专利名称：一种对生物样品进行富集和除盐净化处理的方法
技术领域：
本发明属于生化分析技术领域，具体涉及一种利用图案化表面对生物样品进行一步富集和除盐净化的处理方法，这种图案化表面可以被广泛地应用于生物样品的预处理及检测。
背景技术：
基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)是一种有效的软电离方法，具有很高的灵敏度，适用于蛋白质组学中生物样品的分析检测。但是，在质谱分析过程中，由于样品沉积面积的不可控制以及基质和样品不均勻的共结晶会降低质谱分析的检测灵敏度及重现性。另外，生物样品中存在的盐及其它的一些试剂也会严重地干扰样品和基质的结晶，导致质谱信号微弱甚至淬灭质谱信号。因此，利用合适的样品预处理方法来富集和除盐净化对于MALDI分析和检测是非常重要的。一些离线方法如HPLC，ZipTipC18以及一些功能化的纳米粒子都被用于预先分离复杂的生物样品。虽然样品得到纯化，但是由于其复杂的操作过程就不可避免会造成样品损失以及污染物的引进。为了克服离线方法的不足，在线样品富集及除盐的方法引起了广泛的关注。近几年，科学家利用旋涂或滴涂的方法将疏水聚合物如聚四氟乙烯、石蜡、尼龙等修饰在 MALDI 的样品板上(J. Mass Spectrom. 2002，37，512 ；Anal. Chem. 1997，69，4716 ； Anal.Biochem. 2004，327,222 ；Anal. Chem. 1998，70，750 J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1994， 5，230)。在进行水洗除盐的时候由于盐与疏水聚合物的作用力很弱，盐会被溶解在水中而被除掉，但是额外的水洗步骤则会导致不可避免的样品损失，同时也不利于高通量的质谱检测。2007年，Jia首次利用大量的基质溶液推洗污染物的方法来实现免于水洗的在线样品富集及除盐(Proteomics 2007,7,2497 ；中国专利，公开号:CN1811407A) 0但是这种方法需要大量基质溶液排盐，会导致部分分析物损失；另外，这种方法还需要严格控制样品溶液的沉积体积。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种操作简单快速、高灵敏度、高通量的一步样品除盐和富集的新方法。具体涉及在基底(硅，玻璃，石英等)上构筑具有疏水-亲水-疏水区域结构的封闭(环形或方形)图案化表面，使多肽或蛋白样品实现简单快速地靶上在线免水洗除盐和同步富集，避免了样品的损失，并进行MALDI-TOF MS的分析和检测的新方法。本发明提出的利用疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面对生物样品进行在线免水洗除盐和同步富集的方法，具体的步骤如下1、在基底上构筑疏水-亲水-疏水区域的封闭图案化表面；2、将1 5μ L多肽或蛋白溶液滴在上述步骤制备的图案化表面上，在室温下自然晾干，从而得到干燥的样品点；在自然晾干的过程中，由于图案化表面的中央疏水区域对蛋白或多肽有很强的疏水相互作用而对无机盐等污染物的吸附很弱，从而使无机盐等污染物被大部分转移到亲水区域，而多肽或蛋白则被吸附到中央疏水区域；3、将1 5yL、5 20mg/ml的基质溶液(溶质为芥子酸、2-氰基-4-羟基肉桂酸或2，5-二羟基苯甲酸，溶剂为乙腈与三氟乙酸水溶液等体积混合，三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的体积分数为0. 1% )滴在上述干燥的样品点上，室温下自然晾干后，在图案化表面上形成样品和基质均勻的共结晶；在此过程中，少部分残留在中央疏水区域的无机盐等污染物会重新溶解在水溶液里，从而被进一步带到亲水区域，而蛋白或多肽仍能保留在中央疏水区域；4、无需额外的水洗除盐步骤也无需过量的基质溶液除盐，将上述步骤富集除盐后的样品直接进行MALDI-TOF MS的分析和检测。