专利名称：一种人肺腺癌蛋白质标志物Flotillin-1的应用方法
技术领域：
本发明涉及一种用作人肺腺癌标志物的质膜蛋白FlOtillin-I的应用方法。
背景技术：
肺癌是最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率已居恶性肿瘤之首，严重威胁人类健康。作为肺癌的一类，肺腺癌在各类肺癌中约占20…30%。近年来，人肺腺癌的发病率呈逐步上升，且病人的死亡率高，预后差。临床上，肺腺癌发病较隐匿，在早期一般没有明显的临床症状，大多数患者就诊时已发生癌细胞的侵袭或转移，且无有效判断肺腺癌癌变的标志物。因此，寻找肺腺癌的有效标志物，准确判断肺腺癌的临床分期和预后成为广大医学研究者的迫切任务。
发明内容
本发明中的Floti 11 in-Ι是脂筏的一种标记蛋白。人Floti 11 in_l基因(Genebank 登录号ID 10211)位于染色体6p21. 3区段，全长151Λ，由13个外显子和12个内含子组成。 flotillins 蛋白被认为是属于 SPFH(stomatins, prohibitins, flotillins, HflK/C)蛋白家族。人Flotillin-I蛋白由427个氨基酸组成，(蛋白质登录号075955，www. expasy. org)它在体内广泛表达，而且高度保守，这就提示着它可能在不同的组织和细胞内发挥着不同的作用，但其在肺腺癌中确切的功能不清楚。
发明内容
本发明的目的是提供一种人肺腺癌蛋白质标志物Flotillin-I的应用方法；为有效判断肺腺癌癌变进程提供科学依据。一种人肺腺癌蛋白质标志物Flotillin-I用于制备诊断、预测、检测或筛查人肺腺癌的制剂；特别是用于制备诊断、预测、检测或筛查人肺腺癌的试剂盒。一种人肺腺癌蛋白质标志物Flotillin-I还可以用于制备诊断、预测、检测或筛查人肺腺癌癌细胞扩散、肺腺癌淋巴结转移、肺腺癌临床分期、肺腺癌患者复发的制剂；特别是用于制备诊断、预测、检测或筛查人肺腺癌癌细胞扩散、肺腺癌淋巴结转移、肺腺癌临床分期、肺腺癌患者复发的试剂盒。本发明提供了一个用于区分人肺腺癌组织以及癌旁正常肺组织、无淋巴结转移肺腺癌组织和有淋巴结转移肺腺癌组织的质膜蛋白标志物Flotillin-Ι，利用该标志物制备判断人肺腺癌、肺腺癌扩散，肺腺癌淋巴结转移、临床分期、肺腺癌患者复发和预后的制剂。 本发明为有效判断人肺腺癌癌变进程提供科学依据。
图1是人肺腺癌组织质膜纯度鉴定图。其中I-A是质膜纯化后透射电镜图谱，I-B 是Wfestern blotting检测质膜纯化前后Na+/K+ATPase (质膜标志蛋白)和ftx)hibitin (细粒体标志蛋白)表达情况，I-C是质膜纯化前后Na+zTAIPase和ftOhibitin表达水平直方
3图。WTL表示总组织裂解液，PM表示纯化后的质膜。图2是两次iTRQA试剂标记，LC-MS/MS分析鉴定Flotillin-I的肽序列和定量比例图。图2-A是114和116试剂标记癌旁正常肺组织质膜蛋白，115和117试剂标记肺腺癌组织质膜蛋白，质谱鉴定Flotillin-I的肽序列(VTGEVLDILR，m/z = 680.4019，ζ = 2) 和比例图。图2-B是115和117试剂标记癌旁正常肺组织质膜蛋白，114和116试剂标记肺腺癌组织质膜蛋白，质谱鉴定Flotillin-I的肽序列LAEAEKOOSQLIMQAEAEAASVR，m/z = 845. 1227，ζ = 3)和定量比例图。这两个序列都Flotillin-I蛋白序列中的一段，两次质谱分析时分别检测得到的，通过质谱数据结合生物信息学鉴定均为Flotillin-1。图3是Wfestern blot检测Flotillin-Ι在人肺腺癌组织和癌旁正常肺组织中表达。图34是狗计吐11 blot检测Flotillin-I在肺腺癌组织和癌旁正常肺组织中表达，(N 表示人肺腺癌癌旁正常组织，T表示人肺腺癌组织；PNLT表示癌旁正常肺组织，AdC表示人肺腺癌组织；GAPDH蛋白作为组织内参；图3-B是Flotillin-I在人肺腺癌组织和癌旁正常肺组织中表达水平直方图。