专利名称：紫草宁及其衍生物或修饰物的脂质体的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于制药工程及生物技术领域，具体涉及紫草宁(Shikonin)脂质 体的制备及其抗新血管生成的作用；另外还涉及紫草宁包囊在脂质体中，在绿色荧光激发 下可以观察到明亮的红色荧光现象，故可以在测定包封率、体外细胞定位、入胞机制、体内 药物跟踪等方面具有重要的应用价值。
背景技术：
紫草宁是从中药材紫草根部分离出来的有效成分，在古代主要用来治疗斑疹、麻 疹、痈病、烧伤等疾病(Huang et al. , 2002)。现代研究表明，它具有多种药理活性，如抗 炎、抗氧化、抗性腺激素、抗菌、抗新血管生成、抗HIV、抗细胞增值、促进凋亡等活性。其中，抗新血管生成在治疗肿瘤患者方面已经逐渐成为热点，并且获得了一些可 喜的研究进展，故这方面的研究也越来越引起研究人员的关注。血管新生是在已成熟血管 的基础上形成侧枝，建立新的血管联系和网络，它包括新侧枝萌发点的诱导，血管内皮细胞 的迁移，细胞增殖，融合连接等过程(Tang et al.)。另外，还包括血管内皮亚结构的变化， 如基底膜的破坏，失去细胞之间以及细胞和基底膜之间的相互作用等，接着在新血管形成 物质的刺激下，细胞之间以及细胞和基底膜之间在细胞形状上和血管结构上都发生迅速的 改变，包括粘附力、临界响应、运动性和骨架识别等方面(mi et al., 2008)。故血管新生在 伤口的愈合、胚胎发育、炎症(Hashizume et al. , 2009)、肿瘤的发生和转移都起着举足轻 重的作用。血管新生和肿瘤的发生、发展有着密不可分的关系，因为肿瘤的生长非常旺盛，在 这个过程中需要大量的氧气和营养物质供应，这时就需要营造一个能提供此条件的外部环 境。而新生的血管恰恰可以充分满足肿瘤生长的各种需求。因此，为了有效的抑制肿瘤的 生长和转移，采用抑制新生血管的生成或者联合其他的抗肿瘤药物应该是个有效的治疗方案。紫草宁具有抑制血管新生的药理作用，有资料报道它对多种肿瘤具有抑制作用， 包括结肠癌细胞(Calonghi et al.，2007)、人 SK-H印_1 肝癌细胞(Chen et al.，2003)、 人乳腺癌细胞(Hou et al. , 2006)、人直肠癌细胞(Hsu et al.，2004)、人DMS114肺癌细 胞(Kajimoto et al.，2008)、人口腔扁平细胞瘤 \^_8113 (Ruan et al.，2008)。但是， 由于紫草宁较低的溶解性和较强的细胞毒性，目前还没有应用于临床。
发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种紫草宁脂质体制备的处方和工艺，并明确其在 抗心血管形成方面的作用；还发现其在脂质体系中存在自生红色荧光现象，可用于测定包 封率、体外细胞定位、入胞机制、体内药物跟踪等方面。(1)本发明的技术方案为
称取1 IOmg紫草宁、IOOmg大豆磷脂、20mg胆固醇，加入10 20ml的无水乙醇后，充分搅拌让药物充分溶解，吸取混合液，缓缓加入到预先加热到60°C 70°C的磷酸缓冲液 (10 20ml)中，让整个系统充分搅拌直至溶液中的乙醇挥发干净。用显微镜(Olympus， Japan)观察紫草宁脂质体的形态。抗血管形成试验选用采用人脐静脉内皮细胞株(HUVEC) (ATCC，美国)，对其增殖作用的抑制(MTT)和对其迁移作用的抑制(Transwel 1)进行研究。自生荧光现象采用荧光显微镜或共聚焦显微镜，在绿色荧光的激发下观察，可以 看到明亮的红色荧光现象。利用其荧光现象可以直接目测得到药物紫草宁的大概包封率， 用流式技术通过测定脂质体球中荧光，可以准确得出包封率。紫草宁脂质体作用于HUVEC 一段时间后，用共聚焦显微镜可以进行细胞的荧光定位。( 2 )本发明与现有技术相比，其有益效果是
本发明将紫草宁制备成脂质体，将药物包囊在脂质体中。实验证明它可有效的提高药 物的溶解性、降低药物的细胞毒性。同时，在荧光显微镜或者共聚焦显微镜下，利用绿色荧 光的激发可以看到明亮的红色荧光，这在以前没有任何文章和专利报道。紫草宁所具有这 种神奇的红色荧光现象在药剂、药理方面有较大的应用前景，可以测定药物在脂质体中的 包封率，研究体外细胞定位、药物及药物制剂入胞机制、体内代谢途径跟踪等。