上述方法中，步骤1中构筑的疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面的具体方法，包括如下几个步骤A.选取基底，对基底进行清洁及亲水化处理；B.在基底上构筑厚度0.2 200 μ m、半径250 IOOOym的聚合物涂层(聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯(PS)或光刻胶等)；C.以步骤B构筑的聚合物涂层为挡层，在挡层以外的基底上修饰含氟单分子层 (十七氟癸基三甲氧基硅烷、十三氟辛基三甲氧基硅烷等)或蒸镀金属层(金或银)作为疏水层，其厚度为20 200nm;D.将步骤C得到的基底浸入有机溶剂中进行超声处理除去聚合物挡层，随后用水超声除去基底上残留的有机溶剂，从而在基底上形成半径250 1000 μ m的空白亲水区域；E.在步骤D得到的基底的空白亲水区域中央制备厚度0.2 200 μ m、半径10 500 μ m的聚合物层(PMMA、PS或其他疏水聚合物)或金属层(金、银)，作为中央疏水区域， 从而在基底上得到疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面。基底(如硅片、玻璃片、石英片等)的清洁处理和亲水化处理主要有两种方法，第一种方法是首先用氧等离子体系统对基底表面进行处理，目的是除去表面残留有机物并使表面羟基化，成为亲水表面，氧气流速60 140ml/min，功率100 300W，处理时间1 IOmin ；再用高纯水对基底表面超声清洗2 3次，每次时间为2 5min，使表面彻底清洁并羟基化；第二种方法是在体积比为NH3 ·Η20 H2O2 H2O= (1 3) (1 3) (3 8)的溶液中，在50 90°C的温度下将基底浸泡30 90min，然后在功率为40 100W超声清洗仪中清洗2 5min，再用高纯水超声清洗2 3次，每次时间为2 5min，使表面彻底清洁并羟基化。步骤B和E中对于疏水层的制备可以利用毛细管滴涂和蘸笔技术、光刻技术、遮挡板蒸镀金属技术或红外激光精确定位打孔粘性膜技术完成。(1)毛细管滴涂和蘸笔技术是用毛细管或聚二甲基硅氧烷(PDMS)蘸取一定浓度的聚合物(PMMA或PS，2. 5 7. 5(wt%)， 溶于二甲苯溶液)溶液，然后接触并滴涂在基底上；( 光刻技术则是采用旋涂的方法将光刻胶旋涂于处理过的基底上，旋涂速度为1000 SOOOrpm，然后置于光刻掩膜板下，在 390nm的紫外光下曝光20s 5min后用相应的显影液洗脱后，从而构筑出有序结构的基底； (3)遮挡板蒸镀金属技术，即利用具有孔洞的金属挡板覆盖在基底上进行蒸镀，孔洞处就能被蒸镀，其他地方则不能；(4)红外激光精确定位打孔粘性膜技术是利用红外激光在厚度为30 50 μ m的聚乙烯酰亚胺膜(Kapton膜)上精确的留下所需半径Q50 1000 μ m或是10 500 μ m)的小孔，并将其粘在基底上，将0. 1 1 μ L的聚合物溶液滴在小孔内，待溶剂蒸发后，将聚乙烯酰亚胺粘性膜揭去，形成均勻的疏水聚合物图层阵列。步骤C中疏水层的构筑主要有以下两种方法第一种方法是利用含氟的硅烷化试剂(十七氟癸基三甲氧基硅烷、十三氟辛基三甲氧基硅烷等)在步骤B所形成的挡层以外的亲水化基底表面上进行单层膜组装生长，具体制备方法如下将具有聚合物挡层的基底表面(亲水化处理过)贴在干净的上表面皿，用移液枪吸取1 5μ L的含氟的硅烷化试剂滴于下表面皿，扣上上表面皿，在100 250°C下加热生长1 5个小时，从而在基底上得到疏水层；第二种是利用遮挡板蒸镀技术在挡层以外的基底表面(亲水化处理过)上进行金属(金和银)的蒸镀，从而在基底上得到疏水层；本发明可以非常有效地一步实现样品的除盐和富集的效果，无需洗脱和额外的水洗步骤，也无需过量的基质溶液。