图4是免疫组化检测Flotillin-I在癌旁正常肺组织，无转移淋巴结肺腺癌组织和有淋巴结转移肺肺腺癌组织中表达。4-A是Flotillin-I在癌旁正常肺组织中免疫组化图，4-B是Flotillin-I在无转移淋巴结肺腺癌组织中免疫组化图，4-C是Flotillin-I在有淋巴结转移肺肺腺癌组织中免疫组化图。图5是Kaplan-Meier曲线分析Flotillin-1的表达与肺腺癌复发及患者生存的关系图。5-A是Flotillin-1的表达与肺腺癌复发Kaplan-Meier曲线分析图，5_B 是Flotillin-1的表达与肺腺癌患者生存Kaplan-Meier曲线分析图。Relapse-free Probability表示无复发率，Overall Survival表示) 、体生存率。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作详细说明，而不会限制本发明。实施例1质膜纯化人肺(腺癌)组织在组织勻浆器勻碎，纱布过滤，余下粗的组织加HEPS 液在液氮中研磨，再过滤，合并滤液3200g离心10分钟，去沉淀，IOOOOOg离心1小时，取沉淀为粗质膜。粗质膜再用HEPS悬�。偌�6. 4% Detran/PEG体系混勻750g离心10分钟， 取上层，下层继续用新的6. 4% Detran/PEG体系混勻750g离心10分钟。合并两次上层，在 ImM NaHCO3溶液中100000离心1小时，收集沉淀，分别用电镜和Wiesterb blot进行质膜纯度鉴定。图I-A是质膜纯化后透射电镜图谱显示本方法提取的质膜没有发现细粒体等其他细胞器的污染；图I-B和图I-C说明质膜纯化后质膜标志蛋白Na+zTATPase的表达比全细胞裂解液富集了 12倍，而细粒体的标志蛋白ftOhibitin的表达比全细胞裂解液减少了 10 倍。由此说明这种纯化人肺(腺癌)组织质膜的方法有效，且纯化的质膜纯度较高。实施例2iTRQA标记与质谱分析本方法对两组样品进行了两次不同的iTRQA标记和质谱分析。第一次标记，质膜蛋白质精确定量后，等量蛋白质经胰酶酶解后分别用114和116试剂标记癌旁正常肺组织质膜酶解肽段，而115和117试剂标记肺腺癌组织质膜酶解肽段，在 Qstar XL液质联用仪上进行LC-MS/MS质谱分析。图2-A和图2-B是Flotillin-1前后两次标记的质谱图，从图中可以得到Flotillin-I在肺腺癌组织中表达升高。同时两次质谱数据处理分析结果(见表1)亦发现Flotillin-I在肺腺癌组织中表达升高。表1. iTRQA标记分析Flotillin-I在肺腺癌和癌旁正常组织中的差异表达
蛋白质肿瘤/正常
登陆号虫白质名(第一次)
114 115
075955 Flotillin-I 2.2802实施例3蛋白质印迹验证为验证Flotillin-I在人肺腺癌和癌旁正常组织中的差异，我们采用Western blot检测了 Flotillin-I在18对肺腺癌和配对癌旁正常组织中表达水平。操作流程如下1)收集18对人肺腺癌和配对癌旁正常肺组织样本。2)蛋白质抽提先在液氮中将肺腺癌组织和正常肺肺组织研磨，分别加入难溶组织裂解液(0. 375mol/L Tris-HCl pH 8. 8,1% SDS, 50m mmol/L DTT,25% Glycerol, ImM PMSF, 25 μ g/mL Aprotinin, 25 μ g/mL Leup印tin)，冰上裂解 lh, 12000rpm、4°C离心 30min 后取上清即为组织细胞总蛋白，Bradford方法测定蛋白浓度。3) SDS-PAGE电泳50 μ g总蛋白进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离， 蛋白电转移至硝酸纤维膜(PVDF)上。4)印迹膜用5%脱脂牛奶室温封闭池或4°C封闭过夜。5)印迹膜与Flotillin-I特异性的抗体l(abcam公司购买，ab50671)(浓度 0. 55 μ g/mL)室温孵育池或4°C孵育过夜，然后TBS-T缓冲液洗膜3次，每次lOmin。6)将膜与HR标记的第二抗体(兔抗IgG)室温孵育lh，TBS-T缓冲液洗膜3次， 每次IOmin。