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8
100醒ol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 12 mmol/L 7 mmol/L 7 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 12 mmol/L 7 mmol/L 7 mmol/L±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测二氧化碳样品与试剂1、
试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约l 分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出二氧化碳的浓度大小。 实施例三
本实施例的二氧化碳诊断/测定试剂为三试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
过氧化氢
乙酰辅酶A
高铁细胞色素bl
100 mmol/L 50 mmol/E 0.25 mmol/L 12 mmol/L 7 mmol/L 7 mmol/L
试剂2
二 ^給
(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
丙酮酸脱氢酶
500 mmol/L 8000 U/L 10000 U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
丙酮酸氧化酶
500 mmol/L 6000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定二氧化碳浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间
IO分钟，起始吸光度1.8士0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测 二氧化碳样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负 反应(下降反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出二氧化碳的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到 本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器 得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.003;吸光度时 间反应曲线应呈下降曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达 5Ommol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5%;试剂测试的精密 度(重复性)的变异系数(CV)《3%;试剂的灵敏度可达0.12 ± 0.06 AA/ mmol /L;试剂在2—8"C下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、 精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。
ii
权利要求
1.一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的二氧化碳浓度测定方法，其方法原理如下二氧化碳+过氧化氢+乙酰辅酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+辅酶A+氧丙酮酸+高铁细胞色素b1+水丙酮酸脱氢酶乙酸+二氧化碳 +亚铁细胞色素b1乙酸+还原型辅酶醛脱氢酶乙醛+辅酶+水将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出二氧化碳的浓度大小测定结果。
2.其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述二氧化碳诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶、 过氧化氢、乙酰辅酶A、高铁细胞色素bl组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述二氧化碳诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶、 过氧化氢、乙酰辅酶A、高铁细胞色素bl组成双剂试剂；试剂l，由缓冲 液、稳定剂、还原型辅酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、高铁细胞色素bl组成； 试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶组成。 还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、高铁细胞色素bl在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述二氧化碳诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、高铁细胞色素bl组成多剂试剂；试剂l，由缓冲 液、稳定剂、还原型辅酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、高铁细胞色素bl组成； 试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶组成；试剂3，由缓 冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶组成。还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、高铁细胞色素bl在试剂1、试 剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述二氧化碳诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂14000 mmol/L或0.1。/。-100。/。体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate )、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的二氧化碳诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定二氧化碳浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、高铁细胞色素b1、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出二氧化碳的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101620171SQ20081012424
公开日2010年1月6日 申请日期2008年6月30日 优先权日2008年6月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司