本发明所采用的图案化表面具有不同的亲疏水区域，首先当多肽或蛋白溶液沉积在此表面上时，由于最外圈的疏水层的存在，会将样品溶液有效地局限在该疏水层形成的环形区域里，起到富集的作用。在溶剂蒸发的过程中，对于含盐样品，由于图案化表面的中央疏水区域对蛋白或多肽有很强的疏水相互作用，从而使无机盐等和样品会被分别地转移到两疏水区域中间的环形亲水区域和中央疏水区域，达到样品除盐净化的目的。本发明中由于样品在制备的基底上的沉积面积(约2mm2)小于传统的不锈钢靶板点样(约20mm2)的方法，所以样品与基质容易形成更加细小、均勻的共结晶，在激光的激发下就会有更多的样品分子被解析离子化，从而提高了 MALDI-TOF MS的灵敏度和重现性。利用本发明构筑的图案化表面，在MALDI-TOF MS检测中，信噪比、灵敏度及耐盐能力都有很显著的提高。我们研究发现，利用这种方法构筑的疏水-亲水-疏水区域结构的图案化表面，具有很强的样品富集及除盐能力。如图6所示，我们在传统的不锈钢靶板上测试血管紧张素III能够得到其最低检测限是IOfmol μ L—1，而在这种图案化表面上所测试得到的最低检测限是IOOattmol μ L—1，质谱检测的灵敏度提高了两个数量级。另外，如图7所示，即使样品里含有很高浓度的盐，例如氯化钠(IM)，碳酸氢铵(IOOmM)，或尿素(IM)，在图案化的表面上由于盐能够有效地被排除，因此仍然能检测到很好的质谱信号。而在传统的不锈钢靶板上由于盐会干扰到基质和样品的共结晶，所以检测不到样品信号。以上证实了这种疏水-亲水-疏水相间的环形图案化表面能有效地富集和除盐净化分析物样品，具有很大的实际应用价值。
图1 本发明所述疏水-亲水-疏水的环形图案化表面的构筑示意图；图2 含盐样品在图案化表面上一步除盐和富集方法流程示意图；图3 在高通量样品载板上滴加溶液的显微数码照片；图4 样品和盐在表面上选择性分离的扫描电镜照片及能谱图；图5 低浓度样品在不锈钢靶板上和图案化表面上测试的质谱图；图6 血管紧张素III在不锈钢靶板上和图案化表面上的最低检测限；图7 不同种类盐的存在下样品在不锈钢靶板上和图案化表面上测试的质谱图8 利用ZipTipC18纯化含有不同种类盐的样品的质谱图；图9 蛋白的酶解产物在不锈钢靶板上和图案化表面上测试的质谱图及所鉴定出的多肽的序列。图中标号1为聚合物涂层，2为基底(硅片、石英片、玻璃片等)，4为疏水含氟单分子层或金属层，12为分析物(蛋白或多肽)，13为无机盐或污染物，14为基质，15为含无机盐等污染物的样品，16为滴加的基质溶液；步骤3为以聚合物涂层为挡层在基底上进行疏水含氟单分子层或金属层修饰，步骤5为在有机溶剂中超声去除聚合物涂层，步骤6为在基底空白亲水区域的中央进行疏水层修饰，步骤7为在图案化表面滴加含盐生物样品，步骤8为含盐生物样品中溶剂的蒸发，步骤9为在样品表面滴加基质溶液，步骤10为基质溶液中溶剂的蒸发，步骤11为进行MALDI-TOF MS检测；图1所示是疏水-亲水-疏水区域结构的环形图案化表面的构筑示意图。首先， 在清洗后的基底上用毛细管滴涂方法滴加PMMA的二甲苯溶液O. 5 7. 5% ))，形成的PMMA斑点的半径约为250 1000 μ m ；再以该PMMA点为挡层，在基底上组装生长含氟的单分子层(步骤幻；然后在丙酮或氯仿等有机溶剂中超声去除PMMA点(步骤幻，再在基底中心形成的空白区域滴涂PMMA的二甲苯溶液(步骤6)，其半径为10 500 μ m。如图1所示，该含氟单分子层可以用金属(金或银等)代替；中间的PMMA疏水点可以用其他疏水材料(PS或光刻胶)代替。图2所示实施例1所述的含盐样品在图案化表面上一步除盐和富集方法流程示意图。