7)ECL试剂发光、显影和定影。以GAPDH为内参照。实验重复三次图3是5对典型的肺腺癌组织和配对癌旁正常肺组织Flotillin-I的表达情况。 3图结果显示Flotillin-I在肺腺癌组织中表达升高。实施例4免疫组织化学分析Flotillin-I在肺腺癌组织中表达的临床意义我们以Flotillin-I特异性抗体2 (abeam公司购买，ab41927)联合迈新S-P免疫组化试剂盒(福建迈新公司)组成我们的诊断试剂盒，免疫组织化学染色按简要步骤如下1)石蜡组织芯片切片用100% 二甲苯脱蜡2次，每次20-40min，至完全脱蜡干净；2)用100%、95%、90%、75%梯度酒精水化后，用PBS液(PH6. 0)冲洗3次，每次 3min ；3)抗原修复将处理好的切片置于切片架，放入含有IOOOml枸橼酸盐缓冲液的烧杯中，电炉直接加热至沸腾，用小火继续煮沸15min ；
肿瘤/正常肿瘤/正常 (第一次)(第二次)
116 117115 114
2.29872.2902
肿瘤/正常
,笛一、於、平均值
(第一次) 117 116
2.2564 2.2814±0.0183
4)将烧杯离开火源，自然冷却至室温，双蒸水冲洗两次，PBS液冲洗两次；5)每张切片加一滴过氧化物酶阻断溶液(迈新试剂盒试剂A)，室温下孵育lOmin。 PBS冲洗三次，每次;3min ；6)除去PBS液，加一滴正常非免疫动物血清(迈新试剂盒试剂B)，室温下孵育 IOmin ；7)除去血清，分别加入Flotillin-I特异性抗体2 (abeam公司购买，ab41927) (12yg/mL)4°C过夜。用PBS代替一抗为阴性对照；8) PBS冲洗三次，每次:3min。除去PBS液，每张切片加一滴生物标记的二抗(迈新试剂盒试剂C)，室温下孵育lOmin。PBS冲洗三次，每次^iin ；9)除去PBS液，每张切片加一滴链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液(迈新试剂盒试剂D)，室温下孵育lOmin。PBS冲洗三次，每次^iin ；10)除去PBS液，每张切片加二滴新鲜配置的DAB溶液，显微镜下观察3-lOmin ；11)自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝；12)梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。我们对存档的石蜡包埋的组织标本包括42例癌旁正常肺组织、46例无淋巴结转移肺腺癌组织以及62例有淋巴结转移肺腺癌组织用免疫组织化学染色分析。染色评分标准如下随机选取至少10个高倍镜视野(X 200)，至少计数1000个细胞数，以积分法计算结果。即根据每张切片的染色强度和阳性细胞比率进行联合计分。着色强度无色O分；浅黄色1分；棕黄色2分；棕色3分。着色细胞比率无着色分；< 30%为1分；30% 60% 为2分；> 60%为3分。着色强度和着色细胞比率的两种评分相加，O 2分者为低表达， 3 4分者为中等表达，5 6分者为高表达。数据统计分采用SPSS13.0软件进行。结果如下1 免疫组织化学分析Flotillin-I在癌旁正常肺组织、无淋巴结转移肺腺癌组织和有淋巴结转移肺腺癌组织的表达。图4-A是Flotillin-I在癌旁正常肺组织表达的典型图片，为低表达(阴性)；4-B是Flotillin-I在无淋巴结转移肺腺癌组织中表达的典型图片，为中度表达；4-C是Flotillin-I在有淋巴结转移肺腺癌组织中表达的典型图片，为高表达(强阳性)。表1结果显示Flotillin-I在癌旁正常肺组织、无淋巴结转移肺腺癌组织和有淋巴结转移肺腺癌组织的表达两两之间存在具有统计学意义(P < 0. 05)上差异。 Flotillin-I在癌旁正常肺组织中表达大部分呈低表达(阴性率88% )，而Flotillin-I在肺腺癌组织组织中大部分阳性表达(阳性率67% )，并且Flotillin-I在有淋巴结转移肺腺癌组织中比无淋巴结转移肺腺癌组织中表达的明显要高，存在显著性差异(P < 0. 05)。表2 =Flotillin-I癌旁正常肺组织，无淋巴结转移肺腺癌以及有淋巴结转移肺腺癌组织中表达差异例数得分