图1紫草宁脂质体的形态(A为空白脂质体；B为包囊药物的脂质体；C为示意 图)。图2在荧光显微镜绿色荧光的激发下，观察到的红色荧光(A为空白脂质体；B为 包囊药物的脂质体)。图3流式细胞仪测定荧光量的结果(A为空白对照；B D为三批不同包封率的样 品；E为A、B、C、D的叠加图)。图4抑制HUVEC细胞增殖(MTT)的结果。图5抑制HUVEC细胞迁移(Transwell)的结果。图6用激光共聚焦显微镜观察紫草宁脂质体和HUVEC细胞共培养后的细胞荧光 定位(AfDl空白脂质体对照；A2 D2为紫草宁脂质体。A为波长为405nm通道，核蓝色；B 为波长为488nm通道，膜绿色；C为波长为M3nm通道，紫草宁脂质体红色；D为A、B、C的叠 加)。
具体实施例方式实施例1紫草宁脂质体的制备处方工艺
工艺按上述处方称取紫草宁、大豆磷脂、胆固醇，加入10 20ml的无水乙醇后，充 分搅拌让药物充分溶解，吸取混合液，缓缓加入到预先加热到60°C 70°C的磷酸缓冲液 (10 20ml)中，让整个系统充分搅拌直至溶液中的乙醇挥发干净。
空白脂质体的制备处方和工艺除了不加药物紫草宁，其它过程同上操作。
处方
紫草宁(纯度99. 8%)
大豆磷脂
胆固醇
。IOmg IOOmg 20mg
其中，处方中紫草宁可以用其衍生物及修饰物；大豆磷脂可以用卵磷脂、二棕榈酰 磷脂酰胆碱(DPPP)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)等代替。 工艺也可用薄膜分散法、超声波分散法等，制备成单室脂质体。用显微镜(Olympus，Japan)观察紫草宁脂质体的形态(图1，400X )，具有脂质体 双层膜的圆球型颗粒。粒径大小在0. 3微米 3微米，空白脂质体的平均粒径略小些，包囊 药物的脂质体的平均粒径稍大些。另外添加一些表面活性剂，或经多次压挤乳化，或者通过0. 20微米的膜，可以得 到粒径小于200纳米的紫草宁纳米脂质体。 在脂质体表面可以进一步修饰各种靶向于肿瘤细胞的物质包括血管内皮生长因 子(VEGF)、血小板来源生长因子(PDGR)、叶酸等。实施例2紫草宁包囊在脂质体中产生的红色荧光现象
用荧光显微镜(Olympus，Japan)绿色荧光激发的模式下观察紫草宁脂质体时，可以看 到明亮的红色荧光(图2，200 X )，这是药物在这种脂质体系所表现出来的神奇现象，表明药 物已经包囊在脂质体中，可以粗略地估计出大致的药物包封率，紫草宁在脂质体系中所具 有的红色荧光现象是首次发现、首次报道。实施例3用流式细胞仪测定紫草宁脂质体的包封率
因为紫草宁脂质体所特有的红色荧光，可以用流式细胞仪准确地测定出药物的包封 率。将空白脂质体和三批不同包封率的紫草宁脂质体样品通过流式细胞测定仪(Becton Dickinson，美国)，读取10，000个脂质体颗粒，结果经WinMDI 2. 9分析软件处理，得出包囊 了紫草宁的红色荧光脂质体所占百分数分别为3. 75%、51. 7%、81. 15%和96. 81%，实际上测 得的也就是包封率(图3)。因为只有包含有药物的脂质体才能被检测到红色荧光。实施例4紫草宁脂质体对HUVEC细胞增殖的抑制作用(MTT)
HUVEC细胞(ATCC，美国)的培养用含10% (ν/ν)胎牛血清、100Units/mL青霉素、 100 μ g/mL链霉素的DMEM培养基，在37°C、5%0)2的二氧化碳培养箱中进行培养。一般来说， 传代3 8代的细胞用于试验研究。HUVEC以密度为1 X IO4个/孔接种到96孔板中，放置在37°C、5%0)2的二氧化碳 培养箱中让之贴壁过夜，加入紫草宁原料药和低包封率、高包封率紫草宁脂质体让之作用 M小时(每个浓度平行测定4孔)，然后每孔加入20 μ L MTT (5 mg/mL)继续孵育4小时， 移去培养基后加入200 μ L DMS0，振荡，以570nm为测定波长，450nm为参比波长，用酶标仪 (TECAN,瑞士)测定吸收度OD值，按照下面公示计算细胞抑制率，在此基础上再计算出IC5Q。细胞抑制率=
结果，紫草宁原料药和两批紫草宁脂质体的IC5tl分别是4. 48士0. 49 μ Μ, 5.81 士 0.56μΜ(低包封率)和7. 16 士 0.69μΜ(高包封率)(图4)。IC5tl越大，说明对细胞 的毒性越�。环粗得鞫韵赴亩拘栽酱�。而且，包封率越高，对HUVEC细胞的毒性越小。 故从试验结果来分析，脂质体可以有效地降低药物紫草宁的细胞毒性。这种新颖的剂型使 得紫草宁将来应用于临床成为可能。
实施例5紫草宁脂质体对HUVEC细胞迁移的抑制作用(Transwell)