利用图1所得的基底，将含有盐的样品溶液沉积在基底上(步骤7)，由于最外圈含氟疏水层的憎水性，样品溶液会局限沉积在面积较小的环形区域从而改善了样品在表面分散的均勻性；当溶剂蒸发时(步骤8)，样品中的盐由于其水溶性会被富集在中间环形的亲水的裸硅区域，而多肽或蛋白由于和中央疏水聚合物之间通过疏水-疏水相互作用被保留在中央的聚合物的表面上，实现了样品的一步富集和除盐。待溶剂挥发完全后，基质溶液被滴加在疏水聚合物的表面(步骤9)，原来少量遗留在中央的聚合物表面上的盐又会重新的溶解从而被基质带到聚合物的外围即中间亲水的裸硅区域达到二次除盐的目的。图3所示实施例6所述的样品溶液在高通量图案化表面上的显微数码照片。通过显微数码照片可以看出当把样品溶液滴加在基板上的时候，由于最外圈的含氟的单分子层具有很强的憎水性，使得样品溶液收缩沉积在一个小的区域里，这就可以控制样品沉积点的大小，也改善样品在整个表面分布的均勻性。图4所示实施例1所述的样品富集、除盐的扫描电镜及能谱图。A图是样品沉积在图案化表面的基板上，在空气中自然晾干后所得的扫面电镜图和外面结晶物质的能谱图。 通过扫描电镜图可以看出当溶剂蒸发完全后，样品中的盐被排除到中间亲水的区域，通过能谱分析可以确定是样品中排出来的盐。B图是当基质溶液加入到中央的聚合物表面并自然晾干后，在聚合物的表面上可以清楚地看见基质均勻的结晶，通过能谱分析证实是基质的结晶。图5所示实施例9所述的低浓度样品在不锈钢靶板上和图案化表面上测试所得的质谱图。A图和C图是多肽混合物(血管舒缓激肽-M1，血管紧张素II-M2和血管紧张素 III-M3)和溶菌酶蛋白在不锈钢靶板上所得的质谱图，可以看出样品的信号很弱甚至无法检测到信号。B图和D图是在图案化表面上所得的质谱图，可以看出样品的信号被显著地增强，并且信噪比有十分明显地提高。说明图案化表面具有很好的样品富集效果。本发明所示的方法能把质谱检测的灵敏度提高两个数量级。以血管紧张素III 的检测为例，如图6所示实施例10所述的在传统的不锈钢靶板上所得到的最低检测限是 IOfmol μ L—1，而在这种图案化表面上所得到的最低检测限是IOOattmol μ L—1。通过对比A 图(不锈钢靶板)和B图(图案化表面)上测试血管紧张素III所得的最低检测限，可以说明图案化的表面对样品的富集作用更有利于痕量样品的检测。图7所示实施例11所述的在不同种类盐的存在下样品在不锈钢靶板上和图案化表面上测试所得的质谱图。�。珻，E图分别表示含有氯化钠，碳酸氢铵或尿素的样品在不锈钢靶板上所得的质谱图，可以看出在不锈钢靶板上，质谱的信号被严重地抑制。这是因为当样品中含有很高浓度的盐，会严重影响基质与样品的结晶，降低质谱测试的性能。B，D，F 图分别表示在图案化表面上所得的质谱图，可以看出在图案化表面上能获得很好的质谱信号，主要是因为样品中的盐被有效排除。图8所示实施例12所述的利用ZipTipC18纯化含有不同种类盐的样品的质谱图。 通常质谱分析前对含盐的微量样品采用ZipTipC18对其进行脱盐。�。珺, C图分别表示含有氯化钠，碳酸氢铵或尿素的样品利用ZipTipCw脱盐后沉积在不锈钢靶板上所得的质谱图。 通过ZipTipC18与图案化表面两种技术(如图8和图7所示)的对比，可以看出图案化表面在除盐性能方面比ZipTipCw更胜一筹，主要是因为ZipTipC18操作步骤复杂和离线除盐会造成不可避免的样品损失。图9所示实施例13所述的蛋白的酶解产物在不锈钢靶板上和图案化表面上测试所得的质谱图。在蛋白质组学中，通常样品含量很低且含盐浓度比较高。以肌红蛋白酶解产物测试为例，A图是在不锈钢靶板上测试所得的质谱图，只有7个多肽能被检测出来，而 B图是在图案化表面测试所得的质谱图，能够检测出14个多肽。表1中的�。⒎直鸫碓诖巢恍飧职邪迳霞巴及富砻嫔辖胁馐裕�*代表的是所能鉴定出的多肽序列，可以看出在图案化表面上测试所得的整个序列的覆盖率要远远高于在不锈钢靶板上的。因此，可以将这种图案化表面的基板应用到蛋白质组学分析。表1 从肌红蛋白酶解产物中检测到的多肽序列