低中高P
Flotillin-I
癌旁正常组织 4237320.000*a
无淋巴结转移 462320
肺腺癌组织
有淋巴结转移 62131633
肺腺癌组织a表示癌旁正常组织和无淋巴结转移肺腺癌组织两者之间的统计学比较，b表示无淋巴结转移肺腺癌组织和有淋巴结转移肺腺癌组织两者之间的统计学比 较；*p < 0. 05。2 =Flotillin-I在肺腺癌组织中表达水平与肺腺癌临床病理因素的关系利用单因素方差(Kruskal-ffallis test)分析Flotillin-1在肺腺癌组织中 表达水平与肺腺癌患者的临床病理因素变量包括年龄(age)、性别(gender)、肿瘤分化 (Differentiation)、肿瘤大小(pT stage)、淋巴结转移状态(pN stage)以及临床分期 (Clinical stage)之间的关系。统计结果发现(见表3) =Flotillin-I在肺腺癌组织中表 达与淋巴结转移和临床分期有关(P < 0. 05)，Flotillin-I高表达的肺腺癌病人更容易发 生淋巴结转移，具有较晚的临床分期。而Flotillin-I在肺腺癌组织中表达与年龄、性别、 肿瘤分化以及肿瘤大小均无显著相关性。表3. Flotillin-I在肺腺癌中的表达与临床病理特征的关系
Flotillin-I
例数 低(0-2) 中(3-4)高(5-6)ρ
年龄0.763
<5020758
>5088293128
性别0.637
男60172419
女48191217
分化0.837
好225107
φ23689
差63251820临床分期I其月42299II 期24418III-IV 期4239*p<0.05
3 =Flotillin-I表达水平与肺腺癌病人复发的关系
采用Kaplan-Meier法与回归分析Flotillin-Ι表达水平与肺腺癌病人复发的关系，Kaplan-Meier曲线分析结果显示，随着肺腺癌组织中Flotillin-I表达水平增加，其无复发率(Relapse-free probability)明显降低(见图5-A)，即复发率明显升高。单变量 Cox回归分析结果显示(见表4左栏)与肺腺癌复发有关的因素有肺腺癌淋巴结转移，临床分期和Flotillin-I的表达水平(ρ <0.05)；多变量回归分析结果显示(见表5左栏) 淋巴结转移，临床分期和Flotillin-I的高表达是肺腺癌复发的危险因子(ρ < 0. 05)。
表4 单变量分析肺腺癌病人复发和预后的相关因子
权利要求
1.一种人肺腺癌蛋白质标志物FlOtillin-I的应用方法，其特征在于，所述的标志物用于制备诊断、预测、检测或筛查人肺腺癌的制剂。
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的标志物用于制备诊断、预测、 检测或筛查人肺腺癌的试剂盒。
3.一种人肺腺癌蛋白质标志物Flotillin-I的应用方法，其特征在于，所述的标志物用于制备诊断、预测、检测或筛查人肺腺癌癌细胞扩散、肺腺癌淋巴结转移、肺腺癌临床分期、肺腺癌患者复发的制剂。
4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，所述的标志物用于制备诊断、预测、 检测或筛查人肺腺癌癌细胞扩散、肺腺癌淋巴结转移、肺腺癌临床分期、肺腺癌患者复发的试齐U盒。
全文摘要
本发明提供了一种人肺腺癌蛋白质标志物Flotillin-1的应用方法，用于制备诊断、预测、检测或筛查肺腺癌的制剂；还可以用于制备诊断、预测、检测或筛查肺腺癌癌细胞扩散、肺腺癌淋巴结转移、肺腺癌临床分期、肺腺癌患者复发的制剂。本发明为有效判断肺腺癌癌变进程提供科学依据。
文档编号G01N33/574GK102539758SQ20111044069
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者张鹏飞, 彭芳, 易红, 李茂玉, 李萃, 肖志强, 陈主初 申请人:中南大学
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