HUVEC细胞培养同实施例4。HUVEC细胞迁移试验采用Transwell板( 孔板)，带有底 部贴有孔径为8. 0微米的聚碳酸酯膜(Corning，3422)的插件。在M孔中加入600 μ L含有10%胎牛血清的DMEM培养基，以及紫草宁原料药和低 包封率、高包封率紫草宁脂质体(3. 15 μ Μ)。轻轻放入插件到M孔板，防止气泡出现。将经 胰酶消化的HUVEC悬液(200 μ L，密度为5 X IO5个/mL)接种到插件中，再加入和下层M孔 中相同浓度的紫草宁或紫草宁脂质体。整个装置移到37°C、5%0)2的二氧化碳培养箱中继 续培养8小时。到规定的时间，取出插件。用棉花棒擦去膜上面未迁移的HUVEC后，4%甲醛 固定30分钟，0. 1%的结晶紫染20分钟，PBS洗涤两次，用显微镜观察并且计数(至少记录6 个视野)。如果迁移到膜下面的HUVEC细胞过多，以至于无法准确计数时，可以用33%的乙 酸溶解结晶紫，在酶标仪上测定OD值(以570nm为测定波长，450nm为参比波长)。用下面的 公式计算抑制迁移百分率。抑制迁移率=[1 - (A紫草宁或脂质体-A空白)/(A对照-A空白)]X100%
结果，紫草宁原料药和两批紫草宁脂质体对HUVEC细胞迁移抑制率分别是 47. 24士8. 68%，32. 22士3. 72% (低包封率)和21. 19士3. 50% (高包封率)(图5)。抑制迁移 率越高，说明细胞毒性越大；反之，说明细胞毒性越小。结果充分表明脂质体能明显降低细 胞的毒害性，结果和实施例4的MTT结果是一致的。实施例6紫草宁脂质体在HUVEC细胞上的荧光定位 HUVEC细胞培养同实施例4。取6孔细胞培养板，放入已洗净灭菌的盖玻片，加入胰酶消化的HUVEC细胞悬液， 以密度为IXio5个/ml接种到6孔板中，每孔1 anl，放置于37°C、5%0)2的二氧化碳培 养箱中培养过夜，让之充分贴壁。加入DiO和DAPI分别染HUVEC的细胞膜和细胞核。加入 不同浓度的紫草宁脂质体(2，4，6，8 μ M)，同时以不加药的空白脂质体为对照。放入二氧 化碳培养箱中继续培养不同的时间。到规定的时间除去培养基，磷酸缓冲液洗涤两次除去 药物和死细胞后，每孔加入4%甲醛固定30分钟，再用磷酸缓冲液洗涤两次。盖玻片移至载 玻片上，用激光共聚焦显微镜(Olympus FV1000, Japan)观察(图6)。利用其红色荧光对 HUVEC细胞及其它肿瘤细胞作用过程进行荧光定位。
权利要求
1.一种紫草宁及其衍生物或修饰物的脂质体，其特征是由紫草宁或其衍生物或其修饰 物1 10mg、大豆磷脂IOOmg或卵磷脂IOOmg或二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPPlOOmg或二棕榈 酰磷脂酰乙醇胺DPPElOOmg或二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPClOOmg、胆固醇20mg构成。
2.根据权利要求1所述紫草宁及其衍生物或修饰物的脂质体的制备方法，其特征是 按上述处方称取紫草宁或其衍生物或其修饰物、大豆磷脂或卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱 DPPP或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE或二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、胆固醇，加入10 20ml 的无水乙醇后，充分搅拌让药物充分溶解，吸取混合液，缓缓加入到预先加热到60°C 70°C的适量磷酸缓冲液中，让整个系统充分搅拌直至溶液中的乙醇挥发干净。
3.根据权利要求2所述紫草宁及其衍生物或修饰物的脂质体的制备方法，其特征是可 用薄膜分散法、超声波分散法制备成单室脂质体。
4.权利要求1所述紫草宁及其衍生物或修饰物的脂质体在制备抑制新血管生成药物 中的应用。
5.权利要求1所述紫草宁脂质体在测定药物包封率或细胞定位或入胞机制或体内药 物跟踪中的应用。
全文摘要
本发明属于制药工程及生物技术领域，具体涉及一种紫草宁脂质体制备的处方工艺及其抗新血管生成的作用。抗血管形成试验选用人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)，对其增殖作用的抑制(MTT)、对其迁移作用的抑制(Transwell)进行了测定。另外还涉及紫草宁包囊在脂质体中，在绿色荧光激发下可以观察到明亮的红色荧光现象，在测定包封率、体外细胞定位、入胞机制、体内药物跟踪等方面具有重要的应用价值。紫草宁脂质体作用于HUVEC或其他肿瘤细胞一段时间后，可用共聚焦显微镜进行细胞的荧光定位。
文档编号G01N21/64GK102091037SQ20111000451
公开日2011年6月15日 申请日期2011年1月11日 优先权日2011年1月11日
发明者刘洪昌, 夏红梅, 孔文尧, 张靖靖, 戚金亮, 杨永华, 杨荣武, 浩日沁巴图, 王小明 申请人:南京大学
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