权利要求
1.一种对生物样品进行富集和除盐净化处理的方法，其步骤为1)在基底上构筑疏水-亲水-疏水区域的封闭图案化表面；a)选取基底，对基底进行清洁及亲水化处理；b)在基底上构筑厚度0.2 200 μ m、半径250 1000 μ m的聚合物涂层；c)以步骤B构筑的聚合物涂层为挡层，在挡层以外的基底上修饰含氟单分子层或蒸镀金属层作为疏水层，其厚度为20 200nm ；d)将步骤C得到的基底浸入有机溶剂中进行超声处理除去聚合物挡层，随后用水超声除去基底上残留的有机溶剂，从而在基底上形成半径250 1000 μ m的空白亲水区域；e)在步骤D得到的基底的空白亲水区域中央制备厚度0.2 200 μ m、半径10 500 μ m 的聚合物层或金属层，作为中央疏水区域，从而在基底上得到疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面。2)将1 5μL多肽或蛋白溶液滴在上述步骤制备的图案化表面上，在室温下自然晾干，从而得到干燥的样品点；3)将1 5yL、5 20mg/ml的基质溶液滴在上述干燥的样品点上，室温下自然晾干后，在图案化表面上形成样品和基质均勻的共结晶，从而实现对生物样品进行富集和除盐净化处理。
2.如权利要求1所述的一种对生物样品进行富集和除盐净化处理的方法，其特征在于作为聚合物涂层的聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯或光刻胶。
3.如权利要求1所述的一种对生物样品进行富集和除盐净化处理的方法，其特征在于含氟单分子层为十七氟癸基三甲氧基硅烷或十三氟辛基三甲氧基硅烷的单分子层。
4.如权利要求1所述的一种对生物样品进行富集和除盐净化处理的方法，其特征在于金属层为金或银层。
5.如权利要求1所述的一种对生物样品进行富集和除盐净化处理的方法，其特征在于半径10 500 μ m的聚合物层的聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯。
6.如权利要求1所述的一种对生物样品进行富集和除盐净化处理的方法，其特征在于基质溶液为芥子酸、2-氰基-4-羟基肉桂酸或2，5-二羟基苯甲酸的溶液，溶剂为乙腈和三氟乙酸水溶液等体积混合，三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的质量分数为0. 1%。
7.如权利要求1所述的一种对生物样品进行富集和除盐净化处理的方法，其特征在于基底为硅片、玻璃片或石英片。
全文摘要
本发明属于生化分析技术领域，具体涉及一种利用图案化表面对生物样品进行一步富集和除盐净化的处理方法，这种图案化表面可以被广泛地应用于生物样品的预处理及检测。其步骤为在基底上构筑疏水-亲水-疏水区域的封闭图案化表面；将多肽或蛋白溶液滴在上述步骤制备的图案化表面上，在室温下自然晾干，从而得到干燥的样品点；将基质溶液滴在上述干燥的样品点上，室温下自然晾干后，在图案化表面上形成样品和基质均匀的共结晶，从而实现对生物样品进行富集和除盐净化处理。利用本发明构筑的图案化表面，在MALDI-TOF MS检测中，信噪比、灵敏度及耐盐能力都有很显著的提高，具有很大的实际应用价值。
文档编号G01N1/40GK102519779SQ20111040116
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者吕男, 国新华, 曾周芳, 王燕东 申请人:吉林大学
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